Виділена нуклеїнова кислота, що кодує рецептор ctla-4 кішки, та вакцина для модулювання імунної відповіді в кішки

1. Виділена нуклеїнова кислота, що кодує рецептор CTLA-4 кішки або розчинний рецептор CTLA-4 кішки, причому рецептор CTLA-4 кішки або розчинний рецептор CTLA-4 кішки кодуються нуклеотидною послідовністю SEQ ID NO: 9. 2. Нуклеїнова кислота за п.1, де рецептор CTLA-4 кішки містить амінокислотну послідовність SEQ ID NO: 10. 3. Нуклеїнова кислота за п.1, де нуклеїнова кислота є ДНК або РНК. 4. Нуклеїнова кислота за п.3, де ДНК є кДНК або геномною ДНК. 5. Діагностичний олігонуклеотид, що містить послідовність щонайменше з 12 нуклеотидів, комплементарну послідовності, що унікально присутня у нуклеотидній послідовності SEQ ID NО: 9 нуклеїнової кислоти за п.1. 6. Олігонуклеотид за п.5, що складається щонайменше з 15 або 16 нуклеотидів. 7. Олігонуклеотид за п.5 або 6, де олігонуклеотид позначений міткою, що виявляється. 8. Олігонуклеотид за п.7, де мітка, що виявляється, містить радіоактивний ізотоп, флуорофор або біотин. 9. Олігонуклеотид за п.5 або 6, де олігонуклеотид вибірково метильований. 10. Клонуючий вектор, що містить нуклеїнову кислоту за п.1. 11. Вектор за п.10, позначений CTLA-4# 1/091997 (депозитарний № АТСС 209820). 12. Вектор за п.10 або 11, що містить промотор, функціонально приєднаний до нуклеїнової кислоти. UA (21) a200603428 (22) 30.04.1999 (24) 27.07.2009 (31) 09/071,699 (32) 01.05.1998 (33) US (62) 2000116864, 30.04.1999 (46) 27.07.2009, Бюл.№ 14, 2009 р. (72) КОЛЛІСОН ЕЛЛЕН В., US, ХЕШ СТЕФЕН М., US, ЧОЙ ІН-СОО, US (73) ДЗЕ ТЕКСАС ЕЙ ЕНД ЕМ ЮНІВЕРСІТІ СІСТЕМ, US (56) WO 95/05464, 23.02.1995. US A 5714667, 03.02.1998. CA A1 2580812, 07.01.1993. CA A1 2110518, 07.01.1993. Matthew F. Krummel and James P. Allison “CD28 and CTLA-4 have opposing effects on the response of T cells to stimulation”, J. Exp. Med. Volume 182, August 1995, p. 459-465. Koichi OHNO et al.: ”Cloning of feline cDNA encoding the cytotoxic T lymphocyte-associated antigen 4 (CTLA-4)”, J. Vet. Med. Sci. 61(11): 1241-1244, 1999. Pan Zheng et al.: ” B7-CTLA4 interaction enhances both production of antitumor cytotoxic T lymphocytes and resistance to tumor challenge”, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol. 95, May 1998, pp. 6284-6289. Peter S. Linsley et al.:”Binding stoichiometry of the cytotoxic T lymphocyte-associated molecule-4 (CTLA4)”, The Journal of Biological Chemistry, Vol. 270, No. 25, Issue of June 23, 1995, pp. 15417-15424. Helios T. Leung et al.:” Cytotoxic T lymphocyteassociated molecule-4, a high avidity receptor for CD80 and CD86, contains an intracellular localization motif in its cytoplasmic tail”, The Journal of Biological Chemistry, Vol. 270, No. 42, Issue of October 20, 1995, pp.25107-25114. Peter S. Linsley “Distinct roles for CD28 and cytotoxic T lymphocyte-associated molecule-4 receptors during T cell activation”, J. Exp. Med., Vol. 182, August, 1995, pp. 289-292. 2 (19) 1 3 87470 4 13. Вакцина для модулювання імунної відповіді в кішки, що містить ефективну кількість поліпептиду, який кодується нуклеїновою кислотою за п.1, і прийнятний носій. 14. Вакцина за п.13, де ефективною кількістю є кількість приблизно від 0,01мг приблизно до 100мг на одну дозу. 15. Вакцина за п.13, де ефективною кількістю є кількість приблизно від 0,25мг/кг маси тіла кішки на добу приблизно до 25мг/кг маси тіла кішки на добу. 16. Вакцина за будь-яким з пп.13-15, що додатково містить імуноген, похідний від патогену. 17. Вакцина за п.16, де патоген є патогеном кішки, вірусом сказу, хламідією, Toxoplasma gondii, Dirofilaria immitis, патогеном блохи або бактеріальним патогеном. 18. Вакцина за п.17, де патогеном кішки є вірус імунодефіциту котячих (FIV), вірус лейкозу котячих (FeLV), вірус інфекційного перитоніту котячих (FIP), вірус панлейкопенії котячих, каліцивірус котячих, реовірус 3-го типу котячих, коронавірус ко тячих, респіраторно-синцитіальний вірус котячих, вірус саркоми котячих, герпесвірус котячих, вірус хвороби Борна кішок або паразит кішок. 19. Спосіб індукції імунітету в кішки, що передбачає введення кішці вакцини за будь-яким з пп.1318. 20. Спосіб підсилення імунної відповіді в кішки, що передбачає введення кішці вакцини за будь-яким з пп.13-18. 21. Спосіб за п.19 або 20, де вакцину вводять підшкірно, внутрішньом'язово, системно, місцеве або перорально. 22. Спосіб придушення імунної відповіді в кішки, що передбачає введення кішці ефективно придушуючої імунну відповідь кількості поліпептиду, який кодується нуклеїновою кислотою за п.1. 23. Спосіб за п.22, де вказана кількість складає приблизно від 0,25 мг/кг маси тіла на добу приблизно до 25 мг/кг маси тіла на добу. 24. Спосіб за п.22, де кішка страждає аутоімунним захворюванням або є реципієнтом тканинного або органового трансплантата. Дана заявка має пріоритет за патентною заявкою США N8 09/071699, поданою 1 травня 1998 р., повний зміст якої включений в дану заявку як посилання. У тексті даної заявки посилання на інші публікації приведені в дужках. Повну бібліографію для цих посилань можна знайти в кінці тексту безпосередньо перед списком послідовностей. Вміст цих публікацій в повному об'ємі включений в дану заявку як посилання з метою більш повного опису стану проблеми в тій області техніки, якої стосується даний винахід. Нині відсутні ефективні вакцини для профілактики імунодефіциту сімейства котячих і інфекційного перитоніту котячих у домашніх кішок. Зараз доступні вакцини проти вірусу лейкозу котячих, однак їх ефективність залишається сумнівною, а в ряді випадків вони можуть спричиняти захворювання. Отже, в даній області техніки є потреба в агентах і композиціях, які б захищали від цих і інших захворювань, проти яких поки що немає вакцин або вже існуючі і вакцини, що звичайно застосовуються проти цих захворювань, потрібно поліпшити. Крім того, утруднена вакцинація кошенят через неможливість протистояти материнським антитілам у них. Значить, також є необхідність в безпечних і ефективних агентах для подолання таких бар'єрів. Стимуляція в організмі активації і проліферації Т-лімфоцитів у відповідь на захворювання, як вважається, визначається двома взаємодіями: розпізнаванням Т-клітинного рецептора (TCR) імуногенними пептидами з участю молекул класу І головного комплексу гістосумісності (МНС) і повторна взаємодія допоміжних лігандів, таких як CD80 і CD86, з відповідними їм рецепторами CD28 і (або) CTLA-4 - на поверхні Т-лімфоциту. Ефективна взаємодія цих двох механізмів зумовлює активацію і проліферацію і СВ4-позитивних, і СВ8-позитивних Т-клітин і збільшення вироблення імунорегуляторних цитокінів типів Th1 і Th2. У відсутність адекватної костимуляції Т-клітин може розвиватися анергічний стан, при якому Т-клітини не здатні проліферувати і виділяти цитокіни. Протягом багатьох років ключовими регулювальниками Т-клітинних відповідей вважалися дві молекули - рецептор CD28 і його ліганди CD80 і CD86. CD28 є первинним Т-клітинним костимуляторним рецептором, який за зв'язуванням з CD80 і CD86 посилює проліферацію Т-клітин і синтез цитокінів, запобігаючи загибелі Т-клітин. CTLA-4 (що також позначається як CD152), що є гомологом CD28, також відображає важливу роль в процесі костимуляції. Хоча точно не визначено, передбачається, що він пригнічує костимуляторні Т-клітинні відповіді. Взаємодія між CD28, CTLA-4 і їх лігандами CD80 і CD86 в процесі костимуляції є ключем до індукції і супресії імунних відповідей на захворювання в організмі загалом. Шляхом маніпулювання цими чотирма костимуляторними молекулами, мабуть, можна регулювати Т-клітинну відповідь за шляхом активації, пригнічення або зміни напряму, можна посилювати бажану імунну відповідь за відношенням до конкретного патогену або захворювання. Зокрема, вони можуть бути використані для вакцинації проти інфекційних захворювань, для лікування інфекційних захворювань і лікування пухлинних дегенеративних, аутоімунних і імунодефіцитних станів. Т-лімфоцити імунної системи ссавців виконують і регуляторні, і ефекторні функції. Попередники Т-клітин виникають в кістковому мозку з стовбурових клітин і мігрують в тимус. У тимусі відбуваються процеси дозрівання і селекції з утворенням популяції наївних імунокомпетентних клітин, які здатні розпізнавати антиген при його презентації в поєднанні з головним комплексом 5 гістосумісності (МНС), але при цьому не є аутореактивними. Після дозрівання в тимусі кожна Тклітина несе клональний Т-клітинний рецептор (TCR), який визначає її антигенну специфічність. Крім того, Т-клітини двох основних підкласів, що виявляються у більшості дорослих ссавців - CD4+ і CD8+ - несуть TCR, складений a- і b-субодиницями (Allison & Lanier, 1987). Поліпептидна і генна організація білка TCR схожа з такою, характерною для молекул імуноглобуліну (Ig), і вона виявляє характеристики, які схожі в порівнянні з мембранозв'язаними Ig Влімфоцитів (Allison & Lanier, 1987). Як і молекула Ig, TCR потенційно повинен розпізнавати безліч можливих антигенних послідовностей. З цієї точки зору організація і реаранжування гену TCR схожа за своєю складністю з такими в В-клітинах (Davis & Bjorkman, 1988). Як і у випадку з імуноглобулінами В-клітин, утворення ідіотипічного різноманіття Тклітин пов'язане з наявністю множинних копій генів варіабельних доменів (V) в лінії статевих клітин, що відбуваються випадковим чином реаранжуваннями a- і b-субодиниць і з мінливістю, що зумовлюється явищами з'єднань і вставок (Davis & Bjorkman, 1988). Однак, на відміну від В-клітин, утворення різноманіття Т-клітин, мабуть, не пов'язане з соматичними мутаціями, хоч потенційний репертуар молекул TCR не поступається такому молекул Ig (Lechler et al., 1990). Молекула TCR, хоч і відповідає за розпізнавання антигену, не здібна до передавання сигналу (Allison & Lanier, 1987). Конформаційні зміни TCR після зв'язування з участю антигену МНС, що знаходиться на антиген-презентуючих клітинах (АРС), зумовлює передавання сигналу через нековалентний комплекс поверхневих молекул, включаючи CD3 і z-субодиниці (Clevers et al., 1988). Зв'язування на TCR зумовлює фосфоритування CDSкомплексу, що непрямим чином приводить до внесення в клітину іонів кальцію, внаслідок чого відбувається ініціація вироблення IL-2 і IL-2R (Weiss & Littman, 1994). Цей каскад розглядається як початкова подія в активації Т-клітин . TCR розпізнає антиген тільки тоді, коли він презентований з участю МНС. Відомі два класи МНС-білків, які пов'язані з процесом презентування антигену на Т-клітині. Молекули класу І МНС виявляються практично на всіх ядерних клітинах тіла, і їх функцією є перенесення ендогенних пептидів на поверхню клітин (Matasumura et al., 1992). Пептид, експресований з участю МНС класу І, розпізнається Т-клітинами, експресуючими CD8 в скріпленні з TCR (Littman, 1987). С08-позитивні Тклітини виконують функцію імунного нагляду за знищенням клітин, заражених вірусом, і пухлинних клітин . Розпізнавання Т-клітиною CD8+ «чужих» молекул (пептидів або змінених своїх пептидів, що може свідчити про розвиток пухлини) зумовлює руйнування цієї клітини, здійснюване з участю цитотоксичних Т-лімфоцитів (CTL) (Berke, 1994). Молекули класу II МНС, що представляють другу групу чинників головного комплексу гістосумісності, в нормі виявляються тільки у спеціалізованих антиген-презентуючих клітинах, включаючи В-лімфоцити, макрофаги/моноцити і дендритні 87470 6 клітини, хоча можлива їх індукція і в деяких інших типах клітин у відповідь на специфічні стимули (Germain, 1993). Молекула класу II МНС відповідає за презентовання зовнішнього антигену на СВ4позитивну Т-клітину. Антиген, який був фагоцитіваний, ендоцитований або пов'язаний поверхневим Ig з подальшим поглинанням клітиною, зазнає ендогенної обробки і зв'язується з молекулою класу П МНС (Unanue, 1987). Потім така молекула виходить на поверхню клітини і стає доступною для розпізнавання її CD4-позитивними Т-клітинами ab-TCR (Littman, 1987). Розпізнавання антигену Тклітинами CD4+ зумовлює вироблення цитокінів і чинників росту, необхідних для ініціації і поширення різних елементів активної імунної відповіді (Mosmann & Coffman, 1987). Диференціювання груп Т-клітин ab-TCR визначається наявністю CD4 і CD8, що пов'язано з детермінацією функцій кожної з цих груп.Одночасна присутність CD4 і CD8 на Т-клітині виключена (Littman, 1987). Тобто в процесі селекції і дозрівання в тимусі Т-клітини-оф отримують тільки CD4 або CD8. Ці молекули забезпечують стабільність взаємодії між TCR і МНС-пов'язаним антигеном і визначають для даної Т-клітини те, яким класом молекул МНС (І або II) презентується антиген (Littman, 1987). Скріплюючий домен молекули CD4 або CD8 розпізнає відповідну неполіморфну ділянку молекули класу І або класу II (Clayberger et al., 1994). Скріплення CD4 або CD8 з цими специфічними ділянками забезпечує стабільність взаємодії TCR і МНС-зв'язаного антигену з точки зору ініціації Т-клітинної активації (Littman, 1987). Таким чином, CD4-позитивні Т-клітини функціонально взаємодіють тільки з клітинами АРС, презентуючими антиген за допомогою молекул класу II і ініціюючим тим самим Т-хелперну відповідь, в той час як СD8-позитивні Т-клітини розпізнають тільки антиген, що презентується з участю молекул класу І, після зв'язування якого ініціюється цитотоксична відповідь (Germain, 1993). Два фенотипи- Тхелпери і CTL, що розрізнюються - можуть бути ідентифіковані за поверхово-клітинною експресією або CD4, або CD8. Більшість СВ4-позитивних Т-лімфоцитів загалом розглядаються як Т-хелперна популяція, хоч є і передбачуваний СВ4-позитивний CTL-підтип (Yasukawa et al., 1989). СD4-позитивні Т-хелпери є основними регулювальниками імунної відповіді за рахунок вироблення серії стимуляторних і супресорних цитокінів (Mosmann & Coffman, 1987). Чинники, що виробляються цими клітинами є важливими медіаторами ініціації і гуморального, тобто опосередкованого антитілами, і клітинного, тобто гіперчттєвості сповільненого типу (DTH), відповідей (Mosmann & Coffman, 1987). Для того, щоб Тклітини CD4+ активувалися за виробленням розчинних чинників росту, повинен відбуватися складний каскад процесів. Антиген виявляється і зазнає ендоцитозу специфічними АРС-клітинами, які в нормі є макрофагами (Unanue, 1984). АРС денатурують антигенний білок і розділяють його на менші фрагменти, після чого 15-18-амінокислотні пептиди зв'язуються молекулами МНС в ендоплазматчному ретикулюмі і після цього переносяться 7 на поверхню клітини (Rotzschke et al., 1994). Перенесений на поверхню антиген стає в результаті «видимим» для Т-клітин і може бути розпізнаний групами Т-клітин, експресуючих CD4 і, які мають відповідний TCR-ідіотип (Germain, 1993). Коли відбувається точне розпізнавання антигену Тклітиною і утворяться точні допоміжні сигнали, відбувається диференціювання «наївного» лімфоциту і запускається його клональна проліферація. За,поки що не встановленними причинами, відбувається переважне формування відповіді 1-го типу (клітинного) за відношенням до відповіді 2-го типу (гуморального) (Mosmann & Coffman, 1989). Участь Т-хелперів є необхідними для забезпечення активності і гуморальної, і клітинної відповідей. У залежній від Т-клітин В-клітинної відповіді, необхідної для вироблення антитіл до більшості антигенів, Т-хелпери потрібні для забезпечення правильного дозрівання В-клітин (Chesnut et al., 1986). Після того, як експресований В-клітиною поверхневий Ig зв'язав антиген, відбувається інтерналізація, процесинг і вивід антигену на поверхню молекулами класу II МНС (Germain, 1993). Безпосередній міжклітинний контакт між Тклітиною CD4+, що має точний TCR-ідіотип, і Вклітиною сприяє активації і проліферації цієї Тклітини (Chesnut et al., 1986). Активований Тхелпер може ініціювати відповідь 2-го типу за рахунок секреції чинників, необхідних для росту і диференціювання В-клітин (Mosmann & Coffman, 1989). Цими чинниками є інтерлейкіни IL-4, IL-5 і IL-13, які здатні індукувати активацію і проліферацію В-клітин, а також важливі в процесі ізотипічного перемикання молекул антитіл, в той час як IL-10 запобігає ініціації відповіді 1-го типу, що, в свою чергу, є чинником негативної регуляції гуморальної відповіді (Mosmann & Coffman, 1989). Клітинні відповіді (1-й тип) індукуються не так, як гуморальні відповіді (2-й тип) (Sher et al., 1992). Після активації Т-клітин і їх дозрівання для відповіді 1-го типу цією Т-клітиною виробляються чинники, які сприяють клітинному імунітету. IL-2 є Тклітинним чинником росту, який також активує CTL-відповіді, в той час як g-інтерферон активує макрофаги, CTL і нейтрофіли (Wang et al., 1993). Таким чином, Т-хелпери здатні опосередковувати дві принципово взаємовиключаючі відповіді. Ознака секреції цитокінів, пов'язана з ініціацією гуморальної відповіді, включає чинники, які є супресорами клітинної відповіді, і навпаки (Mosmann & Coffman, 1989). Поки не зрозуміло, що примушує Т-клітину виявляти або ознаку 1-го типу (вироблення IL-2, g-інтерферону і лімфотоксину), або ознаку 2-го типу (IL-4, IL-5, IL-6, IL-10 і IL-13), хоча передбачається, що на варіант цитокінового профілю, що формується можуть впливати тип АРС, яка презентує даний антиген, або розчинні чинники, що виробляються цією АРС (Mosmann & Coffman, 1989). У доповнення до хелперних клітин 1-го і 2-го типів існує так званий 0-й тип хелперів, який характеризується параметрами цитокінової секреції, проміжними за відношенням до 1-го і 2-го типів (Gajewski et al., 1989). Хоча типи хелперів в основному були охарактеризовані в експериментах in vitro, тобто можуть відображати культуральні 87470 8 артефакти, вони є важливими моделями тієї ролі, яку Т-хелпер відображає в контролі розвитку специфічних відповідей в ситуації in vivo. У доповнення до СD4-позитивних Т-хелперних лімфоцитів друга популяція Т-клітин-ab складена СD8-позитивними цитотоксичними лімфоцитами (CTL). Вважається, що CTL-CD8+ відіграють ведучу роль в системі імунного нагляду, основна функція якої пов'язана з руйнуванням клітин, інфікованих вірусами або внутрішньоклітинними бактеріями, а також пухлинних клітин (Berke, 1994). Ці клітини також способи виробляти цитокіни, але, загалом, тільки такі, які пов'язані з індукцією клітинних відповідей (IL-2, g-інтерферон і TNF) (Fong & Mosmann, 1990). Рецептор TCR цих клітин з участю CD8 розпізнає антиген, презентований за допомогою молекул класу І МНС (Littman, 1987). Загалом, всі ядерні клітини характеризуються поверхневою експресією молекул класу І, що презентують внутрішньоклітинне синтезовані пептиди (Matasumara, 1992). Специфічні за імунною активністю ділянки, включаючи головний мозок і сім'яники, характеризуються низьким рівнем білкового синтезу, хоч він і індукується в цих ділянках під впливом інтерферону (Moffett & Paden, 1994). Білки, що виробляються в ендоплазматичному ретикулюмі в ході нормальної життєдіяльності клітини, денатуруються, частково розщеплюються і за допомогою молекул класу І МНС виносяться на поверхню (Engelhard, 1994). Ці поліпептиди протеолітичне лінеаризуються і зв'язуються у вигляді 912-амінокислотних епітопів молекулами класу І, які потім виносяться на поверхню цієї клітини (Engelhard, 1994). Теоретично таким чином на поверхні можуть виявитися будь-які внутрішньоклітинне синтезовані білки, тому внаслідок селекції в тимусі зумовлюється ідеальна елімінація всіх аутореактивних Т-клітин, а система імунного нагляду може виявити присутність інфікованих вірусом або трансформованих клітин (Berke, 1993). Розпізнавання чужорідних пептидів, експресованих молекулами класу І, здійснюється антигенспецифічними Т-клітинними рецепторами на поверхні CTL-CD8+ (Lechler et al., 1990). Для активації необхідний контакт між ефекторною клітиною і мішенню (Berke, 1994). Коли антиген, що розглядається як чужорідний, детектується рецептором TCR, взаємодія молекул стабілізується за рахунок зв'язування CD8 з молекулою класу І на поверхні інфікованої клітини (Littman, 1987). Після розпізнавання і активації Т-клітини утвориться «кон'югат» між клітиною-мішенню і ефекторною Т-клітиною, після чого ефекторна клітина знищується (Taylor & Cohen, 1992). Таким чином, в такому механізмі при зміні власних білків або при порушенні клітинних механізмів внаслідок атаки патогену пептиди стають розпізнаваними системою імунного нагляду, внаслідок чого даний елемент імунної системи забезпечить знищення хворої клітини (Berke, 1994). Цитотоксичність, як вважається, зумовлюється одним з двох основних механізмів. Або в клітині індукується апоптоз, або вона лізується з участю цитотоксичних гранул, що секретуються CTL (Berke, 1993). Апоптоз в клітинах-мішенях індуку 9 ється шляхом секреції клітинами CTL чинників, які індукують експресію генів, що зумовлюють загибель клітини (Russel, 1983). Перевагою цього механізму є відсутність лізису клітини, що знижує імовірність виходу потенційно інфекційне небезпечного вмісту цієї клітини (Nagata & Golstein, 1995). Однак, клітинний лізис може бути найбільш загальним механізмом, відповідно до якого відбувається направлене знищення клітин. Основним компонентом «цитотоксичних гранул», що виробляються клітинами CTL є білок перфорин, який «протикає» мембрани клітин-мішеней (Liu et al., 1995). Хоч існують і інші типи клітин, залучених до даної форми імунного нагляду, вважається, що CTL є основним компонентом противірусного і протипухлинного імунітету і розглядаються як необхідна ланка в захисті від конкретних патогенів (Kupfer & Singer, 1989). Початково поверхово-клітинні білки використовувалися для розмежування конкретних клітинних популяцій. Пізніше були встановлені функціональні аспекти багатьох з цих молекул, а з урахуванням їх значення для диференціювання клітинних популяцій стала більш зрозумілою їх важлива роль в функціонуванні багатьох клітин. Різні допоміжні молекули і молекули адгезії, які беруть участь в розвитку імунної відповіді, експресуються Т-клітинами і антигенм-презентуючими клітинами (van Seventer et al., 1991). Молекули адгезії експресуються на певному рівні більшістю клітин імунної системи. Вони важливі для збереження клітин в певній ділянці і для ініціації і підтримки міжклітинних контактів (Mescher, 1992). Два комплекси молекул адгезії - CD2/LFA-3 (CD58) і LFA-1/ICAM-1 - беруть участь в стабілізації взаємодії Т-клітин і клітин АРС і посиленні активності (Springer et al., 1987). CD2 є одним з перших маркерів, експресованих попередниками Тлімфоцитів, і існує протягом всього життя цієї клітини, в той час як LFA-1 експресується Тклітинами пізніше і позитивно регулюється в клітинах пам'яті або за типом індуцибельності (Springer et al., 1987). Комплекси допоміжних молекул також виявляють адгезійні властивості, але їх основною функцією, мабуть, є передавання міжклітинного сигналу після зв'язування ліганду (Anderson et al., 1988). Після встановлення взаємодії між рецептором і його лігандом відбувається така зміна конформаційної структури молекули, яка зумовлює передавання сигналу в цитоплазму однієї або обох клітин (Hutchcroft & Bierer, 1994). Сигнали, що передаються цими молекулами виконують ряд функцій для сприянню розвитку Т-клітин, однак у відсутність сигналів, опосередкованими цими молекулами, Т-клітини можуть ставати анергічними (Leung & Lindsley, 1994). Взаємодія CD28/CD80 є основним компонентом інтенсивної імунної відповіді, опосередкованого Т-клітинами (Linsley et al., 1993a). Взаємодія допоміжних молекул CD28 з відповідним лігандом CD80 необхідна для повної активації і проліферації «наївних» Т-клітин (Linsley et al., 1991a). Також ця взаємодія, як вважається, відображає ключову роль в проліферації активованих СВ4-позитивних 87470 10 Т-клітин пам'яті і в запобіганні апоптотичної загибелі клітин (Linsley et al., 1991a). Встановлення такої взаємодії і розшифрування його механізмів дає ключ до розуміння процесів імунітету, опосередкованого Т-клітинами. Даний винахід стосується виділеної і очищеної ДНК, що кодує ліганд CD80 (В7-1) кішки, ліганд CD86 (В7-2) кішки, рецептор CD28 кішки або рецептор CTLA-4 (CD152) кішки, а також векторів, що включають нуклеїнову кислоту, що кодує CD80 кішки, CD86 кішки, CD28 кішки або CTLA-4 кішки. Даний винахід стосується клітин-господарів, трансформованих CD 80-кодуючими векторами, CD 86-кодуючими векторами, CD28-кодуючими векторами або CTLA-4-кодуючими векторами. Даний винахід стосується поліпептидів, що кодуються нуклеїновою кислотою CD80 кішки, CD86 кішки, CD28 кішки або CTLA-4 кішки. Даний винахід стосується вакцини, що містить ефективну кількість поліпептидів, що кодуються нуклеїновою кислотою CD80 кішки, CD86 кішки, CD28 кішки або CTLA-4 кішки. Також даний винахід стосується вакцин, які додатково містять імуногени, похідні від патогенів. Даний винахід стосується вакцин, здатних посилювати імунну відповідь. Також даний винахід стосується вакцин, здатних пригнічувати імунну відповідь. Фігура 1А. Нуклеотидна і амінокислотна послідовності CD80 (В7-1) кішки (TAMU) (SEQ ID NO: 1 і 2). Фігура 1В. Спектр гідрофобності амінокислотної послідовності CD80 (В7-1) кішки (TAMU). Фігура 2А. Нуклеотидна і амінокислотна послідовності CD80 (В7-1) кішки (SYNTRO) (SEQ ID NO: 3 і 4). Фігура 2В. Спектр гідрофобності амінокислотної послідовності CD80 (В7-1) кішки (SYNTRO). Фігура 3А. Нуклеотидна і амінокислотна послідовності CD86 (В7-2) кішки (SEQ ID NО: 5 і 6). Фігура 3В. Спектр гідрофобності амінокислотної послідовності CD86 (В7-2) кішки. Фігура 4А. Нуклеотидна і амінокислотна послідовності CD28 кішки (SEQ ID NO: 7 і 8). Фігура 4В. Спектр гідрофобності амінокислотної послідовності CD28 кішки. Фігура 5А. Нуклеотидна і амінокислотна послідовності CTLA-4 (CD 152) кішки (SEQ ID NО:9 і 10). Фігура 5В. Спектр гідрофобності амінокислотної послідовності CTLA-4 (CD152) кішки. Даний винахід представляє виділену нуклеїнову кислоту, що кодує ліганд CD80 кішки або розчинний ліганд CD80 кішки. Також даний винахід представляє виділену нуклеїнову кислоту, що кодує ліганд CD86 кішки або розчинний ліганд CD86 кішки. Також даний винахід представляє виділену нуклеїнову кислоту, що кодує рецептор CD28 кішки або розчинний рецептор CD28 кішки. Також даний винахід представляє виділену нуклеїнову кислоту, що кодує рецептор CTLA-4 кішки або розчинний рецептор CTLA-4 кішки. У одному з здійснень даний винахід представляє нуклеїнову кислоту, що кодує ліганд CD80 кішки, який характеризується амінокислотною послідовністю, показаною на Фіг.1А, починаючи із 11 залишку метіоніну і закінчуючи залишком треоніну (SEQ ID NO: 1). У іншому здійсненні даний винахід представляє нуклеїнову кислоту, що кодує ліганд CD86 кішки, який характеризується амінокислотною послідовністю, показаною на Фіг.3А, починаючи із залишку метіоніну і закінчуючи залишком глутаміну (SEQ ID NO: 5). Ще в одному здійсненні даний винахід представляє нуклеїнову кислоту, що кодує рецептор CD28 кішки, який характеризується амінокислотною послідовністю, показаною на Фіг.4А, починаючи із залишку метіоніну і закінчуючи залишком серину (SEQ ID NO: 7). У іншому здійсненні даний винахід представляє нуклеїнову кислоту, що кодує рецептор CTLA-4 кішки, який характеризується амінокислотною послідовністю, показаною на Фіг.5А, починаючи із залишку метіоніну і закінчуючи залишком аспарагіну (SEQ ID NO: 9). У здійсненні винаходу, що описується вище нуклеїновою кислотою є ДНК або РHК. У іншому здійсненні ДНК є кДНК або геномною ДНК. Даний винахід представляє олігонуклеотид, що складається принаймні з 12 нуклеотидів, що характеризується комплементарністю за відношенням до унікальної послідовності, що є в складі нуклеїнової кислоти, що кодує CD28, CD80, CD86 або CTLA-4, описаної више. У іншому здійсненні даного винаходу представляється олігонуклеотид, що складається принаймні з 15 або 16 нуклеотидів, який характеризується комплементарністю за відношенням до унікальної послідовності, присутньої в складі нуклеїнової кислоти, що кодує CD28, CD80, CD86 або CTLA-4, описаної вище. У іншому здійсненні винаходу, що описується вище представляється олігонуклеотид, який помічений міткою, що визначається. У одному із здійсненні міткою, що виявляється є радіоактивний ізотоп, флуорофор або біотин. У іншому здійсненні такий олігонуклеотид виборче метилований. Даний винахід представляє вектор, що включає нуклеїнову кислоту, що кодує ліганд CD80 кішки або розчинний ліганд CD80 кішки. У іншому здійсненні даного винаходу представляється плазмідний вектор, позначений PSI-B7-1/871-35 (Колекція АТСС, депозитарний N8 209817). Ця плазміда була депонована в Американську колекцію типових культур (АТСС) 29 квітня 1998 року (адреса якої - 10801 University Boulevard, Manassas, VA 20108-0971, США) відповідно за Будапештською угодою про Міжнародні правила депонування мікроорганізмів для цілей здійснення процедури патентування. Даний винахід представляє вектор, що включає нуклеїнову кислоту, що кодує ліганд CD86 кішки або розчинний ліганд CD86 кішки. У іншому здійсненні даного винаходу представляється плазмідний вектор, позначений В7-2#19-2/011298 (АТСС, депозитарний №209821). Ця плазміда була депонована в Американську колекцію типових культур (АТСС) 29 квітня 1998 року (адреса якої 10801 University Boulevard, Manassas, VA 201080971, США) відповідно за Будапештською угодою про Міжнародні правила депонування мікроорганізмів для цілей здійснення процедури патентування. 87470 12 Даний винахід представляє вектор, що включає нуклеїнову кислоту, що кодує рецептор CD28 кішки або розчинний рецептор CD28 кішки. У іншому здійсненні даного винаходу представляється плазмідний вектор, позначений PSI-CD28#7/100296 (АТСС, депозитарний №209819). Ця плазміда була депонована в Американську колекцію типових культур (АТСС) 29 квітня 1998 року (адреса якої - 10801 University Boulevard, Manassas, VA 20108-0971, США) відповідно за Будапештською угодою про Міжнародні правила депонування мікроорганізмів для цілей здійснення процедури патентування. Даний винахід представляє вектор, що включає нуклеїнову кислоту, що кодує рецептор CTLA4 кішки або розчинний рецептор CTLA-4 кішки. У іншому здійсненні даного винаходу представляється плазмідний вектор, позначений CTLA-4-# 1/091997 (АТСС, депозитарний №209820). Ця плазміда була депонована в Американську колекцію типових культур (АТСС) 29 квітня 1998 року (адреса якої -10801 University Boulevard, Manassas, VA 20108-0971, США) у відповідності за Будапештською угодою про Міжнародні правила депонування мікроорганізмів для цілей здійснення процедури патентування. Даний винахід представляє описаний вище вектор, який додатково включає промотор, функціонально приєднаний до нуклеїнової кислоти. У іншому здійсненні даний винахід представляє клітину-господаря, яка несе будь-який із згадуваних вище векторів. У одному із здійсненні такою клітиною-господарем, несучою один із згаданих вище векторів, є еукаріотична або прокаріотична клітина. У іншому здійсненні клітиною-господарем є клітини Е.соїі, клітини дріжджів, клітини COS, клітини PC 12, клітини СНО або клітини GH4C1. Даний винахід представляє поліпептид, що кодується нуклеїновою кислотою ліганду CD80 кішки або розчинним ліганду CD80 кішки. У здійсненні даного винаходу представляється поліпептид, що кодується нуклеїновою кислотою ліганду CD86 кішки або розчинним лігандом CD86 кішки. У іншому здійсненні даного винаходу представляється поліпептид, що кодується нуклеїновою кислотою рецептора CD28 кішки або розчинного рецептора CD28 кішки. Даний винахід представляє поліпептид, що кодується нуклеїновою кислотою рецептора CTLA-4 кішки або розчинного рецептора CTLA-4 кішки. У іншому здійсненні даного винаходу представляється спосіб продукції згадуваних вище поліпептидів шляхом культивування клітини-господаря, яка експресує ці поліпептиди, і виділення цих поліпептидів, що отримуються таким чином. Даний винахід представляє вакцину, що містить ефективну кількість згадуваних вище поліпептидів і відповідного носія. У іншому здійсненні винаходу представляється вакцина, в складі якої ефективна кількість згаданого вище поліпетиду і відповідного носія є кількістю від приблизно 0,01мг до приблизно 100мг на 1 дозу. У іншому здійсненні винаходу представляється вакцина, в якій ефективна кількість згаданого вище поліпетиду і відповідного носія є кількістю від приблизно 0,25мг на 1кг 13 ваги тіла кішки на день до приблизно 25мг на 1кг ваги тіла кішки на день. Далі даний винахід представляє згадувану вище вакцину, яка додатково містить імуноген, похідний від патогену. У іншому здійсненні винаходу такий імуноген в складі вакцини походить від котячого патогену, вірусу сказу, хламідії, Toxoplasma gondii, Dirofilaria immitis, бліх або бактерійних патогенів. У іншому здійсненні винаходу представляється вакцина, в складі якої патогеном є вірус імунодефіциту котячих (FIV), вірус лейкозу котячих (FeLV), вірус інфекційного перитоніту котячих (FIP), вірус панлейкопенії котячих, каліцивірус котячих, реовірус котячих 3-го типу, ротавірус котячих, коронавірус котячих, респіраторносинцитиальний вірус котячих, вірус саркоми котячих, герпесвірус котячих, вірус хвороби Борна кішок або котячий паразит. Також даний винахід представляє спосіб індукції імунітету у кішок, який включає введення кішці дози вакцини, що містить будь-який з імуногенів, що вказувалися вище. Також даний винахід представляє спосіб посилення імунної відповіді у кішки, який включає ефективну дозу поліпептиду, імуногену і відповідного носія. Даний винахід представляє спосіб введення згадуваної вище вакцини підшкірне, внутрішньом'язово, системно, місцеве або перорально. У іншому здійсненні даного винаходу представляється спосіб пригнічення імунної відповіді у кішки, який включає введення цій кішці ефективної за пригніченням імунної відповіді кількості поліпептиду, що кодується нуклеїновою кислотою CTLA-4 кішки. У іншому здійсненні винаходу представляється спосіб пригнічення імунної відповіді у кішки, що включає введення цій кішці ефективної за пригніченням імунної відповіді кількості розчинного поліпептиду, що кодується CD80 кішки, CD86 кішки або CD28 кішки. У іншому здійсненні даного винаходу представляється спосіб пригнічення імунної відповіді у кішки шляхом введення поліпептиду, що кодується нуклеїновою кислотою CTLA-4 кішки, в кількості від приблизно 0,25мг на 1кг ваги тіла на день до 25мг на 1кг ваги тіла на день. У іншому здійсненні винаходу представляється спосіб пригнічення імунної відповіді у кішки шляхом введення поліпептиду, що кодується CD80 кішки, CD86 кішки або CD28 кішки, в кількості від приблизно 0,25мг на 1кг ваги тіла на день до 25мг на 1кг ваги тіла на день. Також даний винахід представляє спосіб пригнічення імунної відповіді у кішки з діагнозом аутоімунного захворювання або у кішки-реципієнта пересадки тканини або органу шляхом введення цій кішці ефективної за пригніченням імунної відповіді кількості поліпептиду, що кодується нуклеїновою кислотою CTLA-4 кішки. Даний винахід також представляє спосіб пригнічення імунної відповіді у кішки з діагнозом аутоімунного захворювання або у кішки-реципієнта пересадки тканини або органу шляхом введення цій кішці ефективної за пригніченням імунної відповіді кількості поліпептиду, що кодується CD80 кішки, CD86 кішки або CD28 кішки. 87470 14 Даний винахід представляє виділену і очищену кДНК CD80 (В7-1) довжиною приблизно 941 нуклеотидів. Винахід також представляє виділений і очищений поліпептид CD80 кішки, що складається приблизно з 292 амінокислот, що є зв'язаною з мембранною або зрілою формою з молекулярною масою 33,485кДа, ізоелектричною точкою приблизно рI=9,1 і загальним зарядом при рН=7,0 рівним 10. Коекспресія CD80 з костимуляторною молекулою CD28 і з пухлинним антигеном або антигеном патогенного організму виявляє здібність до активації або посилення активації Т-лімфоцитів, індукуючи тим самим вироблення імуностимулюючих цитокінів, і до регуляції росту інших клітинних типів. Коекспресія CD80 з костимуляторною молекулою CTLA-4 виявляє здібність до регуляції активації Т-лімфоцитів. Даний винахід представляє виділену і очищену кДНК CD86 (В7-2) довжиною приблизно 1176 нуклеотидів. Також винахід представляє виділений і очищений поліпептид CD86 кішки, що складається приблизно з 320 амінокислот, що є зв'язаною з мембранною або зрілою формою з молекулярною масою 36,394 кДа, ізоелектричною точкою приблизно рl=9,19 і загальним зарядом при рН=7,0 рівну 11,27. Коекспресія CD86 з костимуляторною молекулою CD28 і з пухлинним антигеном або антигеном патогенного організму виявляє здібність до активації або посилення активації Т-лімфоцитів, індукуючи тим самим вироблення імуностимулюючих цитокінів, і до регуляції росту інших клітинних типів. Коекспресія CD86 з костимуляторною молекулою CTLA-4 виявляє здібність до регуляції активації Т-лімфоцитів. CD80 або CD86 кішки за даним винаходом були отримані з нативних або рекомбінантних джерел. CD80 або CD86 кішки за даним винаходом включають нативну і зв'язану з мембраною форму або форму, що секретується, яка втратила трансмембранний домен. Даний винахід представляє виділену і очищену кДНК CD28 довжиною приблизно 689 нуклеотидів. Також винахід, представляє виділений і очищений поліпептид CD28 кішки, що складається приблизно з 221 амінокислот, що є зв'язаним з мембранною або зрілою формою з молекулярною масою 25,319 кДа, ізоелектричною точкою приблизно рI=9,17 і сумарним зарядом при рН=7,0 рівним 9,58. Також даний винахід представляє виділену і очищену кДНК CTLA-4 довжиною приблизно 749 нуклеотидів. Також винахід представляє виділений і очищений поліпептид CTLA-4 кішки, що складається приблизно з 223 амінокислот, що є зв'язаним з мембранною або зрілою формою з молекулярною масою 24,381кДа, ізоелектричною точкою приблизно рI=6,34 і сумарним зарядом при рН=7,0 рівним -0,99. У іншому аспекті даний винахід представляє спосіб посилення імунної відповіді у кішки на імуноген, що досягається введенням цього імуногену до, після або по суті одночасно з CD80 кішки або CD86 кішки разом з CD28 кішки або CTLA-4 кішки або без них в кількості, ефективній при підсиленні імунної відповіді. 15 У іншому аспекті даного винаходу представляється спосіб пригнічення імунної відповіді у кішки на імуноген, що досягається введенням цього імуногену до, після або по суті одночасно з CD80 кішки або CD86 кішки разом з CD28 кішки або CTLA-4 кішки або без них або з антисмисловою РНК або ДНК, частково або повністю кодуючих CD80 кішки або CD86 кішки, або CD28 кішки, або CTLA-4 кішки, в кількості, ефективній при пригніченні імунної відповіді. У наступному аспекті даного винаходу представляється вакцина для індукції імунної відповіді у кішок на імуноген, що містить цей імуноген і кількість CD80, ефективна при посиленні імунної відповіді. Імуноген є похідним, наприклад, від котячих патогенів, таких як вірус імунодефіциту кішки, вірус лейкозу кішки, парвовірус кішки, коронавірус кішки, лептовірус кішки і подібне. У іншому аспекті даного винаходу представляється вакцина для індукції імунної відповіді у кішки на імуноген, що досягається введенням ДНК або РНК імуногену і ДНК або РНК допоміжних молекул CD80, CD86, CD28 кішки в будь-якому поєднанні, які кодують білки або білкові фрагменти, в кількості, ефективній при модуляції імунної відповіді. Білок CD80 кішки характеризується амінокислотною послідовністю, яка на 59% і 46% ідентична поліпептидам людини і миші, відповідно. Білок CD86 кішки характеризується амінокислотною послідовністю, яка на 68% і 64% ідентична таким білкам людини і кролика, відповідно. Білок CD28 кішки характеризується амінокислотною послідовністю, яка на 82% і 74% ідентична поліпептидам людини і миші, відповідно. Білок CTLA-4 кішки характеризується амінокислотною послідовністю, яка на 88% і 78% ідентична поліпептидам людини і миші, відповідно. Білки CD80 або CD86 миші або людини не можуть функціонально замінити котячі білки CD80 або CD86. Отже, білки CD80 кішки, CD86 кішки, CD28 кішки і CTLA-4 кішки є новими реагентами, необхідними для контролю імунітету у кішок. Даний винахід охоплює Т-клітинні регуляторні допоміжні молекули - CD80 (В7-1) або CD86 (В72), або CD28, або CTLA-4 (CD152) домашніх кішок. Даний винахід представляє виділені і очищені нуклеїнові кислоти, що кодують частково або повністю CD80 кішки, CD86 кішки, CD28 кішки і CTLA-4 кішки, рівно як і поліпептиди CD80, CD86, CD28 або CTLA-4, очищені або з нативних, або з рекомбінантних джерел. Вироблені відповідно за даним винаходом CD80, CD86, CD28 або CTLA-4 кішки використовують для підвищення ефективність котячих вакцин проти пухлин і патогенних організмів, а також як лікарський засіб для лікування вірусних і бактерійних хвороб домашніх кішок. Вироблені відповідно заданим винаходом CD80, CD86, CD28 або CTLA-4 кішки також використовують для ослаблення захворювання за рахунок надактивних, гіперактивних або перенаправлених імунних відповідей. Нуклеїнові кислоти, вектори, трансформанти Послідовності кДНК, що кодують CD80 кішки (SEQ ID NO: 1), CD86 кішки (SEQ ID NO: 5), CD28 кішки (SEQ ID NO: 7) або CTLA-4 кішки (SEQ ID 87470 16 NO: 9) показані на Фіг.1-5, а розшифровані амінокислотні послідовності CD80 кішки (SEQ ID NO: 2), CD86 кішки (SEQ ID NO: 6), CD28 кішки (SEQ ID NO: 8) або CTLA-4 кішки (SEQ ID NO: 10) показані на Фіг.1-5. Ідентифікація цих котячих поліпептидів таких як CD80, CD86, CD28 або CTLA-4 засновується на певному рівні гомології амінокислотних послідовностей і гомологічних поліпептидів людини або миші, або кролика, і на здатності поліпептидів CD80 або CD86 зв'язуватися з рецептором CD28 кішки (див. нижче) або з CTLA-4 і активувати або стимулювати, або будь-яким іншим чином регулювати активацію Т-лімфоцитів. Більш того не обмежуючись будь-якою теорією, передбачається, що поліпептиди CD80 кішки або CD86 кішки також виявляють одну або більше з наступної біологічної активності: активація клітин NK. (нативні клітиникілери), стимуляція дозрівання В-клітин, активація обмежених за МНС цитотоксичних Т-лімфоцитів, проліферація огрядних клітин, взаємодія з рецепторами цитокінів і індукція імунорегулюючих цитокінов. Через виродженість генетичний код (тобто наявності більше за один кодон, що кодує деякі амінокислоти) послідовності ДНК, що не співпадають з показаними на Фіг.1-5, також можуть кодувати амінокислотні послідовності CD80, CD86, CD28 або CTLA-4 кішки, показані на Фіг.1-5. Такі «інші ДНК» включають ті послідовності, які включають «структурно консервативні» зміни, при яких зміна одного або більшого числа нуклеотидів в складі даного кодону не приводить до зміни амінокислоти, що кодується цим кодоном. Більш того даний амінокислотний залишок в поліпептиді часто може бути змінений без зміни загальної конформації і функцій нативного поліпептиду. Такі «функціонально консервативні» варіанти включають, тим самим не обмежуючись, заміну амінокислоти на амінокислоту, що характеризується схожими фізикохімічними параметрами, такими як, наприклад, кислі, основні, гідрофобні, гідрофільні, ароматичні і подібні властивості (наприклад, заміна лізину на аргінін, аспарагінової кислоти на глутамінову кислоту або гліцину на аланін). Крім того, амінокислотні послідовності додаються або віддаляються без порушення біологічної активності даної молекули. Наприклад, додаткові амінокислотні послідовності додають або з N-, або з С-кінця, які служать мітками для очищення даного білка, такими як полігістидинові мітки (тобто для забезпечення одноетапного очищення даного білка, після чого їх видаляють хімічним або каталітичним шляхом). З іншого боку, додаткові послідовності надають додатковий сайт поверхневого зв'язування або будьяким іншим шляхом змінюють специфічність CD80, CD86, CD28 або CTLA-4 кішки відносно клітинмішеней, наприклад, шляхом додання антигензв'язуючого сайту для антитіл. кДНК CD80 кішки або CD86 кішки, або CD28 кішки, або CTLA-4 кішки, що попадають в об'єм даного винаходу, відповідають послідовностям, показаним на Фіг.1-5, структурно-консервативним варіантам ДНК, послідовностям ДНК, що кодують функціонально-консервативні варіанти поліпептидів, і їх комбінацій. Даний винахід охоплює фраг 17 менти CD80, CD86, CD28 або CTLA-4 кішки, які виявляють ефективну міру біологічної активності як окремо, так і в поєднанні з іншими послідовностями або компонентами. Як буде пояснено далі, в компетенції фахівця в даній області техніки передбачити результати маніпуляцій послідовностями CD80, CD86, CD28 або CTLA-4 і встановити, або буде даний варіант CD80, CD86, CD28 або CTLA-4 кішки виявляти відповідну стабільність і біологічну активність відносно даного застосування, або визначити параметри, які порушують активність за зв'язуванням цих молекул, що обумовить підвищення ефективності. Кожний з CD80 і CD86 кішки зв'язується з корецептором CD28 або корецептором CTLA-4. Цього можна досягти шляхом експресії і очищення варіантних поліпептидів CD80, CD86, CD28 або CTLA-4 в рекомбінантної системи і оцінки їх Т-стимуляторної активності і (або) активності за активацією росту в клітинних культурах і у тварин з подальшим тестуванням на можливе застосування. Варіант CD80 тестують за його біологічною активністю за функціональним зв'язуванням з рецепторами CD28 або CTLA-4. Варіант CD86 тестують за його біологічною активністю за функціональним зв'язуванням з рецепторами CD28 або CTLA-4. Схожим чином варіант CD28 або варіант CTLA-4 тестують за їх біологічною активністю. Також даний винахід охоплює ДНК CD80, CD86, CD28 або CTLA-4 кішки (і поліпептиди), похідні від інших видів котячих, включаючи, але тим самим не обмежуючись, домашніх кішок, левів, тигрів, гепардів, рисей і т.д. Гомологи CD80, CD86, CD28 або CTLA-4 кішки за відношенням до показаного на Фіг.1-5 можуть бути легко ідентифіковані шляхом скринінгу бібліотек кДНК або геномних клонотек з метою ідентифікації клонів, які гібридизуються із зондами, що включають повністю або частково послідовність, показану на Фіг.1-5. З іншого боку, експресійні бібліотеки піддають скринінгу з використанням антитіл, які розпізнають CD80, CD86, CD28 або CTLA-4 кішки. Поза зв'язком з будь-якою теорією можна вважати, що гени CD80 або CD86 кішки інших видів котячих будуть принаймні на 70% гомологічні генам CD80, CD86, CD28 або CTLA-4 кішки. Також в об'єм даного винаходу попадають ДНК, які кодують гомологи CD80, CD86, CD28 або CTLA-4, що визначаються як поліпептиди, що кодуються ДНК, які характеризуються принаймні приблизно 25%-вим рівнем ідентичності з амінокислотними послідовностями CD80, CD86, CD28 або CTLA-4 кішки. Загалом, в маніпуляціях нуклеїновими кислотами відповідно даному винаходу використовуються методи, які добре відомі в науці, такі як ті, які описані, наприклад, в Sambrook, Fritsch & Maniatis, 1989, "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", 2nd ed.. Cold Spring Harbor або "Current Protocols in Molecular Biology", eds. Ausubel, Brent, Kingston, More, Feidman, Smith & Stuhl, Greene Publ. Assoc., Wiley-Interscience, NY, 1992. Даний винахід охоплює послідовності кДНК і РНК в смисловому і антисмисловому порядках. Також винахід охоплює послідовності геномної ДНК CD80, CD86, CD28 або CTLA-4 кішки і флан 87470 18 куючі послідовності, включаючи, але тим самим не обмежуючись, регуляторні послідовності. Нуклеїнові послідовності, що кодують поліпептиди CD80, CD86, CD28 або CTLA-4 кішки, також зв'язують з гетерологічними послідовностями, включаючи промотори, енхансери, регуляторні елементи, сигнальні послідовності, сигнали поліаденілування, інтрони, 5'- і 3'-некодуючі сегменти і подібне. Транскрипційними регуляторними елементами, які функціонально пов'язані з послідовностями кДНК CD80, CD86, CD28 або CTLA-4 кішки, є без будьяких обмежень послідовності, здатні контролювати експресію генів, похідні від прокаріотичних клітин, еукаріотичних клітин, вірусів прокаріот, вірусів еукаріот і будь-яких їх комбінацій. Також в даній області техніки відомі і інші гетерологічні регуляторні послідовності. Нуклеїнові кислоти за даним винаходом модифікують із застосуванням методів, відомих в даній області техніки, з метою зміни їх стабільності, розчинності, афінності зв'язування і специфічності. Наприклад, послідовності метилують селективним чином. Також нуклеотидні послідовності за даним винаходом модифікують міткою, здатною забезпечувати ефективний прямий або непрямий сигнал. Прикладами міток є радіоактивні ізотопи, флуоресцентні молекули, біотин і подібне. Також даний винахід представляє вектори, які включають нуклеїнові кислоти, що кодують поліпептиди CD80, CD86, CD28 або CTLA-4 частково або повністю. Такими векторами є, наприклад, плазмідні вектори, призначені для експресії в різних прокаріотичних і еукаріотичних організмахгосподарях. Переважно вектори також включають промотор, функціонально приєднаний до ділянок, що кодують CD80, CD86, CD28 або CTLA-4 кішки. Котячі CD80, що кодуються, CD86, CD28 або CTLA-4 експресуються з використанням будь-яких відповідних векторів і клітин-господарів відповідно до описаного в даному тексті і у відповідності з відомим фахівцям в даній області техніки. Відповідними векторами для використання в практиці даного винаходу є, тим самим не обмежуючись, YEp352, pcDNAI (Invitrogen, Carlsbad, CA), pRc/CMV (Invitrogen) і pSFVl (Gibco BRL), Gaithersburg, MD). Одним з переважних за використанням в даному винаході вектором є pSFVl. Відповідними клітинами-господарями є клітини Е.соїі, клітини дріжджів, клітини COS, клітини PC 12, клітини СНО, клітини GH4C1, клітини ВНК-21 і клітини меланофорів амфібій. Клітини ВНК-21 є переважними клітинами-господарями з точки зору використання в практиці даного винаходу. Відповідними векторами для конструювання «голої» ДНК або для «генетичної вакцинації» є, тим самим не обмежуючись, pTarget (Promega, Madison, WI), pSI (Promega, Madison, WI) і pcDNA (Invitrogen, Carlsbad, CA). Нуклеїнові кислоти, що кодують поліпептиди CD80 , CDS6, CD2S або CTLA-4 кішки, також вносять в клітини за допомогою рекомбінантних прийомів. Наприклад, таку послідовність вносять в клітину з допомогою мікроін'єкції, забезпечуючи гомологічну рекомбінацію за сайтом локалізації ендогенного гену, що кодує такий поліпептид, його 19 аналог або псевдоген, або послідовності, що характеризується істотним рівнем гомології з геном, що кодує CD80, CD86, CD28 або CTLA-4 кішки. Також можуть бути використані інші рекомбінантні методи, такі як забезпечення негомологічної рекомбінації і делегування ендогенного гену шляхом гомологічної рекомбінації, особливо в геномі плюрипотентної клітини. Даний винахід представляє спосіб посилення у кішки імунної відповіді на імуноген, що досягається введенням імуногену до, після або по суті одночасно з CD80 або CD86 кішки поряд з CD28 кішки або CTLA-4 кішки або без них в кількості, ефективній при підсиленні імунної відповіді. Даний винахід представляє спосіб посилення у кішки імунної відповіді на імуноген, що досягається введенням експресуючого вектора, який включає похідний від котячого патогену імуноген, до, після або по суті одночасно з CD80 або CD86 кішки поряд з CD28 кішки або CTLA-4 кішки або без них, в кількості, ефективній при підсиленні імунної відповіді. Даний винахід представляє спосіб перенаправления у кішки імунної відповіді на імуноген, що досягається введенням експресуючого вектора, який включає похідний від котячого патогену імуноген, до, після або по суті одночасно з CD80 або CD86 кішки поряд з CD28 кішки або CTLA-4 кішки або без них, в кількості, ефективній при підсиленні імунної відповіді. Даний винахід представляє спосіб пригнічення у кішки імунної відповіді на імуноген, що досягається введенням експресуючого вектора, який включає похідний від котячого патогену імуноген, до, після або по суті одночасно з CD80 або CD86 кішки поряд з CD28 кішки або CTLA-4 кішки або з антисмисловий РНК або ДНК, що кодує CD80 кішки, CD86 кішки, CD28 кішки або CTLA-4 кішки, в кількості, ефективній при пригніченні імунної відповіді. Даний винахід представляє вакцину для індукції у кішки імунної відповіді на імуноген(и), що містить імуноген і ефективну кількість CD80 кішки або CD86 кішки разом з CD28 кішки або CTLA-4 кішки або без них, для посилення імунної відповіді або CD80 кішки або CD86 кішки разом з CTLA-4 кішки для пригнічення імунної відповіді. У іншому здійсненні за даним винаходом представляється вакцина, що містить експресуючий вектор, що включає гени, що кодують імуноген(и) котячих патогенів, і гени CD80, CD86 разом з CD28 кішки або CTLA-4 кішки або без них, для посилення або пригнічення імунної відповіді. Поліпептиди CD80, CD86, CD28 або CTLA-4 кішки Ген CD80 кішки (кДНК і відповідна їй амінокислотна послідовність показані на Фіг.1 і 2) кодує поліпептид, що складається приблизно з 292 амінокислот. Ген CD86 кішки (кДНК і відповідна їй амінокислотна послідовність показані на Фіг.3) кодує поліпептид, що складається приблизно з 320 амінокислот. Ген CD28 кішки (кДНК і відповідна їй амінокислотна послідовність показані на Фіг.4) кодує поліпептид, що складається приблизно з 221 амінокислот. Ген CTLA-4 кішки (кДНК і відповідна 87470 20 їй амінокислотна послідовність показані на Фіг.5) кодує поліпептид, що складається приблизно з 223 амінокислот. Очищення CD80, CD86, CD28 або CTLA-4 кішки з натуральних або рекомбінантних джерел проводять із застосуванням методів, добре відомих в даній області техніки, включаючи, але тим самим не обмежуючись, іонообмінну хроматографію, обернено-фазну хроматографію на колонках С4, гель-фільтрацію, ізоелелектричне фокусування, афінну хроматографію і подібне. У переважному здійсненні велика кількість біологічно активного білка CD80, CD86, CD28 або CTLA-4 кішки отримують шляхом конструювання рекомбінантної послідовності ДНК, що включає кодуючу ділянку CD80, CD86, CD28 або CTLA-4 кішки, яка в загальній кодуючій рамці об'єднана з послідовністю, що кодує 6 С-кінцевих залишків гістидину в репліконі pSFVl (Gibco BRL). мРНК, що кодується цією плазмідою синтезують із застосуванням методів, добре відомих фахівцям в даній області техніки, і вносять в клітини лінії ВНК-21 методом електропорації. Клітини виробляють і секретують процесійовані глікозиловані поліпептиди CD80, CD86, CD28 або CTLA-4 кішки, що включають С-кінцевий гексагістидин. Модифіковані котячі поліпептиди CD80, CD86, CD28 або CTLA-4 очищають з клітинного супернатанту методом афінної хроматографії з використанням гістидин-зв'язуючої смоли (Hisbind: Novagen, Madison, WI). Поліпептиди CD80 кішки або CD86 кішки, виділені з будь-яких джерел, модифікують із застосуванням методів, відомих в даних області техніки. Наприклад, котячі CD80, CD86, CD28 або CTLA-4 фосфорилують або дефосфорилують, глікозилують або деглікозилують і подібне. Найбільш застосовними модифікаціями є ті, які змінюють розчинність, стабільність, а також специфічність і афінність зв'язування у CD80, CD86, CD28 або CTLA-4 кішки. Химерні молекули CD80, CD86, CD28 або CTLA-4 кішки Даний винахід охоплює отримання химерних молекул, що утворюються фрагментами котячих CD80, CD86, CD28 або CTLA-4 в будь-якому поєднанні. Наприклад, внесення сайту зв'язування CTLA-4 замість сайту зв'язування CD28 повинне підвищити афінність зв'язування CD28 із збереженням посиленої імунної відповіді. У одному здійсненні сайти зв'язування CD80 або CD86 на молекулах CTLA-4 і CD28 замінюються таким чином, що сайт зв'язування на CD28 замінюється на сайт зв'язування CTLA-4. Вплив химерної молекули CD28, що включає сайт зв'язування CTLA-4, пов'язаний з підвищенням афінності CD28 у відношенні CD80 або CD86 і підвищенням міри посилення імунної відповіді. У альтернативному здійсненні химерні молекули CD80 і CD28 або CD86 і CD28 або їх фрагменти є зв'язаними з мембранами формами і поліпшують властивості цих молекул при підсиленні імунної відповіді. У іншому здійсненні химерні молекули CD80 і CTLA-4 або CD86 і CTLA-4 або їх фрагменти є зв'язаними з мембранами формами, які є молекулами, більш ефективними при пригніченні 21 імунної відповіді. У іншому здійсненні химерні молекули CD80 і CTLA-4 або CD86 і CTLA-4 або їх фрагменти є зв'язаними з мембранами формами, які перенаправляють імунну відповідь з досягненням бажаного ефекту. Антитіла, специфічні у відношенні CD80, CD86, CD28 або CTLA-4 кішки Даний винахід охоплює антитіла, специфічні у відношенні поліпептидів CD80, CD86, CD28 або CTLA-4 кішки, ідентифікованих відповідно до описаного вище. Антитілами є поліклональні або моноклональні антитіла, що розділяють CD80, CD86, CD28 або CTLA-4 кішки і інші білки, що ідентифікують їх функціональні домени і подібне. Такі антитіла отримують стандартними способами за допомогою методів і композицій, описаних у Harlow & Lane, 1988, "Antibodies: A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Lab., а також з використанням імунологічних і гібридомних методів, відомих в даній області техніки. У разі використання нативних або синтетичних пептидів, похідних від CD80, CD86, CD28 або CTLA-4 кішки, для індукції у кішки CD80-, CD86-, CD28- або CTLA-4-специфічної імунної відповіді ці пептиди стандартним чином з'єднують з відповідним носієм, таким як гемоціанін слизня (KLH), і вводять з відповідним ад'ювантом, таким як ад'юванти Фройнда. Переважно відібрані пептиди з'єднують з носієм, маючим «лізинову серцевину», по суті відповідну методам Tan, 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85, 5409-5413. Такі антитіла, особливо так звані антиідіотипічні антитіла «внутрішньої відповідності», також приготовляють з використанням відомих методів. У одному із здійсненні очищені котячі CD80, CD86, CD28 або CTLA-4 використовують для імунізації мишей, після чого у них видаляють селезінку і спленоцити використовують для отримання клітинних гібридів з мієломними клітинами з метою отримання клонів секретуючих антитіло клітин у відповідаості зі стандартними методами даної області техніки. Отримані в результаті моноклональні антитіла, що секретуються такими клітинами, піддають скринінгу в тестах in vitro на наступну активність: зв'язування з котячими білками CD80, CD86, CD28 або CTLA-4, пригнічення активності CD80, CD86, CD28 або CTLA-4 за зв'язуванням рецепторів і пригнічення Т-клітинної стимуляторної активності CD80, CD86, CD28 або CTLA-4. Антитіла до CD80 кішки, до CD86 кішки, до CD28 кішки і до CTLA-4 кішки використовують для ідентифікації і кількісного аналізу котячих CD80, CD86, CD28 або CTLA-4, застосовуючи такі імунологічний тести, як ТІФА, РІА і подібне. Антитіла до CD80 кішки, до CD86 кішки, до CD28 кішки і до CTLA-4 кішки також використовують для імунологічного виснаження екстрактів CD80 кішки, CD86 кішки, CD28 кішки або CTLA-4 кішки. Крім того, ці антитіла можуть бути використані для ідентифікації, виділення і очищення котячих CD80, CD86,. CD28 або CTLA-4, що походять від різних джерел, і для досліджень за субклітинним і гістохімічним картируванням. Застосування 87470 22 Ліганд CD80 (В7-1) кішки, ліганд CD86 (В7-2) кішки, рецептор CD28 кішки або рецептор CTLA-4 (CD 152) кішки, вироблені відповідно за даним винаходом, можуть бути ефективно використані як вакцина для профілактики інфекційного захворювання або сприяння росту у гомологічних або гетерологічних видів котячих. Наприклад, коекспресія CD80 або CD86 з костимуляторними молекулами CD28 або CTLA-4 в будь-якому поєднанні з пухлинним антигеном або антигеном патогенного організму. Коекспресія CD80 або CD86 з кішки з рецептором CTLA-4 кішки забезпечує здатність пригнічувати активацію Т-лімфоцитів і пригнічувати імунну відповідь. Конкретним прикладом повинна бути коекспресія CD80 або CD86 з імуногенами, похідними від вірусів FIV, FeLV або FIP, з вірусного вектора або ДНК-експресуючого вектора, який, у разі введення у вигляді вакцини, буде активувати, посилювати або регулювати проліферацію CD4-позитивних і CD8-позитивниx Тлімфоцитів і індукувати вироблення імунорегуляторних цитокінів, таких як IL-2, IFN-g, IL-12, TNFa, IL-6 і т.п.Іншим конкретним прикладом повинна бути експресія CD80, CD86, CD28 або CTLA-4 з вірусного вектора або ДНК-експресуючого вектора, який, у разі введення у вигляді лікарського засобу, буде регулювати або перенаправляти імунну відповідь. Посилення імунітету за рахунок взаємодії котячих CD80 або CD86 з CD28 або CTLA-4 або пригнічення імунної відповіді за рахунок взаємодії котячих CD80 або CD86 з CTLA-4 забезпечує переваги в природному процесі регуляції в більшій мірі, ніж при доданні чужорідних субстанцій, які б надавали множинні і навіть шкідливі впливи на здоров'ї загалом або протягом тривалого часу. Молекули CD80, CD86, CD28 або CTLA-4 вводять нарівні з іншими рекомбінантними молекулами, такими як ті, які кодують антигени, що є бажаними з точки зору індукції імунітету. Ген CD80, CD86, CD28 або CTLA-4 кішки вбудовують до складу експресуючого вектора і інфікують ним або трансфіціюють клітину-мішень з подальшою експресією генного продукту в цій клітині-мішені так, що він прикріпляється до плазмалеми цієї клітини-мішені або антиген-презентуючої клітини або секретується у зовнішнє для цієї клітини-мішені або антигенпрезентуючої клітини середовище. Екпресуючий вектор, такий як плазміда, вірус Semliki Forest, поксивірус або герпесвірус, переносить ген в антиген-презентуючу клітину. Ген CD80, CD86, CD28 або CTLA-4 кішки або ффагменти цих генів в будьякому поєднанні вбудовують в склад ДНК- або РНК-експресуючого вектора і ін'єкують кішці з експресією даного генного продукту у кішки у вигляді «голої» ДНК/РНК або генетичної вакцини. Коекспресія імуногену і CD80, CD86, CD28 або CTLA-4 в клітині-мішені або в організмі кішки зумовлює активацію, посилену активацію або регуляцію Тлімфоцитів, В-лімфоцитів і інших клітин. З іншого боку, експресований білок може бути введений після експресії з плазміди. Котячі білки CD80, CD86, CD28 або CTLA-4 в нормі функціонують, будучи прикріпленими до мембрани клітини, як допоміжні молекули клітинної мембрани, але мо 23 жуть бути презентованими і в інших формах, зокрема, у відсутності в їх складі «мембранних якорів». У одному здійсненні CD80 кішки і CD86 кішки розчинні («вільні» в клітинних і позаклітинних рідинах) за рахунок втрати трансмембранного домену або гідрофобної ділянки і взаємодіють з костимуляторними молекулами CD28 або CTLA-4, що знаходяться або в зв'язаній з мембраною, або в розчинній формі. У іншому варіанті CD80 кішки і CD86 кішки знаходяться в зв'язаній з мембраною формі, а костимуляторні молекули CD28 або CTLA-4 - в розчинній формі, тобто не мають трансмембранного домену або гідрофобної ділянки. Розчинні CD28 або CTLA-4, що переважно знаходяться в формі димерів, застосовуються для лікування кішок, зв'язаного з імуносупресією, опосередкованої Т-клітинами. Розчинні CD28 або CTLA-4 запобігають відторганню пересадженої тканини і можуть бути використані для лікування аутоімунного захворювання. Конкретні розчинні CD28 або CTLA-4 застосовуються для профілактики реакції «трансплантат проти господаря» при пересадках кісткового мозку. Розчинні CD28 або CTLA-4 запобігають зв'язуванню клітини, несучої мембранні форми котячих лігандів CD80 або CD86. Структурно консервативні і функціонально консервативні варіанти ДНК і поліпептидів CD80, CD86, CD28 або CTLA-4 кішки або біологічно активний фрагмент або субфрагмент CTLA-4 об'єднують в загальній рамці зчитування з іншою послідовністю, такою як цитокін, інтерлейкін, інтерферон, колонієстимулюючий чинник, антиген патогенного мікроорганізму, антитіло або необхідна для очищення послідовність, така як полігістидинова мітка, або ген-репортер, такий як гени lacZ і uidA E.coli, або зелений флуоресцентний білок. Вакцини Даний винахід охоплює способи і композиції для підвищення ефективності імунної відповіді у домашніх кішок. У цьому здійсненні котячі CD80, CD86, CD28 або CTLA-4 використовують разом з імуногеном, відносно якого бажано індукувати імунну відповідь. Наприклад, до складу вакцин для кішок, що містять імуногени таких патогенів, як вірус імунодефіциту котячих і вірус лейкозу котячих, і інші патогенів, такі як парвовірус котячих, лептовірус котячих і коронавірус котячих, бажано включити CD80, CD86, CD28 або CTLA-4 кішки з метою регуляції міри і ефективності імунної відповіді. Для цієї мети котячі CD80, CD86, CD28 або CTLA-4, очищені з нативних або рекомбінантних джерел відповідно до описаного вище, включають до складу вакцинної композиції в концентрації, що знаходиться в діапазоні від приблизно 0,01 до 100,0мг на одну вакцинацію однієї кішки. Фахівцям в даній області техніки відомі комерційні джерела вакцин для кішок (Compendium of Veterinary Pharmaceuticals, 1997), які можуть бути використані в поєднанні з даним винаходом для отримання більш ефективної вакцини. Вакцина для індукції і регуляції у кішки імунної відповіді на імуноген містить імуноген і ефективну кількість CD80 кішки або CD86 кішки разом з CD28 кішки або CTLA-4 кішки або без них для посилення 87470 24 імунної відповіді або CD80 кішки або CD86 разом з CNLA-4 кішки для пригнічення імунної відповіді. Імуноген вибирають з групи, яка включає, тим самим не обмежуючись, котячі патогени, такі як вірус імунодефіциту котячих, вірус лейкозу котячих, вірус інфекційного перитоніту котячих, вірус панлейкопенії котячих (парвовірус), каліцивірус котячих, реовірус 3-го типу котячих, ротавірус котячих, коронавірус котячих (інфекційний перитоніт), вірус сказу, респіраторно-синцитіальний вірус котячих, вірус саркоми котячих, герпесвірус котячих (вірус ринотрахеїту), вірус хвороби Борна кішок, хламідії, Toxoplasma gondii, паразити кішок, Dirofilaria irmnitis, блохи, бактерійні патогени і подібне. Регуляція росту або регуляція активації клітинного типу, такого як Т-лімфоцит, визначає те, що регуляторна відповідь або стимулює, або пригнічує ріст клітин. Регуляція імунної відповіді у кішки визначає те, що ця імунна відповідь або стимулюється, або пригнічується в зв'язку з лікуванням захворювання або впливом на інфекційний агент у кішки. Експресія CD80, CD86, CD28 або CTLA-4 кішки окремо або в будь-якому поєднанні частин або цілого в складі експресуючого вектора, що включає ген (й) котячих імуногенів для цілей введення у вигляді генетичної вакцини або «голої ДНКвакцини». Векторами є, тим самим не обмежуючись, pTarget (Promega, Madison, WI), pcDNA (Invitrogen, Carlsbad, CA) (J.J. Donnelly et al., 1997; Hassett & Whitton, 1996). Гени або фрагменти генів CD80, CD86, CD28 або CTLA-4 окремо або в поєднанні, повнорозмірні або часткові, можуть бути вбудовані або трансфіційовані в геном кішки або іншого ссавця. Така інтеграція генів або фрагментів цих генів, яка може бути досягнута з використанням ретровірусного вектора, може бути використана для цілей генотерапії. Даний винахід представляє способи і композиції для підвищення стійкості до захворювання у домашніх кішок, для застосування в медичних і (або) комерційних цілях. У цьому здійсненні CD80, CD86, CD28 або CTLA-4 кішки, що експресуються окремо або в будь-якому поєднанні, повнорозмірні або часткові, і в поєднанні з генами, що кодують котячі імуногени, або без цього, вводять кішці з використанням відповідного способу введення. Для сприяння росту або стійкості до захворювання котячі CD80, CD86, CD28 або CTLA-4, що експресуються окремо або в будь-якому поєднанні, вводять у вигляді композиції в концентрації, що варіюється від приблизно 0,01 до 100,0мг на 1 дозу вакцини на 1 кішку, переважно в композиції в концентрації від приблизно 0,25мг/кг на день до приблизно 25мг/кг на день. Повинно бути зрозуміло, що потрібна кількість CD80, CD86, CD28 або CTLA-4 кішки може бути визначена за допомогою рутинних тестів, добре відомих в даній області техніки, так, щоб встановити схему дозування і частоти їх введення і порівняти групи експериментальних одиниць або суб'єктів за кожною точкою такої схеми. 25 Відповідно до даного винаходу нативпі або рекомбінантні котячі CD80, CD86, CD28 або CTLA-4 приготовляють з фізіологічне прийнятним носієм, таким як, наприклад, фосфатно-сольовий буфер або деіонізована вода. Дана композиція також може містити наповнювачі, включаючи мастячі компоненти, пластифікатори, підсилювачі поглинання, бактерициди і подібне, що добре відомо в даній області техніки. Поліпептиди CD80, CD86, CD28 або CTLA-4 кішки за даним винаходом вводять будь-яким ефективним шляхом, включаючи, тим самим не вичерпуючись, внутрішньовенний, підшкірний, внутрішньом'язовий, черезм'язовий, місцевий або пероральний шлях. Для підшкірного введення, наприклад, доза включає котячий CD80, CD86, CD28 або CTLA-4 в стерильному фізіологічному розчині. Для перорального або інгаляційного введення котячі CD80, CD86, CD28 або CTLA-4 упаковують на мікро- або макрорівнях, наприклад, в ліпосоми або мікросфери. Також можуть бути використані шкірні бляшки (або інші форми з повільною секрецією). ПРИКЛАДИ Приклад 1А Клонування кДНК CD80 (B7-1)-TAMU, CD86 (В7-2), CD28 і CTLA-4 кішки Послідовності котячих CD80 (В7-1), CD86 (В72), CD28 і CTLA-4 клонували спочатку шляхом ампліфікування методом ОТ-ПЛР (полімеразна ланцюгова реакція з ревертуванням, або із зворотною транскриптазою) ділянки між двома послідовностями, які досить консервативні для того, щоб сформувати вироджені праймери, взаємодіючі з котячою мРНК. Джерелом мРНК були моноядерні клітини периферичної крові (РВМС), простимульовані конканаваліном-А принаймні протягом 16 годин. Отриманий ПЛР-продукт секвенували. Отриману послідовність використовували для конструювання праймерів для RACE (швидка ампліфікація кДНК-кінців). 5'- Кінець ампліфікували спочатку з отриманням кДНК із зворотним праймером, комплементарним заново секвенованій консервативній ділянці. Олігонуклеотид лігували на 3'кінець кДНК (комплемент 5'-кінцю мРНК). Ця послідовність була сайтом зв'язування для прямого праймера, який сумісний за ПЛР із зворотним ПЛР-праймером, відповідним іншій ділянці нової секвенованої ділянки. Виродженні праймери використали в неодноразових циклах «гніздових» реакцій для отримання З'-кінцевої послідовності. Цей прямий праймер для ПЛР конструювали для взаємодії з послідовністю нового секвенованого сегмента. Продукти або секвенували напряму, або клонували в клонуючий вектор ТА і секвенували з отриманої плазміди. Повнорозмірну кодуючу рамку (ORF) клонували шляхом ампліфікації по всій її довжині з використанням праймерів, сконструйованих за параметрами відомих послідовностей. ORF клонували і секвенували тричі. ORF B7-1 субклонували в плазміду pSI, що включає промотор SV40, і плазміду SFV. Плазміду pSI використали для встановлення функціональної взаємодії B7-1 з котячим CD28. ДНК-праймери, що використовувалися для ОТ-ПЛР кДНК CD80 (В7-1) кішки, були такими: 87470 26 Прямий праймер: 5' CGCGGATCCGCACCATGGGTCACGCAGCAA AGTGGAAAAC-3' (SEQ ID NO: 11) Зворотний праймер: 5'CCTAGTAGAGAAGAGCTAAAGAGGC-3' (SEQ ID NO: 12) (див. вище повний перелік праймерів для кДНК CD28). ДНК-праймери, що використовувалися для ОТ-ПЛР кДНК CD28 кішки, були такими: Прямий праймер: 5'CGCGGATCCACCGGTAGCACAATGATCCTCAGG3' (SEQ ID NO: 13) Зворотний праймер: 5'CGCGGATCCTCTGGATAGGGGTCCATGTCAG-3' (SEQ ID NO: 14) (див. вище повний перелік праймерів для кДНК CD28). ДНК-праймери, що використовувалися для ОТ-ПЛР кДНК CTLA-4 кішки, були такими: 1. Вироджені праймери для першого ПЛРпродукту (672 нуклеотиду): Deg-5'-P: 5'-ATGGCTT(C)GCCTTGGATTT (C)CAGC(A)GG-3' (SEQ ID NO: 15) Deg-3'-Р: 5'TCAATTG(A)ATG(A)GGAATAAAATAAGGCTG-3' (SEQ ID NO: 16) 2. 5'- Кінцева послідовність CTLA-4 (455 нуклеотидів): вироджені ген-специфічні (GSP) «гніздові» ген-специфічні (NGSP) праймери: Перший раунд ПЛР: Deg-5'-P:5'TGTTGGGTTTC(T)G(A)CTCTG(A)CTT(C)CCTG-3' (SEQ ID NO: 17) 3'-GSP: 5'GCATAGTAGGGTGGTGGGTACATG3' (SEQ ID NO: 18) «Гніздова» ПЛР з ПЛР-продуктом, отриманим в першому раунді: Deg-5'-P:5'TGTTGGGTTTC(T)G(A)CTCTG(A)CTT(C)CCTG-3' (SEQ ID NO: 19) 3'-NGSP: S'-ACATGAGCTCCACCTTGCAG- 3' (SEQ ID NO: 20). 3. 3'- Кінцева послідовність CTLA-4: адапторний праймер-1 (API; Clontech Lab. Inc., Palo Alto, CA); «гніздовий» адапторний праймер (АР2; Clontech Lab.), ген-специфічний праймер (GSP) і «гніздовий» ген-специфічний праймер (NGSP): 3'-RACE: АРІ: 5'CCATCCTAATACGACTCACTATAGGGC-3' (SEQ ID NO: 21) 5'-GSP: 5'-GTGAATATGGGTCTTCAGGCAATG3' (SEQ ID NO: 22) 3'- Гніздова RACE з продуктом 3'-RACE: АР2: 5'-ACTCACTATAGGGCTCGAGCGGC-3' (SEQ ID NO: 23) 5'-NGSP: 5'GAAATCCGAGTGACTGTGCTGAG-3' (SEQ ID NO: 24). 4. Праймери для повнорозмірного гену CTLA4: Fel CTLA-4 5'-праймер: 5'AACCTGAACACTGCTCCCATAAAG-3' (SEQ ID NO: 25) 27 Fel CTLA-4 3'-праймер: 5'GCCTCAGCTCTTAGAAATTGGACAG-3' (SEQ ID NO: 26). ДНК-праймери, що використовувалися для ОТ-ПЛР кДНК CD86 (В7-2) кішки, були такими: 1. Вироджені праймери для першого ПЛРпродукту (423 нуклеотиду): Deg-5'-P: 5'-TAGTATTTTGGCAGGACCAGG-3' (SEQ ID NO: 27) Deg-3'-Р: 5'-CTGTGACATTATCTTGAGATTTC3' (SEQ ID NО: 28). 2. Вироджені праймери для другого ПЛРпродукту (574 нуклеотиду): Deg-5'-P:5'GA(G)CA(T)GCACT(A)ATGGGACTGAG-3' (SEQ ID NO: 29) Deg-3'-Р: 5'-CTGTGACATTATCTTGAGATTTC3' (SEQ ID NO: 30). 3. 5'- Кінець CD86: API, AP2 (Clontech Lab.), вироджений 3'- ген-специфічний (GSP) і 3'«тніздовий» ген-специфічний (NGSP) праймери: 5'-RACE: AP1: 5'CCATCCTAATACGACTCACTATAGGGC-3' (SEQ ID NO: 31) 3'GSP; 5'TGGGTAACCTTGTATAGATGAGCAGGTC-3' (SEQ ID NО: 32). «Гніздова» 5'-RACE з ПЛР-продуктом 5'-RACE: AP2: 5'-ACTCACTATAGGGCTCGAGCGGC-3' (SEQ ID NO: 33) 3'-NGSP: 5'CACCTTCACTCAACTTACCAACCAC-3' (SEQ ID NО:34). 4. 3'-Кінцева послідовність В7-2: праймери API, AP2, 5'-GSP і 5'-NGSP: 3'-RACE: AP1: 5'CCATCCTAATACGACTCACTATAGGGC-3' (SEQ IDNO: 35) 5'GSP: 5'GGACAAGGGCACATATCACTGTTTC-3' (SEQ ID N0:36). «Гніздова» 3'-RACE з ПЛР-продуктом 3'-RACE: AP2: 5'-ACTCACTATAGGGCTCGAGCGGC-3' (SEQ ID NO: 37) 5'NGSP: S'CAGTGCTTGCTAACTTCAGTCAACC-З' (SEQ ID NО: 38). Повнорозмірний ген CD86: Прямий праймер Fel-B72 (I): 5'CGGGAATGTCACTGAGCTTATAG-3' (SEQ ID NO: 39) Зворотний праймер Fel-B72 (1176): 57GATCTTTTTCAGGTTAGCAGGGG-3' (SEQ ID NO: 40). Приклад 1В Клонування CD80 (B7-l)-Syntro/SPAH; плазміда 917-19-8/16 Відбирали клітини котячої селезінки і культивували їх з конканаваліном-А протягом 5 годин. Після цього клітини центрифугували, промивали в ФСБ і використовували для виділення тотального пулу РНК в системі RNeasy (Qiagen). Тотальну РНК обробляли ДНКазою-1 (Boehringer Mannheim) 87470 28 з метою видалення ДНК, що забруднює препарат РНК. Потім з цих препаратів виділяли мРІ-ІК з використанням кульок Oligotex (Qiagen, Santa Clara, CA) і високошвидкісних колонок. З матриць мРНК синтезували ДНК-копії в присутності випадкових гексамерів, dNTP, RNAsin, зворотної транскриптази (Promega) і зворотно-транскриптазного буфера (Promega) з інкубацією протягом 30 хвилин при 42°С. Потім для отримання дволанцюгових молекул повнорозмірного кДНК-клону кодуючої рамки (ORF) B7-1 кішки застосовували ПЛР зі смисловим праймером 5/97.50 (5'ATGGGTCACGCAGCAAAGTG-3') (SEQ ID NO: 41) і антисмисловим праймером 5/97.51 (5'CTATGTAGACAGGTGAGATC-3') (SEQ ID NO: 42), dNTP, кДНК В7-1 (перший ланцюг), сульфатом магнію, полімеразою Vent (Gibco BRL) і Ventполімеразного буфера (Gibco BRL). Умови ПЛР: 1 цикл 15 секунд при 94°С; 35 циклів - 30 секунд при 94°С, 2 хвилини при 48°С, 2 хвилини при 72°С; 1 цикл добудування при 72°С протягом 10 хвилин. ПЛР здійснювали в 1%-вій низькоплавкій агарозі і виділяли ДНК-фрагменти, відповідні очікуваному розміру ORF B7-1, очищали в гелі (набір реактивів для гель-очищення Qiagen, Santa Clara, CA) і клопували в плазміду pCR-BLUNT з використанням набору Zero Blunt PCR Cloning Kit (Invitrogen, San Diego, CA). ДНК, екстраговану з резистентних до канаміцину бактерійних колоній, піддавали попередньому скринінгу на присутність унікального Nhel-сайту (що є в складі CD80 [B7-1]-)(TAMU кішки). Вставки розміром 800-900 пар нуклеотидів (п.н.), що мали Nhel-сайт, секвенували методом флуоресцентного автоматичного секвеиування на відповідному обладнанні фірми Perkin-Elmer-Cetus (Applied Biosystems Inc.). Плазмідпий вектор і B7-1, генспецифічні праймери, похідні від раніше клонованого гену B7-1, використали для отримання послідовності pCR-Blunt: праймери - 1/97.36 (5'CAGGAAACAGCTATGAC-3') (SEQ ID NO: 43) і 1/97.37 (5'-AATACGACTCACTATAGG-3') (SEQ ID NO: 44). Специфічні для гену B7-1 праймери 12/96.22 (5'-ААСАССАТТТСАТСАТССТТТ-3') (SEQ ID NO: 45), 1/97.33 (5'ATACAAGTGTATTTGCCATTGTC-3') (SEQ ID NO: 46), 12/96.20 (5'-AGCTCTGACCAATAACATCA-3') (SEQ ID NO: 47), 12/96.21 (5'ATTAGAAATCCAGTTCACTGCT-3') (SEQ ID NO: 48), 1/97.32 (5'-TCATGTCTGGCAAAGTACAAG-3' ) (SEQ ID NO: 49), 11/96.32 (5'ATTCACTGACGTCACCGA-31' ) (SEQ ID NO: 50) 11/96.31 (5'-AAGGCTGTGGCTCTGA-3') (SEQ ID NO: 51). Були ідентифіковані два клони, які включають повнорозмірну послідовність CD80, відповідну початковій послідовності CD80, за винятком двох точкових мутацій. Одна така мутація амінокислотну послідовність не змінювала. Інша мутація приводила до заміни лейцину на ізолейцин. Отриманий внаслідок клон CD80 кішки був позначений 917-19.8/16 (CD80-Syntro/SPAH). Для полегшення клонування гену CD80 (В7-1) кішки, що знаходиться за будь-яким промотором вірусу віспи (поксивірусу), включаючим EcoRI- і ВатНІ-сайти клонування, два нових праймери були сконструйовані таким чином, щоб внести рестрик 29 ційні EcoRI- і ВатНІ-сайти клонування за 5'- і 3'кінцями кодуючої рамки CD80, відповідно. Ці два праймери були такими: прямий праймер 1/97.43 (5'-TGCAGAATTCGGGTCACGCAGCAAAGTGG-3') (SEQ ID NO: 52) і зворотний праймер 1/97.6 (5'GCTAGGATCCAATCTATGTAGACAGGTGAGAT- 3') (SEQ ID NO: 53). Отриманий ПЛР-фрагмент розщеплювали рестриктазами EcoRI і ВатНІ і клонували до складу вектора OIL-SPY (за АссІ-сайтом в послідовності геномного HindIII-фрагмента М поксвірусу свиней - SPV) з отриманням рекомбінантного вірусу SPV. У результаті була отримана касета 930-23. А1 - вектор O1L-SPY, що включає кодуючу рамку CD80 кішки, що знаходиться за синтетичним «пізно-раннім» промотором LP2EP2 геному SPV і що примикає до касети маркерного гену lacZ E.coli, що знаходиться під контролем синтетичного промотора пізнього гену LP2. Плазмідний вектор 930-23. А1 котрансфікували разом з SPV-001 з отриманням рекомбінантного вірусу SPV, експресуючого білок В7-1 кішки і bгалактозидазу E.coli. Приклад 1C Субклоновані CD28 в гомологічпиі'і ноксивірусному геному вектор Кодуючий сегмент гену CD28 ампліфікували з допомогою ПЛР з синтетичними праймерами, що включають стандартні сайти клонування, що повинно полегшити клонування CD28 за будь-яким промотором геному поксивірусу в ході конструювання специфічного вектора, гомологічного поксвірусу. Синтетичні праймери були сформовані так, щоб внести EcoRI- і BglII-сайти клонування за 5'- і 3'-кінцями ПЛР-фрагмента, відповідно. Ці два праймери були такими: прямий праймер 7797.1 (5'GATGAATTCCATGATCCTCAGGCTGGGCTTCT-3') (SEQ ID NО: 54) і зворотний праймер 7/97.2 (5'GATCAGATCTCAGGAACGGTATGCCGCAA-3') (SEQ ID NO: 55). Отриманий внаслідок проведення ПЛР ДНК-фрагмент розщеплювали рестриктазами EcoRI і BglII і клонували до складу вектора 01LSPV з метою отримання рекомбінантного поксвірусу. Була отримана касета 930-26. А1 - вектор 01L-SPV, що включає (за АссІ-сайтом у послідовності геномного HindIII-фрагмента М поксвірусу свиней) кодуючу рамку CD28 кішки, що знаходиться за синтетичним «пізно-раннім» промотором LP2EP2 геному SPV і що примикає до касети маркерного гену lacZ Е.соїі, що знаходиться під контролем синтетичного промотора пізнього гену LP2. Гомологічний плазмідний вектор 930-26. А1 котрансфікували разом з SPV-001 з отриманням рекомбінантного вірусу SPV, експресуючого білок CD28 кішки і b-галактозидазу Е.соїі. Приклад 2 Характеристика кДНК і поліпептидів CD80 (B71)-TAMU, CD86 (В7-2), CD28, CTLA-4 і CD80 (B7-l)Syntro/SPAH кішки Виділена і очищена кДНК CD80 (В7-1) кішки довжиною приблизно 941 нуклеотидів складає відкриту рамку, що кодує котячий поліпептид CD80, що складається приблизно з 292 амінокислот, у вигляді нативної зв'язаної з мембраною або зрілої форми з молекулярною масою приблизно 33,485 кДа, ізоелектричною точкою 9,1 і сумарним 87470 30 зарядом 10,24 при рН=7,0. Трансмембранний домен цього білка орієнтовно доводиться на амінокислоти 241-271. Котячі CD80-TAMU і CD80-Syntro/SPAH - це кДНК і відповідні поліпептиди, які були виділені незалежно один від одного з двох різних джерел, і при цьому їх нуклеотидні і амінокислотні послідовності трохи розрізнюються. Джерелом мРНК CD80TAMU були моноядерні клітини периферичної крові кішки, простимульовані конканаваліном-А, а джерелом мРНК CD80-Syntro/SPAH були спленоцити кішки, простимульовані конканаваліном-А. Відмінність за послідовністю кДНК між CD80-TAMU і CD80-Syntro/SPAH пов'язана з нуклеотидними замінами Т®С в 351-м положенні і С®А в 670-м положенні. За амінокислотною послідовністю заміна 351-го нуклеотиду є несмисловою, а заміна 670-го нуклеотиду приводить до заміни нейтральної амінокислоти на нейтральну - лейцину на ізолейцин - в 224-м положенні поліпептиду. Виділена і очищена кДНК CD86 (В7-2) кішки складається приблизно з 1176 нуклеотидів, відповідаючи відкритій рамці, кодуючої поліпептид CD86 кішки, що складається з приблизно 320 амінокислот, у вигляді нативної пов'язаної з мембраною або зрілою формою з молекулярною масою приблизно 36,394кДа, ізоелектричною точкою 9,19 і сумарним зарядом 11,27 при рН=7,0. Виділена і очищена кДНК CD28 кішки складається приблизно з 689 нуклеотидів, відповідаючи відкритій рамці, кодуючої поліпептид CD28 кішки, що складається з приблизно 221 амінокислоти, у вигляді нативної пов'язаної з мембраною або зрілою формою з молекулярною масою приблизно 25,319кДа, ізоелектричною точкою 9,17 і сумарним зарядом 9/58 при рН=7,0. Виділена і очищена кДНК CTLA-4 кішки складається приблизно з 749 нуклеотидів, відповідаючи відкритій рамці, кодуючої поліпептид CTLA-4 кішки, що складається з приблизно 223 амінокислот, у вигляді нативної пов'язаної з мембраною або зрілою формою з молекулярною масою приблизно 24,381кДа, ізоелектричною точкою 6,34 і сумарним зарядом - 0,99 при рН=7,0. Коекспресія CD80 з костимуляторною молекулою CD28 або CTLA-4 і з пухлинним антигеном або антигеном патогенного організму зумовлює здатність активувати або посилювати активацію Тлімфоцитів, зокрема, лімфоцитів пулу Th-1, і активувати ріст інших типів клітин. Коекспресія CD80 з костимуляторною молекулою CTLA-4 зумовлює здатність пригнічувати активацію Т-лімфоцитів, зокрема, лімфоцитів пулу Th-1. Коекспресія CD86 з костимуляторною молекулою CD28 або CTLA-4 і з пухлинним антигеном або антигеном патогенного організму зумовлює здатність активувати або посилювати активацію Т-лімфоцитів, зокрема, лімфоцитів Th-1, і активувати ріст інших типів клітин . Коекспресія CD86 з костимуляторною молекулою CTLA-4 зумовлює здатність пригнічувати активацію Т-лімфоцитів, більш конкретно лімфоцитів Th-1. 31 87470 Рівень ідентичності нуклеотидних іамінокислотних послідовностей 1 Гомолог людини (%ідентичності нуклеотидної послідовності) 1 Гомолог людини (%ідентичності амінокислотнеї послідовності) Гомолог миші (%ідентичності нуклеотидної послідовності) Гомолог кролика (%ідентичності нуклеотидної послідовності) Гомолог кролика (%ідентичності нуклеотидної послідовності) Гомолог курки (% ідентичності нуклеотидної/аміно кислотної послідовності) Приклад 3 Використання котячих CD80 (В7-1), CD86 (В72), CD28 і CTLA-4 у вакцинах Наступні експерименти були проведені з метою оцінки, що підсилює імунітет активності котячих CD80, CD86, CD28 і CTLA-4 в складі вакцин для кішок. У одній з процедур кішкам у віці 8 тижнів внутрішньом'язово ін'єкували по 100 мкг плазміди, що включає кДНК, що кодує котячі молекули CD80, CD86, CD28 і CTLA-4, в суміші з плазмідою, що включає кДНК вірусних генів env і gag вірусу FIV або env і gag вірусу FeLV, або, з іншого боку, внутрішньом'язово ін'єкували по 100мкг плазміди, що включає кДНК, експрессируючої попарні комбінації CD80/CD28 або CD80/CTLA-4, або CD86/CD28, або CD86/CTLA-4, в суміші з плазмідою, що включає кДНК вірусних генів env і gag (FIV) або env і gag (FeLV). Контрольні особини ін'єкцій CD80, CD86, CD28 і CTLA-4 не отримували. Кішок заздалегідь заражали вірулентними штамами FeLV або FIV і аналізували симптоми захворювання відповідно до описаного вище. Внаслідок початкового інфікування було встановлено, що кішки, яким вводили вектор з кДНК котячих CD80, CD86, CD28 і CTLA-4 і вектор з кДНК генів FIV або генів FeLV, виявили 100%-ву захищеність від захворювання в порівнянні з тваринами, яким вводили тільки вектор, що включає кДНК генів FIV або генів FeLV: в цій групі стійкість до захворювання становила 75%. У іншій процедурі кішкам у віці 8 тижнів внутрішньом'язово ін'єкували від 0,1 до 100мг очищеного білка котячих молекул CD80, CD86, CD28 і CTLA-4 або, в іншому варіанті, - попарні комбінації CD80 або CD86 в поєднанні з CD28 або CTLA-4, з використанням рекомбінантних векторів, що включають кДНК, описаних вище, а також внутрішньом'язово ін'єкували від 0,1 до 100мкг вакцини, що містить білки env і gag вірусу FIV або білки env і gag вірусу FeLV. Контрольним особинам ін'єкцій CD80, CD86, CD28 і CTLA-4 не проводили. Кішок заздалегідь заражали вірулентними штамами FeLV або FIV і регулярно аналізували розвиток захворювання у них. Отримані результати показали істотно знижену захворюваність у кішок, яким вводили очищений білок CD80, CD86, CD28 і CTLA-4 разом з вірусною вакциною FIV або FeLV, в порівнянні з кішками, що отримували вакцину, що містить тільки білки FIV або FeLV. Приклад 4 32 CD80 CD86 CD28 CTLA-4 кішки кішки кішки кішки 2 3 4 5 77 72 85 88 2 3 4 5 59 68 82 88 62 77 79 46 74 78 67/64 84/84 59/50 Використання котячих CD80 (В7-1), CD86 (В72), CD28 і CTLA-4 для пригнічення і запобігання росту пухлинних клітин Пухлинні клітини кішки трансфікували вектором, експресуючим CD80 або CD86 кішки в поєднанні або з CD28, або з CTLA-4. Трансфіковані пухлинні клітини знову вводили тій же кішці, і присутність CD80, CD86, CD28 і CTLA-4 на поверхні пухлинної клітини посилювала неспецифічну імунну відповідь у відношенні і трансфікованих, і нетрансфікованих пухлинних клітин, що приводило до знищення локалізованих і метастазуючих пухлинних клітин. У іншій процедурі вектори, експресуючі CD80 або CD86 кішки в поєднанні або з CD28, або з CTLA-4, безпосередньо ін'єкували кішці в пухлину, внаслідок чого спостерігалася неспецифічна імунна відповідь відносно пухлинних клітин, що приводила до знищення як локалізованих, так і метастазуючих пухлинних клітин. Приклад 5 Клоновані і секвеновані кДНК CD80 кішки Вступ У доповнення до цитокінів деякі поверхневоклітинні молекули, як було показано, можуть посилювати або пригнічувати певну імунну відповідь. CD80 (В7-1) є допоміжною молекулою, яка зв'язується на відповідному їй рецепторі на поверхні Тлімфоцитів (Freeman et al., 1989). Така взаємодія забезпечує доставку повторних стимулів, що в поєднанні з первинним сигналом, опосередкованим розпізнаванням Т-клітинним рецептором антигену, презентованого з участю молекул МНС, зумовлює активацію і проліферацію Т-клітин (Allison & Lanier, 1994). Хоча білок CD80 уперше був описаний як антиген В-лімфоцитів, потім було встановлено, що він експресується рядом клітинних типів, в основному, що мають властивість презентування антигену (Freeman et al., 1989). У приматів і гризунів молекула CD80 - поліпептид з молекулярною масою 60кДа, що складається приблизно з 290 амінокислот (Freedman et al., 1987; Freeman et al., 1989). Підтвердження передбачуваної амінокислотної послідовності вказує на характеристики, у відповідності з якими вона є членом імуноглобулінового суперсімейства (IgSF) (Peach et al., 1995). Вона складена двома позаклітинними імуноглобуліно-подібними (IgSF) доменами, гідрофобним трансмембранним доменом і коротким цитоплазматичним «хвостом» (Freeman et al., 1989). Позаклітинний домен зрілого білка складається з 124 N-кінцевих залишків варіабельного (V) IgSF-домену і потім з 100 амінокислот константного (С-подібного) IgSF-домену (Freeman 33 et al., 1989). У складі гомолога CD80 людини є 8 потенційних сайтів М-глікозилування, і, хоч зрілий білок характеризується істотним рівнем глікозилування, ці вуглеводні залишки, як вважається, не пов'язані з процесами зв'язування з рецепторами CD28 або CTLA-4, тому що вони орієнтовані в протилежну від передбачуваного домену зв'язування сторону (Bajorath et al., 1994). Більш того видалення вуглеводних залишків, мабуть, не впливає на здібність до зв'язування, в зв'язку з чим передбачається, що їх функції пов'язані з підвищенням розчинності позаклітинної частини даної молекули (Linsley et al., 1994a). CD80 зв'язується на двох різних рецепторах, експресованих в різний час процесу Т-клітинної активації. Рецептор CD28 виявляється у різних тімоцитів, «наївних» і активованих Т-клітин, і для нього була продемонстрована участь в активації і проліферації Т-клітин (Aruffo, 1987). Другий рецептор для CD80 - CTLA-4 - звичайно виявляється пізніше на повністю активованих Т-клітинах (Linsley et al., 1991b). Хоча роль CTLA-4 поки точно не визначена, передбачається, що ця молекула може діяти як чинник супресії активної, що вже є Т-клітинної відповіді (Hutchcroft & Bierer, 1996). Сама молекула CD80, мабуть, не здібна до передавання сигналу. Її цитоплазматичний сегмент відносно малий і не включає амінокислот, для яких була б підтверджена сигнальна і каталітична функція (Hathcock et al., 1994). Відсутність консерватизму в структурі цитоплазматичних ділянок у пептидів людини і миші також узгодиться з вірогідною відсутністю сигнальних функцій у білка CD80, який активний лише при зв'язувані з рецепторами CD28 або CTLA-4 (Linsley et al., 1994a). Взаємодія між CD80 і CD28, як було показано, є необхідною для переходу «наївних» Т-клітин в активований стан, що ініціює первинну Т-клітинну відповідь (Damie et al., 1988). Хоча CD80 був уперше знайдений на активованих В-клітинах (Freedman et al., 1987), після цього він був виявлений у більшості груп специфічних антигенпрезентуючих клітин, включаючи макрофаги і моноцити (Freedman et al., 1987), клітини Лангерганса (Symington et al., 1993), дендритні клітини (Liu et al., 1992), активовані Т-клітини (Razi-Wolfet al., 1992) і різні пухлинні клітини (Chen et al., 1992). Присутність молекули CD80 на клітинах АРС, як було підтверджено, є важливою для активації і CD4-пoзитивниx, і CD8-позитивних Т-клітин (Allison & Lanier, 1994; Bellone et al., 1994). Хоч ця молекула в нормі в значній кількості присутня тільки на специфічних АРС, в лініях клітин деяких пухлин було встановлене посилення вироблення сигнальної молекули (Chen et al., 1992). Передбачається, що внаслідок трансформації в деяких пухлиннородних лініях має місце посилення експресії CD80. У цих пухлинних лініях, похідних не від антиген-презентуючих клітин, рівно як і в деяких іморталізованних клітинних лініях CD80 є поверхневим білком, експресрованим на такому рівні, який достатній для зумовлення повної активації Т-клітин (Chen et al., 1992). Хоча кінетика експресії не чітка, можливо, похідна від пухлинних клітин CD80 може бути відповіддю на 87470 34 «онкогенний шок» і відображати еволюційний механізм, за допомогою якого імунна система здатна видаляти трансформовані або пухлиннорідні клітини (Antonia et al., 1995). Роль взаємодії CD28-B7 вважається ключовою в процесі первинної активації Т-клітин. Розпізнавання антигену з участю молекул МНС Тклітинними рецепторами недостатнє для ініціації оптимальної проліферації і активації Т-клітин (Schwartz, 1992). TCR-стимуляція при відсутності допоміжних сигналів може приводити до анергії або зниження реактивності Т-клітинних популяцій (Jenkins et al., 1987). Зв'язування молекули CD28 на Т-клітині з молекулою CD80 на антигенпрезентуючій клітині розглядається як передавання другого сигналу, необхідного для Т-клітинної активації (Schwartz, 1992). Коли рецептори TCR завантажені, у відсутність такого другого сигналу «наївні» клітини не активуються і можуть стати анергічними (Lanier et al., 1995). Така принципова роль взаємодії CD28-CD80 була виразно виявлена не тільки для процесу активації «наївних» клітин CD4+, але також і в клонах CD4+ Тh1 і Th2 і для «наївних» Т-клітин CD8+ похідних від малих лімфоцитів периферичної крові, що знаходяться в стані спокою (Linsley et al., 1993а). Як і у випадку з сімейством рецепторів CTLA4/CD28, також є принаймні ще один додатковий рецептор, що має відношення до CD80. Дослідження, в яких намагалися виявити значення CD80 для первинної імунної відповіді, поставили ряд питань через те, що, хоч внесення CTLA-4Ig пригнічувало імунні відповіді, навпаки, додання моноклонального антитіла (mAb) до CD80, як здавалося, не зумовлювало схожого ефекту (Lenschow et al., 1993). При отриманні лінії мишей, «вимкнених» за геном CD80, несподівано була встановлена наявність другого рецептора CTLA4/CD28 (Freeman et al., 1993). Передбачили, що такі миші повинні мати схожий фенотип з раніше отриманими мишами, «вимкненими» за CD28, у яких була неадекватна Т-клітинна відповідь (Freeman et al., 1993). Однак було встановлено, що «вимкнені» за CD80 миші формують нормальну відповідь, а їх клітини АРС здатні формувати повторний сигнал, необхідний для дозрівання Тклітин (Freeman et al., 1993). На основі цих даних було передбачено існування другого рецептора, який зрештою і був виділений. Подальше виявлення родинного рецептора CD86 (В7-2 або В7-0), як представляється, знімає ту суперечність, яка виникла в аналізі «вимкнених» за CD80 мишей, а в поєднанні зі схожістю структури і параметрів зв'язування воно вказує на можливість того, що ці молекули характеризуються спільністю функцій і походження (Hathcock et al., 1994). CD86 (В7-2) виявляє певний рівень схожості з CD80, зокрема, за структурою позаклітинних доменів IgSF-V і IgSF-C (Freeman et al., 1993). Сумарний рівень гомології цих молекул, однак, менший за 25%, при тому, що консервативні залишки зосереджені на протилежних кінцях обох позаклітинних доменів (Bajorath et al., 1994). Хоч зв'язуючий сегмент не був встановлений ні для однієї з цих молекул, гомологія послідовностей дозволила виді 35 лити ділянку, перспективну з точки зору встановлення потенційної сайту взаємодії (Linsley et al., 1994a). Незважаючи на відсутність консерватизму, CD80 і CD86 характеризуються схожими параметрами зв'язування на обох рецепторах, хоч CD86 характеризується більш швидким вивільненням з рецептора CTLA-4 (Linsley et al., 1995a). CD86, мабуть, характеризується схожими параметрами експресії в порівнянні з CD80, будучи експресрованим на активованих В-клітинах, Тклітинах, макрофагах і моноцитах (Azuma et al., 1993а). Однак, динаміка експресії цих двох молекул в невеликій мірі розрізнюється (Hathcock et al.,1994). Загалом, CD86 з'являється раніше в процесі активної імунної відповіді в порівнянні з CD80 і можливо експресується моноцитами за конститутивним типом (Freeman et al., 1991). Хоча CD80 може з'являтися через 24 години після початкової стимуляції, CD86 з'являється на ранньому етапі відповіді або взагалі експресується мієлоїдними клітинами постійно на невисокому рівні (Hathcock et al., 1994). Ці два поверхневих білки зумовлюють схожі внутрішньоклітинні реакції, будучи зв'язані на відповідних ним рецепторах на поверхні Т-клітин як CD4+, так і CD8+ (Lanier et al.,1995). Мабуть, відсутні будь-які відмінності в здатності кожної з цих молекул ініціювати активацію і проліферацію Т-клітин або індукувати активність CTL (Hathcock et al., 1994). Таким чином, дані, що є підтверджують, що обидві молекули ініціюють схожий сигнальний каскад після їх зв'язування рецепторами CD28 або CTLA-4, відповідно (Hathcock et al., 1994). Хоч, як представляється, кінетика зв'язування обох цих молекул зі своїми рецепторами однакова і при цьому відсутні будьякі прояви, що розрізнюються, поки не зрозуміле еволюційне значення існування такої системи «пара лігандів/пара рецепторів» (Lanier et al., 1995). CD80 спочатку був описаний як маркер Вклітин, і високі рівні і CD80, і CD86 виявляються на В-клітинах, стимульованих ліпополісахаридом (ЛПС), анти-Ig, анти-CD40, конканаваліном-А (КонА), цАМФ, IL-2 і IL-4 (Hathcock et al., 1994). Як було показано, в В-клітинах мишей 7-інтерферон і IL-5 посилюють вироблення CD86, хоч поки немає аналогічних даних для людини або для CD80 в зв'язку з вказаними імунорегуляторами (Azuma et al., 1993а). Динаміка експресії в В-клітинах у цих двох молекулах декілька різна. CD86 експресується майже відразу після стимуляції (6 годин), в той час як CD80 відсутній майже 24 години і аж до 48-ї години не досягає піку своєї експресії (Lenschow et al., 1993). Вважається, що позитивна регуляція CD80 на В-клітинах знаходиться під контролем сигнальних механізмів, опосередкованими молекулами класу II МНС (Nabavi et al., 1992). Два інших поверхнево-клітинних рецепторів також, мабуть, важливі в зв'язку з експресією CD80. Перехресне зв'язування CD40, експресованого на В-клітинах, з Ig або Т-клітинами, експресуючими відповідний рецептор, зумовлює посилення експресії CD80 (Azuma et al., 1993Ь), в той час як перехресне зв'язування Fc-рецептора зумовлює 87470 36 зниження експресії обох молекул (Вагсу et al., 1995). CD40 і ліганд цього рецептора CD40L, як передбачалося, є елементами механізму, що бере участь в регуляції експресії CD80 на клітинах АРС (Page et al., 1994). CD40 експресований в різних типах клітин, включаючи В-лімфоцити, моноцити, дендритні клітини, фібробласти і ендотеліальні клітини людини, і може позитивно регулюватися на цих клітинах з присутністю g-інтерферону (de Boer et al., 1993). Ліганд CD40 (CD40L) експресується активованими СD4-позитивними Т-клітинами. Зв'язування CD40 і CD40L, як було показано, посилює експресію CD80 клітинами АРС, хоч, мабуть, це не індукує експресію в інших типах клітин, експресуючих даний рецептор, включаючи ендотеліальні клітини (Page et al., 1994). Молекули CD80 і CD86, хоч і виявляють лише 25%-вий рівень амінокислотної схожості одна з одною, мають структурну схожість і розглядаються як «віддалено-родинні» (Freeman et al., 1993). Гомологічні залишки сконцентровані в складі імуноглобуліно-подібних доменів при невеликій кількості консервативних залишків в складі трансмембранного і цитоплазматичного доменів (June et al., 1995). Передбачається, що сімейство, що включає продукти генів В7, також, в доповнення до CD80 і CD86, охоплює бутирофілін (ВТ), глікопротеїн мієлін/олігодендроцитів (MOG), МНС-аналог курки B-G (Linsley et al., 1994b). ВТ, MOG і B-G кодуються генами, що входять в геномний комплекс МНС, що вказує на вірогідний еволюційний зв'язок між головним комплексом гістосумісності і необхідними костимуляторними молекулами (Linsley et al., 1994b). Т-лімфоцити миші, що знаходяться в стані спокою і людини на низькому рівні експресують CD86, в той час як Т-клітини миші і людини (і Тклітинні клони), активовані дією антитіл до CD3, експресують CD80 і CD86 на істотному рівні (Hathcock et al., 1994). Експресія і CD80, і CD86 на активованих Т-клітинах може відображати здатність цих Т-клітин проліферувати за механізмом аутокринної костимуляції (Azuma et al., 1993b). Цікаво, що, як було показано, CD80 позитивно регулюється на ВІЛ-інфікованих CD4-позитивних Т-клітинах при одночасній негативній регуляції CD28. Передбачається, що це є вірогідним механізмом вірусного передавання у випадку, коли неінфіковані Т-клітини CD4+ ініціюють опосередкований взаємодією CD28/CD80 контакт з інфікованими лімфоцитами (Haffar et al., 1993). Моноцити периферичної крові людини на низькому рівні експресують CD80 і на високому рівні - CD86, в той час як обробка чинником GM-CSF або g-інтерфероном приводить до інтенсифікації поверхневої експресії і CD80, і CD86 (Вагсу et al., 1995). ЛПС є могутнім індуктором експресії CD80 в моноцитах периферичній крові людини (Schmittel et al., 1994). Поки немає даних про очеревинні макрофаги людини, в той час як відомо, що макрофаги миші, що перебувають в стані спокою експресують CD80 і CD86 на низьких рівнях (Freeman et al., 1991; Hathcock et al., 1994). Стимуляція ЛПС і g-інтерфероном макрофагів мишей збільшує рі 37 вень поверхневої експресії, хоч g-інтерферон в поєднанні з інтерлейкіном-10 знижує рівень синтезу обох цих рецепторів (Ding et al., 1993). Дендритні клітини селезінки на низькому рівні експресують обидві молекули, а клітини Лангерганса на низькому рівні експресують CD86, хоч при культивуванні є тенденція до посилення експресії в обох типах клітин (Larsen et al., 1994). При культивуванні дендритних клітин CD86, мабуть, підлягає впливу більш могутньої, а також більш ранньої позитивної регуляції, що може грати важливу роль в опосередкуванні сигнальних шляхів в цих клітинах (Hathcock et al., 1994). Цікаво, що, хоч IL-10 не впливає на експресію CD80 дендритними клітинами, він активний за негативною регуляцією експресії CD86 (Buelens et al., 1995). Повідомлялося (O'Doherty et al., 1993), що, хоча початкові рівні CD80 в дендритних клітинах дуже низькі, після їх дозрівання рівень, що є CD80 підвищується. Експресія CD80 клітинами Лангерганса пригнічується і IL-10, і g-нтepфepoнoм, хоча обробка колонієстимулюючим чинником гранулоцитів/макрофагів ревертує пригнічення, викликане g-iнтерфероном, але не пригнічення, викликане IL-10 (Ozawa et al., 1996). Як було показано, у людини і миші специфічні цитокіни здійснюють контроль експресії і CD80, і CD86. Інтерлейкін-4 є могутнім індуктором CD86 і в меншій мірі індуктором CD80 в В-клітинах (Stack et al., 1994), в той час як g-інтерферон посилює експресію CD86 в різних типах клітин, включаючи В-клітини, моноцити і макрофаги (Hathcock et al., 1994). Хоч, як видно, g-інтерферон зумовлює посилення експресії CD80 в моноцитах, він може приводити до ослаблення експресії а макрофагах. IL-10, навіть в присутності g-інтерферону, ослабляє експресію CD80 і CD86 (Ding et al., 1993). Така взаємодія може відображати вірогідний механізм перемикання Thl-відповіді (DTH) на Тh2-відповідь (гуморальна). Однак, IL-10 не впливає на експресію CD80 в дендритних клітинах (Buelens et al., 1995). Це, крім того, може відображати роль цих молекул в регуляції груп Т-хелперів, оскільки вважається, що дендритні клітини грають важливу роль в ініціації імунної відповіді 2-го типу. Інтерлейкін-7 посилює експресію CD80 в Т-клітинах, хоча його вплив в інших типах клітин поки не визначений (Yssel et al., 1993), в той час як було встановлено, що експресія CD80 В-клітинами опосередковується за рахунок перехресного зв'язування з TNF-рецептором р75, а експресія може бути збільшена в присутності IL-4 (Ranheim & Kipps, 1995). Цікаво, що TNF належить до того ж сімейства молекул, що і CD40 - інший потенційний ініціатор експресії CD80. Мабуть, GM-CSF посилює поверхневу експресію CD80 дендритними клітинами і клітинами Лангерганса, в той час як gінтерферон зумовлює посилення вироблення тільки CD86 в цих клітинах (Larson et al., 1994). Довгий час вважалось, що розпізнавання, зв'язування і лізис трансформованих і інфікованих вірусом клітин-мішеней CD8-позитивними цитотоксичними Т-лімфоцитами (CTL) опосередковуються тільки за рахунок TCR-розпізнавання чужорідних пептидів, експресованих в зв'язку з молекулами 87470 38 класу І МНС (Berke, 1993). Недавно було встановлено, що ряд поверхово-клітинних молекул, експресованих і CTL, і клітинами-мішенями, необхідний для того, щоб відбулася повна взаємодія (Mescher, 1992). Ключовим учасником даної взаємодії є CD80 і відповідний йому рецептор CD28. Допоміжний сигнал, що генерується взаємодією B7-CD28, необхідний для того, щоб малі СВ8позитивні лімфоцити, що перебувають в стані спокою диференціювалися в літичний стан (Mescher, 1992). Цікаво, що після диференціювання CTL цей повторний сигнал перестає бути необхідним для вияву літичних властивостей (Hodge et al.,1994). Довгий час був відомий, що CTL є ключовими медіаторами противірусного імунітету. У людини в разі зараження вірусом імунодефіциту (ВІЛ) довготривала відсутність симптомів захворювання зв'язується з високими рівнями CTL пам'яті CD8+, специфічними відносно вірусних білків Gag, Pol і Env, і дуже низьким числом копій ВІЛ-ДНК і РНК в моноядерних клітинах периферичної крові (Rinaldo, 1995). Навпаки, у хворих на пізніх стадіях СНІД число CTL пам'яті (mCTL) різко знижене (Zanussi et al., 1996). Узгодженість цих даних вказує на те, що CTL пам'яті можуть бути основним чинником контролю інфекції в організмі-реципієнті і можуть грати ключову роль в формуванні імунітету у неінфікованих осіб (Zanussi et al., 1996). Крім того, патогенетичні зв'язки з ВІЛ-інфекцією відображають вірогідну роль CD80 і CD28 в розвитку СНІДу. Також було висловлене припущення, що CD80 бере участь в патогенезі ВІЛ-інфекції (Haffar et al., 1993). У нормі Т-клітини експресують CD80, але на невисокому рівні і тільки після активації (Schwartz, 1992). У модельному аналізі ВІЛ-інфекції in vitro в алостимульованих лініях первинних Т-клітин було показано, що CD28 регулюється негативно, а експресія CD80, очевидно, посилюється нарівні з МНС СІЇ (Haffar et al., 1993). Хоч точні механізми цих процесів поки не визначені, можна передбачити існування двох механізмів можливої ушкоджуючої дії. Присутність CD80 на поверхні разом з молекулами класу ІІ може зумовлювати інтенсифікацію контактів між інфікованими Тклітинами і неінфікованими CD4-позитивними клітинами (Haffar et al., 1993). Хоча така взаємодія може приводити до підвищення інтенсивності обміну між цими Т-клітинами, іншою функцією може бути підвищення CTL-опосередкованого розпізнавання і знищення клітин за рахунок генерування повторного сигналу внаслідок взаємодії CD80 на поверхні інфікованої клітини з рецептором CD28, що експресується CD8-позитивною Т-клітиною (Haffar et al., 1993). Це може прискорювати скорочення популяції лімфоцитів CD4+, що корелює з маніфестацією захворювань, пов'язаних з СНІДом (Haffar et al., 1993). І у миші, і у людини експресія білків сімейства В7 розглядається як важливий чинник імунного розпізнавання трансформованих клітин (Chen et al., 1992). Хоча експресія була встановлена в деяких типах трансформованих клітин, більшість пухлин в нормі не експресують CD80 або CD86, що тим самим робить неймовірним те, що у разі експресії потенційно імуногенного пухлинного ан 39 тигену буде мати місце повноцінне його розпізнавання Т-клітинами (Chen et al., 1993). Однак експерименти з трансфекції з використанням молекули CD80 з метою посилення цитолізу пухлинних клітин виявилися успішними (Hodge et al., 1994). Ретровірусні і засновані на вірусі коров'ячої віспи вектори, експресуючі функціональну молекулу CD80, були використані для трансфекції злоякісних клітин (Li et al., 1994; Hodge et al., 1994). Ці клітини, експресуючі CD80 в доповнення до погано (в нормі) розпізнаваних пухлинних антигенів, після цього зворотно вносили донору, що, як передбачалося, приведе до виникнення клітинної імунної відповіді у відношенні пухлинних антигенів, експресованих на клітинах злоякісних пухлин (Townsend & Allison, 1993). Результати цих експериментів з різними формами пухлин виявилися на диво високоефективними. У багатьох випадках організм-реципієнт формував могутню клітинну відповідь проти злоякісної пухлини, контролюючи або знищуючи її (Hodge et al., 1994). Подальша реинтродукція в організм донора пухлинних клітин, що мають поверхневу молекулу CD80 або позбавлених її, зумовлює схожі рівні протипухлинного імунітету (Hodge et al., 1994). Таким чином, вважається, що після встановлення імунної пам'яті молекула CD80 не є необхідною для підтримки відповіді або для ініціації її у випадку реинтродукції (Hodge et al., 1994). Ці експерименти показали, що молекула CD80 є ефективним медіатором клітинного імунітету і що в конкретних типах пухлин клітинні відповіді можуть бути індуковані за вірогідним контролем злоякісних новоутворень і запобіганням рецидивам (Hodge et al., 1994). Посилення експресії CD80 може мати негативні наслідки, що виявляється в розвитку деяких форм аутоімунітету. Вважається, що CD80 у взаємодії з IL-12 є важливим на ранніх стадіях розвитку розсіяного склерозу і зумовлює стимуляцію Тклітин і розвиток DTH (Windhagen et al., 1995). Експериментально викликаний аутоімунний енцефаломієліт (ЕАЕ) може бути частково пригнічений введенням немембранного CTLA-4Ig експериментальному об'єкту. Пригнічення демієлінізації при блокуванні взаємодії CD28/CD80 відображає вірогідну роль цієї взаємодії в загостренні захворювання (Arima et al., 1996). Важливість молекули CD80 в розвитку ефективної імунної відповіді очевидна. Хоча кДНК, що кодує цей білок, була виділена у гризунів і приматів, вона не була раніше виявлена в інших таксономічних групах ссавців. Кішка є поширеною домашньою твариною і потенційною моделлю ретровірусних захворювань. Клонування імунологічних чинників у кішок надають важливий інструмент ветеринарних досліджень, зокрема, в зв'язку з дослідженнями розвитку і профілактики захворювань у інших видів організмів. Матеріали і методи Виділення початкового фрагмента мРНК була екстрагована з моноядерних клітин периферичної крові (РВМС), простимульованих протягом 16 годин Кон-А з використанням реагенту для РНК-екстракції RNAzolB (Biotexc, Houston, ТХ). Початково кДНК була синтезована на матриці 87470 40 цієї РНК за допомогою зворотної транскриптази (ОН), де як зворотний праймер використали оліготимідин. РНК і оліго-dT нагрівали до 75°С протягом 3 хвилин з метою видалення повторних структур. Потім додавали ОН, dNTP, буфер і дистильовану воду і отриману суміш інкубували протягом 1 години при 42°С. Після цієї інкубації зразок нагрівали до 95°С протягом 5 хвилин з метою інактивації ОН. Вироджені праймери, похідні від консенсусних ділянок в складі опублікованих нуклеотидних послідовностей CD80 людини і миші (GeneBank, Gaithersburg, MA), використовували потім для початкової ампліфікації з складу даного гену 344-нуклеотидного фрагмента, що кодує центральний сегмент в складі константного домену: прямий праймер В7-2: GGC CCG AGT А (СТ) A AGA АСС GGA С зворотний праймер В7-3: CAG (AT)TT CAG GAT С (СТ)Т GGG ААА (CT)TG (SEQ ID NO: 56). Для ампліфікації даного продукту використали протокол полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР) з «гарячим стартом» з Taq-полімеразою. Спочатку реакційну суміш без Taq-полімерази нагрівали до 95°С протягом 5 хвилин (етап «гарячого старту») з метою запобігання утворення димерів між праймерами. Полімеразу додавали перед початком температурного циклу. Потім ПЛР-реакцію нагрівали до 95°С на 30 секунд з метою дисоціації дволанцюгової ДНК. Потім реакцію охолоджували до 42°С на 30 секунд для забезпечення відпалення вироджених праймерів. Відносно низька температура відпалювання полегшувала зв'язування праймерів у разі їх не-100% гомологічності з мішенню. Потім реакцію нагрівали до 72°С на 45 секунд, що є оптимальною температурою для активності Taq-полімерази, що забезпечує добудування (подовження ланцюга) праймеру і копії протилежного ланцюга ДНК. Даний температурний цикл повторювали 30 разів. Після цих 30 циклів заключний етап проводили при 72°С на протязі 7 хвилин з метою полегшення побудування будьяких неповних продуктів. Після візуалізації в 1%вому агарозному гелі отриманий продукт лігували протягом ночі при 16°С до складу клонуючого вектора ТА (InVitrogen, San Diego, СА) для подальшого секвенування. За 2мкл лігаційної реакції використали для трансформації компетентних клітин InvaF'. Трансформовані бактерії наносили смугами на пластини LB (50мкг/мл ампіціліну), покриті 40мкл розчином 50мкг/мл X-Gal. На наступний день відбирали колонії білого кольору і інокулували їх в 5мл культурального середовища LB, що містить 100мкг/мл ампіціліну, і культивували протягом ночі при 37°С при обертанні з швидкістю 225об/хв. Міні-препарування проводили на матеріалі нічних культур з метою виявлення клонів, які несуть плазміду з вставкою при правильній орієнтації. Плазміду екстрагували з культур з використанням стандартної процедури лужного лізису з подальшим очищенням ДНК шляхом екстракції сумішшю фенолу і хлороформу (Maniatis et al., 1982). ДНК осаджали 2 об'ємами етанолу і потім розщеплювали рестриктазою EcoRI. Результати цього роз 41 щеплення візуалізовали в 1%-вому агарозному гелі з метою ідентифікації колоній, несучих плазміду, що включає вставку в правильній орієнтації. Потім таку плазміду очищали від позитивних клонів і секвенували з використанням реактивів для секвенування методом терминації ланцюга з 35Sміткою за Сейнджером (Sequenaseo, US Biochemicals, Cleveland, ВІН) або методом циклічного секвенування з кінцевою флуоресцентною міткою (Perkin Elmer, Norwalk, СТ). За даними нуклеотидної послідовності кДНК специфічні зворотні і прямі праймери були сконструйовані для використання в методі «швидкої ампліфикації кінців кДНК» (5'-RACE) і для виділення 3'-послідовності в поєднанні з виродженими праймерами з складу 3'нетрансльованого сегмента (UTR). Виділення 5'-сегмента Ампліфікаційний протокол кДНК Marathon (Clontech, Palo Alto, СА) використовували для одержання 5'-послідовності даного гену мРНК була виділена з РВМС, простимульованих протягом 12 годин Кон-А і одночасно протягом 4 годин ліпополісахаридом. мРНК екстрагували з використанням реагенту для екстракції РНК ULTRASPEC (Biotexc, Houston, TX). кДНК отримали з використанням «якірного праймера» оліго-dT з виродженими нуклеотидами за 5'-кінцем для полегшення зв'язування цього праймера з далеким 5'-кінцем поліаденілового «хвоста». Потім кДНК транскрибували відповідно до описаного вище. Специфічні лінкери лігували на цю кДНК з використанням ДНК-лігази фагу Т4. ПЛР «вниз від точки лігування» здійснювали на матриці кДНК з використанням внутрішнього зворотного праймера, специфічного у відношенні початково ампліфікованої ділянки: В7-284: ТТА ТАС TAG GGA CAG GGA AG (SEQ ID NO: 58) B7-190: AGG CTT TGG ААА АСС ТСС AG (SEQ ID NO: 59),і якірного праймера, комплементарного лігованої лінкерної послідовності. Параметри ПЛР «вниз від точки» з химерною полімеразою KlenTaq (Clontech, Palo Alto, CA) були такими: 5 хвилин при 95°С - 1 цикл; 30 секунд при 95°С, 30 секунд при 72°С і 45 секунд при 68°C - 5 циклів; 30 секунд при 95°С, 30 секунд при 65°С і 45 секунд при 68°С - 5 циклів; 30 секунд при 95°С, 30 секунд при 60°С і 45 секунд при 68°С - 25 циклів. 1мкл даної реакції розчиняли в 50мкл води і 5мкл отриманих розведень потім використали для «гніздової» ПЛР (5 хвилин при 95°С -1 цикл; 30 секунд при 95°С, 30 секунд при 65°С і 45 секунд при 68°С - 30 циклів, з полімеразою KlenTaq) з лінкер-специфічним якірним праймером і ген-специфічним зворотним праймером, розташованим з 5'-сторони за відношенням до початкового праймеру (Фіг.6). В7-20: TTG ТТА TCG GTG ACG ТСА GTG (SEQ ID NO: 60) В7-135: САА ТАА CAT CAC CGA AGT CAG G (SEQ ID NO: 61). По 20мкл кожної реакції візуалізовали в 1,5%вому агарозному гелі і точний за розміром фрагмент вирізали з гелю. кДНК екстрагували і очищали з агарози шляхом центрифугування зрізу гелю через розпилювач гелю і фільтр Micropure з пора 87470 42 ми 0,22мкм (Amicon, Beveriy, МА). Потім очищену ДНК прямо секвенували з використанням секвенування з кінцевою флуоресцентною міткою (Perkin Elmer, Norwalk, CN). Виділення 3'-сегменту 3'-Сегмент даного гену виділяли шляхом підбору п'яти ген-специфічних праймерів за послідовністю 344-нуклеотидного фрагмента раніше і секвенованої 5'-ділянки: B7-S220: GTC ATG ТСТ GGC ААА СТА САА G (SEQ ID NO: 62) В7-50: CAC TGA CGT CAC CGA ТАА CCA С (SEQ ID NO: 63) B7-140: CTG ACT TCG GTG ATG ТТА TTG G (SEQ ID NO: 64) B7-550: GCC АТС ААС АСА АСА GTT ТСС (SEQ ID NO: 65) B7-620: TAT GAC ААА САА CCA TAG CTT С (SEQ ID NO: 66). Потім виродженні зворотні праймери підбирали за консенсусними ділянками 3'-UTR гени CD80 людини і миші: В7-1281: G(A/G)A AGA (АЛ)ТС ССТ CAT GA(G/T) CC (SEQ ID NO: 67) B7-1260: CA(C/T) (A/G)AT CCA АСА TAG GG (SEQ ID NO:68). кДНК били отримані на матеріалі РНК, екстрагованих за допомогою ULTRASPEC (Biotexc, Houston, TX), виділених із РВМС, простимульованих Кон-А і ЛПС відповідно до описаного вище. Якірний праймер оліго-dT використовували як вихідний зворотний праймер для транскрипції РНК у кДНК. ПЛР із полімеразою Taq проводили на матриці отриманої кДНК із використанням специфічних прямих праймерів вироджених зворотних праймерів (5 хвилин при 95°С 1 цикл; 30 секунд при 95°С, 30 секунд при 42°С і 45 секунд при 72°С - 30 циклів; 72°С на протязі 7 хвилин). Два раунди «гніздових» ПЛР-реакцій були необхідні для того, щоб одержати єдиний фрагмент правильного розміру. Одержаний продукт вирізали з 1,5%-го агарозного гелю, очищали відповідно до описаного вище і секвенували методом секвенування з кінцевою флуоресцентною міткою (Perkin Elmer, Norwalk, CN). За даними секвенування 5'-і 3'-сегментів конструювали праймери, які б дозволили ампліфікувати ділянку, що кодує повнорозмірну відкриту рамку гену CD80 кішки: B7-START: ATG GGT САС GCA GCA AAG TGG (SEQ ID NO: 69) В7-960: ССТ AGT AGA GAA GAG СТА AAG AGG С (SEQ ID NO:12). Була використана раніше отримана на матеріалі РВМС кДНК, для якої відома наявність у ній ДНК, що кодує шуканий ген. У цій реакції ПЛР (5 хвилин при 95°С - 1 цикл; 30 секунд при 95°С, 30 секунд при 42°С і 45 секунд при 72°С - 30 циклів; 72°С на протязі 7 хвилин) використовували химерну полімеразу KlenTaq - цей «збірний» фермент зберігає деяку 5'-екзонуклеазну активність, що дозволяє знизити частоту випадкових помилок, що часто відбуваються при проведенні ПЛР із полімеразою Taq. У реакції ампліфікували 960нуклеотидний фрагмент, що клонували до складу 43 клонуючого вектора ТА (InVitrogen, San Diego, СА) і секвенували відповідно з раніше описаним. В остаточній послідовності шуканого гену були враховані кДНК від двох різних тварин. Кожен нуклеотид у послідовності цього гену незалежно перевіряли принаймні за трьома різними послідовностями, отриманими в окремих ПЛРреакціях, з метою зниження імовірності неточностей, що походять від помилок, індукованих самою ПЛР. Результати РНК, екстраговану з тканин експериментальної кішки НК5, використовували для вихідних спроб апліфікувати ген CD80, однак ця кішка після цього була умертвлена і наступні продукти брали від інших тварин. У вихідній ампліфікації РНК клітин РВМС кішки НК5, простимульованих Кон-А, одержали 344-нуклеотидний продукт, що виявляв 70%-вий рівень ідентичності з геном CD80 людини (Фіг.7 і 8). Праймери були специфічні у відношенні до ділянки в центрі послідовності, що кодує, відповідний константний імуноглобуліноподібний домен. Хоча в цих вихідних експериментах використовували додаткові виродженні праймери з метою ампліфікації ділянок, які б кодували більш значний сегмент пептиду, тільки при сполученні праймерів В7-2 (прямий) і В7-3 (зворотний) одержали продукт придатного розміру. Наступні експерименти, у яких ці додаткові вироджені праймери використовували поряд з ген-специфічними праймерами, виявилися безуспішними. Отже, і 5'-, і 3'ділянки повинні бути виділені з застосуванням інших методів. Групу із шести нових ген-специфічних праймерів сформували на матеріалі даних секвенування, проведеного на вихідному продукті (прямі: В7-20, В7-135, В7-284, В7-190; зворотні: В7-140, В7-50). В наслідку зворотні праймери використовували в ПЛР-методі 5'-RACE, що деякою мірою подібний з методом, що застосовувався для успішної ампліфікації 5'-сегмента молекули CD28. Однак при використанні цього методу продукти не були отримані. В ампліфікаційній системі для кДНК Marathon RACE (Clontech, Palo Alto, CA) успішно ампліфікували ділянку, що відповідає 5'-послідовності, що кодує. РНК, похідна від клітин ЕК6, простимульованих Кон-А, була успішно ампліфікована за допомогою даного протоколу. Вихідну ампліфікацію здійснили з праймерами В7-284 і В7-3 і якірним праймером АРІ. У цій реакції не було отримано виразного єдиного бенда, тому з використанням цього продукту як матриці провели «гніздові» реакції з використанням праймерів В7-20 і В7-135 як «гніздових» (тобто внутрішніх стосовно попередніх праймерів) зворотних праймерів і якірного праймера АРІ як прямого праймера. Продукт придатної довжини одержали в кожній з цих реакцій (Фіг.9). Дані, отримані при прямому секвенованії продуктів реакції RACE, дозволили домогтися повної ідентичності на ділянках довжиною 20 і 135 п.н., відповідно, які перекривалися з вихідним секвенованим продуктом довжиною 344 п.н. Продукти подовжували від відомої 5'-ділянки через старткодон ATG гену кішки в сторону 5' 87470 44 нетрансльованого сегмента. Ідентичність 5'- послідовності, що кодує, похідної від цих продуктів, і 5'-ділянки гену CD80 людини була меншою, чим ідентичність, обумовлена між 344-нуклеотидним сегментом гену кішки і аналогічною ділянкою гену людини. Було встановлено, що подібна втрата гомології виявляється між послідовностями людини і миші за тими ж самими сегментами. Порівняння даних за послідовностями ділянок за межами сегмента, що кодує, показало подальше виразне зниження рівня консерватизму (дані не включені). Нову групу вироджених праймерів, що кодують 3'-нетрансльовану ділянку, синтезували за параметрами консенсусних ділянок у межах 3'-UTR послідовностей людини і миші. За допомогою цих праймерів успішно ампліфікували кДНК, що транскрибується з РНК, виділеної з РВМС, простимульованих Кон-А, узятих від кішки ED3. На відміну від вихідної ампліфікації, для одержання кінцевого продукту необхідно було провести серію «гніздових» реакцій. У первинних реакціях ПЛР, у яких використовувалися ці вироджені праймери і якірні праймери з меж 344-нуклеотидної послідовності і 5'-сегмента, не вдалося в результаті одержати виразні ідентифіковані бенди (Фіг.10). Однак, «гніздові» реакції при використанні розведеного первинного продукту і додаткових специфічних 3'праймерів дозволили одержати продукт, що кодує 3'-ділянку (Фіг.11), що залишилася. Після секвенування 3'-продукту було встановлено, що за межами константного Ig-подібного домену рівень ідентичності знову знижувався. Дистальний кінець послідовності, що кодує, вказав на дуже низький рівень ідентичності, що ще більш знижувався після стоп-кодону. На матеріалі 3'-послідовності сконструювали зворотний праймер, що виходив за межі послідовності, що кодує, починаючи з 960-го нуклеотиду. З цією конструкцією в сполученні з праймером, що покриває старт-кодон, ампліфікували продукт очікуваного розміру. Секвенування кінцевого продукту показало, що усі раніше встановлені ділянки дійсно перекриваються, і отриманий фрагмент являє собою неприривну і повну нуклеотидну послідовність гену CD80 кішки (Фіг.12). Для ампліфікації кінцевого продукту зразки ампліфікували на матеріалі РНК, виділеної з РВМС, простимульованих Кон-А, узятих у тварин ED3 і ЕК6. Принаймні два продукти від кожної тварини секвенували повністю, а кожний з нуклеотидних сайтів був перевірений і підтверджений принаймні за трьома правильно ліченими послідовностями. Продукт, отриманий від тварини ЕК6, потім клонували до складу клонуючого вектора ТА для наступного маніпулювання і як еталон. Повнорозмірна нуклеотидна послідовність представлена на Фіг.8. Фрагмент довжиною 960 нуклеотидів включає старт-кодон за 1-им положенням, стоп-кодон за положенням 888 і додатково 72 нуклеотиди 3'нетрансльованої ділянки (Фіг.13). Серед продуктів, що одержали і секвенували в ході встановлення повнорозмірного фрагмента, були секвеновані додаткові 5'- і 3'-ділянки (дані не показані). 45 87470 Секвенування ділянки, розташованної вище старт-кодону, на матеріалі продуктів 5'-RACE, показало, що кодон ATG, визначений у положеннях 1-3, є першим сайтом, що кодує (метіонін) у рамці зчитування і займає аналогічне положення в послідовностях миші і людини. Стоп-кодон, що знаходиться в положенні 888, також, як підтверджується, знаходиться в подібному положенні в раніше секвенованих генах. Порівняння послідовностей продемонструвало рівні ідентичності 77% і 62% з опублікованими нуклеотидними послідовностями генів CD80 людини і миші, відповідно (Фіг.14). Рівень гомології з послідовностями інших приматів і гризунів порівняємо з рівнями, встановленими для людини і миші, відповідно. У кожного з видів рівень ідентичності з геном CD86 був меншим за 25%. З використанням комп'ютерного пакету програм для аналізу ДНК MacVector (IBI, Rochester, NY) нуклеотидну послідовність «транслювали» в амінокислотну послідовність. У результаті такого розшифрування визначили 292-амінокислотний пептид, подібний за розміром, з білками і миші, і людини, хоча і не ідентичний їм (Фіг.15). Сигнальний сегмент, як передбачається охоплює перші 25 амінокислот. Позаклітинний домен даної молекули складений 115 амінокислотами домену, подібного з варіабельним імуноглобуліновим доменом (до 139-го залишку), і 110 амінокислотами домену, подібного до константного імуноглобулінового домену (приблизно до 240-го залишку). Трансмембранний домен, що складений залишками 241-271, переходить у короткий цитоплазматичний «хвіст», що складається з 21 амінокислот. Як і в молекулі людини, поліпептид кішки включає 8 потенційних сайтів N-глікозилування, хоча їхнє розташування не ідентичне. Рівень гомології між білками кішки, людини і миші істотно менший, за рівень ідентичності відповідних нуклеотидних послідовностей (табл. 1). Таблиця 1 Порівняння рівнів гомології послідовностей CD80 кішки, миші і людини Вид Людина Миша Відсоток гомології 3 послідовністю кішки Нуклеотидна Амінокислотна 77% 59% 62% 46% Порівняння передбачуваної амінокислотної послідовності CD80 кішки з передбачуваною послідовністю людини вказує на те, що велика частина гомологічності цих двох молекул зосереджена в константному домені (амінокислоти 140240). Існує незначна гомологія між цими пептидами за сигнальним сегментом і вона відсутня за межами IgV-подібного домену. Як уже зазначалося, консерватизм істотний у послідовності константного домену, однак ця ідентичність майже не виходить за його межі, і дуже низький рівень гомології виявляється за трансмембранним доме 46 ном і цитоплазматичним «хвостом» пептиду кішки і аналогічних ділянок у молекулі людини (Фіг.16). Порівняння генів CD80 кішки, людини і миші з генами CD86 миші і людини показує, що, хоча існує дуже обмежений рівень гомології між цими двома членами сімейства В7, амінокислоти, що розглядаються як діагностичні для генів сімейства В7, зберігаються і у складі білка кішки (Фіг.17). Ці молекули включають залишки, що приблизно беруть участь у просторовому укладанні («фолдингу») і складають сайт зв'язування. Хоча рівень гомології між послідовностями CD80 людини і кішки не настільки великий, як рівень ідентичності між молекулами CD28, порівняння отриманих графіків гідрофобності показує, що, хоча і існує ряд замін амінокислот у конкретній амінокислотній послідовності, ці зміни часто є гомологічніми і, очевидно, не змінюють поверхневих характеристик даного пептиду (Фіг.18). Обміркування Рівні ідентичності нуклеотидних послідовностей кішки і людини, а також кішки і миші CD80 середні, хоча рівень такої гомології не переноситься на пептид. Передбачається, що, хоча генетичний код і є виродженим, у деяких молекулах (наприклад, у CD28) розходження між нуклеотидними послідовностями в істотному ступені не змінюють пептид, у випадку ж CD80 консерватизм амінокислотної послідовності в цілому не настільки критичний, а, отже, зміни за довжиною цієї молекули в ході еволюції «більш припустимі». Хоча в цілому нуклеотидні послідовності виявляють середній рівень ідентичності, існують визначені труднощі у виділенні повнорозмірної послідовності. Вихідний продукт CD80 був отриманий за константним доменом цієї молекули - тобто за тією ділянкою, що виявляє найвищий рівень консерватизму в послідовності кДНК даного виду. Праймери, що маркирують цю ділянку і дозволяють ефективно апліфікувати продукт, одержали простим чином, у результаті чого 344нуклеотидний фрагмент охопив найбільш консервативну ділянку IgC-подібності. На жаль, через відсутність гомології в послідовностях сигнального сегмента, цитоплазматичного домену і 3'-UTR для виділення послідовностей цих ділянок потрібно прикласти більше зусиль. Наявність даних за секвенуванням центральної ділянки білка, однак, дозволяє визначити відправну точку, від якої можуть бути визначені інші ділянки цієї молекули. CD80 кішки являє відмінний приклад того, як шляхом одержання короткого фрагмента шуканої молекули і застосовуючи методи RACE і виродженні праймери в сполученні з якірними праймерами, що відповідають встановленому сегменту, може бути досить легко отримана повнорозмірна послідовність цієї молекули. Порівняння передбачуваної амінокислотної послідовності цих клонованих молекул CD80 показує відсутність загальної гомології. Поліпептиди миші і людини виявляли менш чим 50%-вий рівень гомології за амінокислотними послідовностями. Це порівняне з 59%-вим рівнем ідентичності при порівнянні білків кішки і людини і 46%-вий рівень ідентичності поліпептидів кішки і миші, що, можливо, 47 відображає еволюційне споріднення цих видів. Порівняння профілів, що пророкуються, гідрофільності амінокислот кішки і людини, що дозволяють визначити ті залишки, що були порушені або переміщені через їх відносну гідрофільность, показало, що, хоча на рівні амінокислотної послідовності конкретні амінокислоти могли і не зберегтися, ці зміни, очевидно, носили відносно консервативний характер. Це вказує на ймовірне збереження ознаки гідрофільності/гідрофобності даної молекули, що, виходить, може відповідати подібному за структурою в цілому поліпептиду. Для поверхневоклітинного білка, мабуть, характерна наявність конкретних амінокислот, що безпосередньо залучені в процес зв'язування, а також інших амінокислот, що потрібні тільки для того, щоб підтримувати структуру, необхідну для забезпечення взаємодії із сайтом зв'язування. Хоча існують розбіжності амінокислотних залишків у молекулах CD80 у примата, гризуна і кішки, проте зберігаються ознаки IgSF. Молекула CD80 кішки включає кінцеві IgC-подібний домен і IgV-подібний домен, розташовані проксимальне стосовно ділянки, асоційованої з мембраною. Як і у випадку з рівнем консерватизму при порівнянні CD80 миші і кішки, рівень ідентичності константних ділянок вищий, ніж при порівнянні варіабельних ділянок (Freeman et al., 1989). У цілому, консерватизм варіабельного домену перевищує 50%, у той час як цей показник для константного сегмента перевищує 70%, при тому, що коротка ділянка амінокислот 164-198 (та сама ділянка, за яким був виділений вихідний 344-нуклеотидний фрагмент) характеризується найбільшим рівнем ідентичності. Ця центральна 56-амінокислотна ділянка (залишки 165-221) у складі константного домену виявляє 87%-вий рівень гомології між послідовностями людини і кішки, при тому, що на 28-нуклеотидній ділянці (залишки 171-198) існує тільки одне розходження. Також ця ділянка котячої послідовності виявляє істотний рівень гомології в порівнянні з відповідними залишками поліпептиду миші. Гідрофільна природа амінокислот на цій ділянці вказує на високий ступінь імовірності експресії на поверхні клітин, а з урахуванням визначеного рівня консерватизму між видами - на ймовірну участь у взаємодіях «ліганд-рецептор». Було припущено, що IgC-частина даної молекули прямо залучена в презентування єднального домену до зв'язування на рецепторі (Peach et al., 1995). Однак експериментальним чином встановили, що для здійснення ефективного зв'язування необхідні і константний, і варіабельний домени (Peach et al., 1995). Концентрація гомологічних залишків у IgC-ділянці позаклітинних доменів, поряд з високим рівнем дивергенції трансмембранного і цитоплазматичного доменів, розглядається як додатковий доказ ролі CD80 як ліганду в більшому ступені, ніж фактора, здатного виробляти сигнал. Як і в людини, і в миші, CD80 кішки характеризується високим рівнем глікозилування. Вуглеводневі залишки, як вважається, не беруть участь прямо в зв'язуванні, однак можуть сприяти підвищенню розчинності позаклітинного сегмента цієї молекули (Peach et al., 1995), 3 восьми потенцій 87470 48 них сайтів глікозилування, що виявляються в послідовності пептиду людини, сім розташовані в положеннях, ідентичних таким у білку кішки. Сайт, розташований у 39-м положенні амінокислотної послідовності кішки, не відтворений у молекулі CD80 людини, у той час як існує сайт у 232-м положенні, відсутній у послідовності кішки (Freedman et al., 1987). У молекулі миші існує сім сайтів глікозилування, тільки два з яких знаходяться в ідентичних положеннях, хоча в принципі вони розташовані в тих же ділянках молекули, що і у молекулах кішки і людини (Freeman et al., 1989). Подібність у числі і положенні сайтів глікозилування, як можна вважати, відображає важливість відповідних мотивів для функціонування даної молекули. Існує широке коло можливих способів застосування молекули CD80 кішки. Відповідно до обміркованого вище, ця молекула є ключевим елементом забезпечення точності в розвитку відповіді зрілих Т-клітин. Контроль експресії даного гену і на рівні РНК, і на рівні білка повинний допомогти встановити шлях, за яким імунна система кішки взаємодіє з інфекцією. З'ясування того, як ця система впливає на конкретні патогени, з урахуванням даних, одержуваних при дослідженнях інших модельних систем, дасть новий погляд на параметри імунної системи людини. Крім того, внесок у вивчення можливостей маніпуляції імунною системою кішки, що є одним з найбільш розповсюджених видів домашніх тварин, додасть ветеринарії нові імпульси. Важливим перспективним застосуванням, передбачуваним для молекули CD80 в інших видах, є індукція пухлин-специфічного імунітету шляхом внесення гену CD80 у трансформовані клітини з наступною реінтродукцією донору з метою індукції протипухлинного імунітету, опосередкованого лімфоцитами CTL (Townsend & Allison, 1993). Як зазначалося вище, вважається, що результатом поверхневої експресії CD80 пухлинними клітинами є специфічна CTL-відповідь, спрямована на злоякісну пухлину (Hodge et al., 1994). Крім того, в організмі-господарі утвориться популяція клітин пам'яті, що походить від CD8-позитивних Т-клітин (Hodge et al., 1994). Хоча даний підхід у цілому спрямований на протипухлинний імунітет, за аналогією його також можна поширити на розвиток противірусного імунітету. Як обговорювалося вище, довгостроковий латентний стан синдрому придбаного імунодефіциту розглядається як наслідок вихідного формування могутньої CTL-опосередкованої імунної відповіді на ВІЛ-інфекцію (Landay et al., 1994). Передбачається, що ті хворі, які протягом довгого часу не виявляють симптомів СНІДу після зараження ним, здатні формувати і підтримувати сильний CTLклітинний імунітет, спрямований проти ВІЛ. Хоча більшість сучасних вакцин спрямовані на формування гуморальної імунної відповіді, однак якщо вакцина здатна індукувати розвиток популяції mCTL, спрямованої на віруси ВІЛ і FIV, те ця популяція повинна забезпечувати захист, подібний такому, який характерний для довгострокового безсимптомного СНІДу. Введення новим індивідуумам «генної» вакцини, у складі якої білки FIV об' 49 єднані з білком CD80, повинне приводити до поверхневої експресії костимуляторної молекули в сполученні з презентацією вірусних епітопів FIV, забезпечуваної молекулами МНС СІ. У випадку успіху це повинно привести до проліферації популяції FIV-специфічних лімфоцитів mCTL. Після наступного впливу вірулентного вірусу у вакцинованих індивідуумів буде відбуватися індукція відповіді на клітини, які були інфіковані даним вірусом, знищуючи їх до того, як цей вірус буде здатний розмножуватися і почне руйнувати компоненти імунної системи. Приклад 6 Клоновані і секвеновані КДНК CD28 кішки Введення CD28 є поверхнево-клітинним глікопротеїном, що у нормі експресований у виді гомодимеру, складеного ідентичними субодиницями з молекулярною масою 44кда, з'єднаними дисульфідними зв'язками. Він входить в імуноглобулінове суперсімейство і характеризується наявністю єдиної позаклітинної варіабельної (V) ділянки, трансмембранного домену і короткого цитоплазматичного «хвоста» (Aruffo & Seed, 1987). Хоча ця молекула глікозильована, вуглеводневі складові, очевидно, не беруть участь у зв'язуванні і приблизно забезпечують підвищення розчинності позаклітинного домену (Peach et al., 1994). кДНК, що кодує пептиди людини, пацюка, миші і кролика і аналогічна молекула курки були раніше клоновані і секвеновані (Linsley et al., 1995a). CD28 виявляється в більшості тимоцитів CD4+/CD8+ і периферичних Т-клітин CD4+/CD8+ і характеризується посиленням експресії у відповідь на стимуляцію anti - XDЗ , ФГА і ФМА і пригніченням її в результаті зв'язування з антитілом до CD28 (Linsley et al., 1993b). Незабаром після відкриття цього білка з'ясувалося, що CD28 відівідображає важливу роль у регуляції активації Т-клітин CD4+/CD8+ (June et al., 1990). На додаток до стимулювання активації і проліферації Т-клітин також було встановлено, що формування такого вторинного сигналу індукує цитолітичну активність CTL (Azuma et al., 1993с). CD28 експресується на ранніх етапах дозрівання Т-клітин. У той час как незрілі СВ3-негативні клітини негативні і за CD28, проміжні клітини CD4+/CD8+експресують цей білок на низькому рівні, а зрілі СО3-позитивні тимоцити CD4+/CD8+ експресують CD28 на високому рівні (Turka et al., 1991). У людини після дозрівання даний рецептор виявляється майже у всіх Т-клітинах CD4+ і більш чим у половини Т-клітин CD8+ (Turka et al., 1991), а також майже у всіх Т-лімфоцитів мишей (June et al., 1990). Після активації Т-клітин поверхнева експресія підсилюється, у той час як зв'язування даної молекули з відповідним їй лігандом або специфічними моноклональними антитілами обумовлює в активованих клітинах негативну регуляцію даного гену і на транскрипційному, і на трансляційному рівнях (Linsley et al., 1993а). Хоча CD28 виявляється в основному на лімфоцитах Тклітинних популяцій, цей білок, як повідомлялося, виявляється в плазмацитомах кісткомозкових біопсійних пробах (Kozber et al., 1987) і експресується 87470 50 в культурах лінії лейкозних клітин, подібних до натуральних клітин-кілерів (Azuma et al., 1992). CD28 виявляє визначений ступінь структурної гомології з іншим 87-рецептором -CTLA-4: вони обоє стосуються підродини в групі білків IgSF (Linsley et al., 1995a). Ці дві молекули включають позаклітинний IgV-домен, єдиний трансмембранний домен і короткий цитоплазматичний сигнальний домен (Aruffo et al., 1987). Хоча сумарний рівень гомології між цими двома молекулами складає тільки 31%, існують дві короткі ділянки і специфічні залишки, що цілком інваріантні в цих двох молекулах: це відображає ймовірну важливу роль даних мотивів у розпізнаванні лігандів В7 і підтримці структурної цілісності (Leung & Linsley, 1994). Гексапептидний мотив MYPPPY зберігається у всіх виділених членів сімейства рецепторів CD28/CTLA-4 (Peach et al., 1994). Він картирується в CD3-подібній випетленій ділянці даних молекул; у випадку його мутирування відбувається зниження авідності за зв'язуванням і у CD28, і в CTLA-4 (Peach et al., 1994). Ця ділянка, як передбачалося, служить потенційним сайтом зв'язування лігандів у складі обох білків - CD28 і CTLA-4, однак невідомо, або є ця ділянка прямим сайтом зв'язування ліганду В7 або ж він представляє структурні мотиви, що непрямим чином залучені в зв'язування (Peach et al., 1994). Незважаючи на консерватизм залишків у послідовностях CD28 і CTLA-4, CTLA-4 зв'язує CD80 і CD86 з більш високою авідністю, чим CD28 (Ellis et al., 1996). Таким чином, хоча в активованих Т-клітинах in vitro CTLA-4 експресований на рівні лише 2-3% від такого в CD28, він зв'язує ліганди з більшою в 20 разів авідністю (Linsley et al., 1995). Хоча молекули CTLA-4 і CD28 еволюційно родинні і мають загальні ліганди, проте їхні функції і сигнальні здібності, очевидно, диференційовані (Balazano et al., 1992). Порівняння сигнальних ділянок у складі кожної з цих молекул не відображає істотний рівень ідентичності: отже, ці молекули ініціюють різні сигнальні механізми (Hutchcroft & Bierer, 1996). У той час як CD28 експресований Т-клітинах, що знаходяться в станіспокою і позитивно регулюється на початку відповіді на активацію, експресія CTLA-4 досягає піку через 48 годин після активації і повертається на вихідний рівень через 96 годин після активації (Linsley et al., 1992a). Експресія CTLA-4, як передбачається, погоджується з негативною регуляцією CD28 (Lindsten et al., 1993). Крім того, сигнальні механізми, опосередковані зв'язуванням лігандів рецептором CD28, очевидно, відіграють важливу роль в інтенсифікації експресії CTLA-4 (Linsley et al., 1993a). Т-клітини, що негативні за CD28, не експресують CTLA-4 у відповідь на стимуляцію ФМА або джерелом іонів кальцію (Lindsten et al., 1993). Повна послідовність подій в опосередкованому CD28 сигнальному шляху поки не визначена, хоча існує гіпотеза про склад цього каскаду процесів (Hutchcroft & Bierer, 1996). Було висловлене припущення про те, що сигнальний механізм CD28 залучає мобілізацію внутрішньоклітинного кальцію, метаболізм фосфати 51 дилінозитолу і індукцію фосфорилування білків за залишками тирозину (Hutchcroft & Bierer, 1996). Цитоплазматичний «хвіст» молекули CD28 включає визначені мотиви, для яких передбачається участь у внутрішньоклітинних сигнальних процесах після зв'язування лігандів CD80 або CD86 (June et al., 1994). Внутрішньоцитоплазматична ділянка, яка складається з 41 амінокислот не має виявленої каталітичної активності, тому що не включає внутрішньоклітинних мотивів «тирозинової активації» (як у послідовності TCR) або залишків цистеїну, необхідних для зв'язування цитоплазматичних тирозинкіназ сімейства Src (June et al., 1994). Однак деякі із сайтів потенційного глікозилування в складі виділених послідовностей консервативні (Hutchcroft & Bierer, 1996). Внутрішньоклітинна каталітична, активність і міжбілкові взаємодії часто регулюються за шляхом диференційованого фосфорилування білків, хоча ферменти, які б забезпечували таку активність рецептора CD28, поки не визначені (Lu et al., 1992). Консенсусний мотив YMXM, наявний у складі цитоплазматичного домену, є передбачуваним сайтом Src-гомології фосфотизованого зв'язування (домен SH2), що визначає, в свою чергу, зв'язування фосфатидилінозитол-3-кінази (кінази РІ3) (Prasad et al., 1995). Хоча це є лише одним з можливих сигнальних механізмів для участі CD28, було показано, що активність кінази РІ3 не корелює з активністю IL-2; але тому що збільшення вироблення IL-2 є первинним наслідком сигнальної активності CD28, то представляється, що інші механізми впливають на активність, що обумовлюється внутрішньоклітинними сигнальними процесами (June et al., 1994). Хоча значення цих процесів поки цілком не розшифроване, костимуляція CD28 приводить до посилення вироблення цитокінів Т-клітинами. У CD28-позитивних Т-клітинах, активованих дією антитіл до CD3 або ФГА, ara-CD28 обумовлює перевищення вихідного рівня РНК ряду цитокінів, включаючи IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, фактор некрозу пухлин (TNFoc), лімфотоксин, 7-інтерферон і фактор гранулоцитів-моноцитів, що колоніє-стимулює, (GM-CSF), так само як і рецептор інтерлейкіну-2 (Lenschow et al., 1996). Підвищення вихідного вмісту мРНК обумовлюється і підвищенням рівня транскриптів, і інтенсифікацією самої транскрипції (Hutchcroft & Bierer, 1996). Хоча костимуляція CD28 уперше була описана в клонах CD4-no3HTHBHHx Т-клітин (Martin et al., 1986), зараз відомо, що CD28 бере участь в активації багатьох типів клітин. Костимуляція цього механізму, як було показано, регулює в субпопуляціях «наївних» Т-клітин CD4+ вироблення gінтерферону, цитокінів Thl-відповіді і вироблення IL-4, що є цитокіном Тп2-відповіді (Seder et al., 1994). Костимуляторний механізм за участю CD28 також важливий для активації CTL CD8+, хоча, очевидно, він не є необхідним для ефекторної фази знищення клітин за участю CTL (Hodge et al., 1994). Цікаво, що CD28 також приблизно відівідображає роль у процесах ВІЛ-інфекції. У культивованих лімфоцитах, що походять від деяких пацієнтів з позитивною реакцією на СНІД, зв'язування 87470 52 CD28 з моноклональним антитілом може підсилювати розмноження вірусу ВІЛ (Asjo et al., 1993). У приматів і гризунів вторинний сигнал, утворений у результаті зв'язування CD80 з CD28, чітко вказує на його роль у вихідній активації Т-клітин (Aruffo & Seed, 1987). Недавно отримані дані, однак, дозволяють припустити, що основний наслідок такої взаємодії може бути спрямований на забезпечення проліферації за рахунок пригнічення апоптозу (Lenschow et al., 1996). Т-клітини, які знаходяться в стані спокою і в Go-фазі росту, можуть активуватися шляхом утворення комплексу TCR, однак вони не здатні проліферувати або секретувати IL-2 під час відсутності зв'язування CD28: такий ефект називають анергією (Linsley et al., 199 la). Зрілі Т-клітини можуть активуватися винятково за зв'язуванням TCR з молекулами МНС на поверхні клітин АРС, однак це в кінцевому рахунку приводить до активації індукованої клітинної загибелі, тобто до апоптозу (Radvanyi et al., 1996). Хоча інші вторинні взаємодії (наприклад, костимуляція ІСАМ-1) можуть формувати допоміжні сигнали до проліферації, передбачається, що CD28опосередкована костимуляція є унікальним механізмом, що запобігає наступному виникненню клонільної анергії і апоптозу (Linsley et al., 1993a). Було показано, що CD28 може брати участь у регуляції генів, для яких відома залученість у захисті Т-лімфоцитів від апоптозу (Boise et al., 1995). Постійне посилення експресії bcl - X було виявлене t в Т-клітинах, костимульованих зв'язуванням на рецепторі CD28 (Boise et al., 1995). Вважається, що костимуляція CD28 може стабілізувати мРНК bcl - X t , з яким транслюється білок, що запобігає апоптозу (Radvanyi et al., 1996). Зв'язування на CD28, як було показано, сприяє посиленню вироблення різних цитокінів Тхелперами у відповідях і 1-го, і 2-го типів (Lenschow et al., 1996). Також передбачається, що ця взаємодія бере участь у формуванні конкретних типів Т-хелперов. «Наївні» CD4-no3HTHBHi Тлімфоцити повинні в нормі формувати фенотип ТЫ, якщо вони активувалися під час відсутності сигнального шляху, опосередкованого зв'язуванням CD28/CD80 (Lenschow et al., 1996). Це може мати непряме значення у виробленні IL-4, індукованої додаванням екзогенного IL-2, у той час як роль сигналів CD28 у виробленні IL-2 раніше вже була підтверджена (Seder et al., 1994). Проведені дослідження на мишах, «виключених» за геном CD28, додатково підтвердили роль цього рецептора в диференціюванні клітин Th2. Миші, що є гомозиготними нульовими мутантними за CD28, були отримані Шахиняном зі співавторами з метою встановлення того, як тварина адаптується до інфекції під час відсутності вторинного сигналу, генерованого CD28 (Shahinian et al., 1993). Цей ген був зруйнований в ембріональних стовбурних клітинах шляхом часткового заміщення другого екзону геном резистентності до неоміцину (Shahinian et al., 1993). Було показано, що миші, гомозиготні за «виключеним» геном, не експресують CD28 на своїх Т-клітинах, у той час як гетерозиготні особини CD28 (-/+), як було встанов 53 лено, характеризуються зниженою поверхневою експресією цього рецептора (Shahinian et al., 1993). Стимуляція мітогеном Т-клітин, похідних від гомозиготних «виключених» за CD28 мишей, послабляє проліферацію Т-клітин і вироблення цитокінів, що може бути лише частково відновлено дією екзогенного IL-2 (Shahinian et al., 1993). Було показано, що високоочищені Т-клітини не активуються пектинами під час відсутності клітин АРС (Unanue, 1984). На матеріалі названому «виключеною» лінією було показано, що взаємодія CD28/CD80 необхідна для прояву мітогенної активності Т-клітинних пектинів (Shahinian et al., 1993). Також було виявлено, що дана взаємодія є важливим для опосередкування переключення ізотипів В-клітин у відповідь на дію антигену (Shahinian et al., 1993). На відміну від «виключених» за CD80 мишей, функціональна роль CD28 може бути встановлена з застосуванням генноінженерної технології «вимикання генів». Про мишей, «виключених» за геном CTLA-4, поки не повідомлялося, однак миші, понадекспресуючі CTLA-4Ig, уже були досліджені (Lane et al., 1994). Як і передбачалося, фенотипічні характеристики цієї лінії мишей подібних до ознак ліній, дефіцитних за CD28 (Lane et al., 1994). Хоча ізольовані Т-клітини виробляють нормальну кількість g-інтерферону, після стимуляції виявляється істотно менша кількість IL-4 (Ronchese et al., 1994). Це приводить до нездатності В-клітин ініціювати або підтримувати точну гуморальну імунну відповідь (Ronschese et al., 1994). Хоча відомі різні передбачувані шляхи диференціювання Тh1 і Th2, взаємодія CD28/B7 чітко впливає на диференціювання підгруп Т-лімфоцитів. Стабілізація мРНК інтерлейкіну-2 може відігравати ключову роль у зв'язуванні на CD28, однак деякі інші цитокіни, як було показано, прямо або опосредковано впливають на цю взаємодію (Linsley et al., 199 la). Медіатори запалення IL-Itt, IL-6 і TNFa виробляються популяціями Т-клітин пам'яті у відповідь на сигнал молекул CD28, у той час як у популяціях «наївних» клітин виробляється тільки IL-la (Cerdan et al., 1991; van Kooten et al., 1991). Експресія IL-4 також регулюється за участю сигнального механізму CD28 (Seder et al., 1994). Також зазначена взаємодія забезпечує позитивну регуляцію IL-5, IL-10 і IL-13, що є важливими медіаторами гуморальної відповіді (deWaal Malefyt et al., 1993; Minty et al., 1993). Крім того, фактори, що колоніє-стимулюють, і фактори росту, включаючи GM-CSF, CSF-1 і IL-3, і хемотаксичні фактори, включаючи IL-8, позитивно регулюються за участю сигналу, генерованного рецептором CD28 (Harlan et al., 1995). З врахуванням того, що вище зазначалося ймовірне використання CD80 в індукції протипухлинного імунітету, існує ряд інших потенційних способів клінічного застосування CD28 і CD80. Запобігання взаємодії між CD28 і CD80, як було показано в модельній системі гризунів, сприяє профілактиці або лікуванню ряду аутоімунних захворювань, профілактиці відторгнення органів або прояву реакції «трансплантат проти господаря», а також профілактиці секреції цитокінів, асоційованої із сепсисом (Harlan et al., 1995; Nickoloffet al., 87470 54 1993; Thomas et al., 1994; Zhou et al., 1994). Додавання CTLA-4Ig з метою блокування взаємодії CD28/CD80 у мишей може запобігати симптомам вовчаночного типу в мишей лінії NZB/NZW і частково захищати від летального ЕАЕ і від летального нефриту в пацюків (Harlan et al., 1995). Хоча даний імунотерапевтичний підхід у відношенні аутоімунних захворювань для людини поки не застосовувався, було встановлено, що в медичній практиці при біопсіях у пацієнтів із псоріазом і ревматоїдним артритом виявляється експресія CD80, у той час як у нормальних біопсійних пробах така експресія відсутня (Nickoloff et al., 1993; Thomas et al., 1994). При пересадженнях кісткового мозку і органів у мишей і в модельних експериментах на людині in vitro додавання CTLA-4Ig і запобігання взаємодії CD28/B7 може обумовлювати принаймні частковий захист від відторгнення органу, прояву реакції «ТПХ» або індукцію антиген-специфічної стійкості (Harlan et al., 1995). Нарешті, секреція цитокінів і прояв сепсису, що може приводити до зараження крові і септичного шоку, можуть бути відвернені в мишей шляхом прижиттєвого введення CTLA-4Ig (Zhou et al., 1994). Маніпуляції взаємодією CD28/CD80 дозволяють глибше зрозуміти процеси Т-клітинної костимуляції і дозволяють наблизитися до вирішення різних проблем. Матеріали і методи Виділення вихідного фрагмента CD28 мРНК екстрагували з лімфоцитів периферичної крові тварини НК5, простимульованих протягом 16 годин Кон-А, з використанням реагенту для РНК-екстракції RNAzol (Biotexc, Houston, ТХ). В завершення кДНК синтезували на матриці виділеної РНК з зворотною транскриптазою (ОТ), використовуючи як 3'-праймери оліго-dT. РНК і оліго-dT нагрівали до 75°С на 3 хвилини для видалення вторинних структур. Потім додавали ОТ, dNTP, буфер і дистильовану воду і отриману суміш інкубували протягом 1 години при 42°С. Після інкубації зразок нагрівали до 95°С на 5 хвилин з метою інактивації ОН. Вироджені праймери, похідні від консенсусних сегментів, знайдених в опублікованих нуклеотидних послідовностях CD28 людини, миші і кролика (GenBank, Bethesda, MD), потім використовували для вихідної ампліфікації 673нуклеотидного фрагмента кодуючого велику частину відкритої рамки: CD28-113: САА ССТ TAG CTG CAA GTA САС (SEQ ID NO: 70) CD28-768: GGC TTC TGG ATA GGG ATA GG (SEQ ID NO: 71). Метод ПЛР «з гарячим стартом» на основі використання Taq-полімерази застосовували для ампліфікації продукту (5 хвилин при 95°С - 1 цикл; 30 секунд при 95°С, 30 секунд при 48°С і 45 секунд при 72°С - 30 циклів; 7 хвилин при 72°С - 1 цикл). Потім отриманий фрагмент візуалізували в 1%вому агарозному гелі і лігували до складу клонуючого вектора ТА (InVitrogen, San Diego, СА) і секвенували відповідно до описаного вище. На основі послідовності кДНК були отримані специфічні 3'праймери, що синтезували для використання в методі 5'-RACE: 55 CD28-190: CGG AGG TAG AAT TGC ACT GTC С (SEQ ID NO: 72) CD28-239: ATT TTG CAG AAG TAA ATA TCC (SEQ ID NO: 73). Виділення 5'-сегмента Модифікований за GIBCO протокол методу 5'RACE (Gibco BRL, Gaithersburg, MD) використовували для одержання 57-послідовності молекули, що залишилася, CD28 кішки. РНК екстрагували з РВМС, простимульованих протягом 16 годин КонА. Зворотний ген-специфічний праймер використовували для синтезу першого ланцюга кДНК. РНК і цей праймер нагрівали до 75°С на 5 хвилин з наступним додаванням інших ОТ-реагентів. Після денатурації отриману суміш охолоджували до 4°С і додавали реакційний буфер, хлорид магнію, dNTP, дитіотреїтол і зворотну транскриптазу Superscript (Gibco BRL, Gaithersburg, MD). Суміш з ОТ інкубували при 42°С на протязі 30 хвилин і потім нагрівали до 70°С на протязі 15 хвилин з метою денатурації ОТ. Потім додавали РНКазну суміш і реакцію інкубували при 55°С на протязі 10 хвилин з метою видалення залишків РНК і запобігання неправильного добудування за участю термінальної трансферази (Td). Потім кДНК очищали з використанням центрифужної колонки GlassMax (Gibco BRL, Gaithersburg, MD) з метою видалення не включвшихся нуклеотидів і праймера. Потім очищену кДНК, елуйовану з даної колонки, замикали за допомогою Td. Td використовували для додавання 20-30-нуклеотидного дезоксицитидинового «хвоста» до кДНК. Цей фермент додавали до суміші очищеної кДНК, хлориду магнію, реакційного буфера і dCTP після 3-хвилинної денатурації кДНК при 95°С. Реакцію інкубували при 37°С на протязі 10 хвилин і фермент потім інактивували нагріванням до 70°С на протязі ще 10 хвилин. кДНК із приєднаним «хвостом» ампліфікували з використанням Taq-полімерази в реакції ПЛР із «гарячим стартом» (5 хвилин при 95°С; 30 секунд при 95°С, 30 секунд при 55°С і 45 секунд при 72°С - 35 циклів; 72°С на протязі 7 хвилин). Праймерами для цієї реакції були зворотний праймер, відповідний 5'- ділянці праймера для синтезу кДНК, і якірний праймер, специфічний для dC-лінкера і який складається, в основному, з залишків dG і невеликого числа dl. 1 мкл цієї реакції розбавляли додаванням 50 мкл води і 5 мкл отриманої суміші потім використовували для «гніздової» ПЛР (5 хвилин при 95°С - 1 цикл; 30 секунд при 95°С, 30 секунд при 55°С і 45 секунд при 72°С - 30 циклів; з химерною полімеразою KlenTaq) з якірним прямим праймером dG/dI і додатковим верхнім «гніздовим» ген-специфічним зворотнім праймером. 30 мкл «гніздової» реакції потім візуалізовали в 1,5%вому агарозному гелі і точний фрагмент вирізавали з гелю (Фіг.19). кДНК очищали відповідно до описаного вище з використанням гельрозпилювача Amicon і фільтра Micropure (Anucon, Beverly, MA) . Очищений зразок кДНК секвенували методом секвенування з кінцевою флуоресцентною міткою (Perkin Elmer, Norwalk, CN) . На матеріалі завершених фрагментів визначили консенсусну послідовність. На основі цієї послідовності 87470 56 була синтезована пара праймерів, що відповідали повнорозмірній кодуючій рамці гену CD28 кішки: Прямий feCD28: CGC GGA ТСС ACC GGT AGC АСА ATG АТС СТС AGG (SEQ ID NO: 13) Зворотний feCD28: CGC GGA TCC TCT GGA TAG GGG TCC ATG TCA G (SEQ ID NO: 14). З використанням цих праймерів молекулу кДНК, що включає повнорозмірну кодуючу ділянку, ампліфікували на матеріалі кДНК, синтезованої на РНК із РВМС, узятих у тварин ЕКб і ED3 і простимульованих Кон-А. Ця похідна від РВМС кДНК була отримана раніше і, як було встановлено, включала РНК, що відповідає даному гену. У даної ПЛР (5 хвилин при 95°С - 1 цикл; 30 секунд при 95°С, 30 секунд при 42°С і 45 секунд при 72°С - 30 циклів; 72°С на протязі 7 хвилин) використовували ДНК-полімеразу KlenTaq, що запобігає випадковим помилкам, що звичайно супроводжується при використанні Taq-полімерази, і в результаті одержали 754-нуклеотидний фрагмент, що клонували до складу клонуючого вектора ТА і секвенували відповідно до описаного раніше. Як і у випадку з молекулою CD80, кожен нуклеотид підтверджували принаймні за трьома незалежно отриманими послідовностями. Результати Вироджені праймери, обрані за параметрами консенсусних ділянок послідовностей кДНК CD28 мишей, людини і кролика, використовували в ПЛР з успішним одержанням продукту, що охоплює практично всю кодуючу послідовність кішки. Завдяки більш високому ступеню консерватизму, властивого молекулі CD28, у результаті вихідної ампліфікації з використанням даних вироджених праймерів одержали віртуальне повнорозмірну молекулу. На відміну від молекули CD80 кішки, у якій спочатку був отриманий тільки невеликий центральний фрагмент, у кодуючій рамці, кДНК CD28 не «вистачало» лише 113 «крайніх» 5'нуклеотидів (Фіг.20). Цей вихідний фрагмент послідовності виявляв 86%-вий рівень гомології з аналогічною ділянкою послідовності людини, 86%вий рівень гомології з кДНК кролика і 79%-вий рівень гомології з кодуючою послідовністю миші. Старт-кодон ATG і додаткові 110 нуклеотидів, а також деякі 5'-фланкуючі послідовності були виділені з застосуванням методу 5'-RACE (Gibco, Gaithersburg, МА). У реакції «приєднання хвоста» використовували кДНК, отриману на матеріалі РНК клітин РВМС кішки ЕК6, простимульованих Кон-А. На цьому матеріалі в результаті ампліфікації з праймером CD28-7 8 6 і якірним праймером dG одержали невеликий розрізняльний матеріал (Фіг.21). Хоча не було виявлено помітних бендів при ампліфікації з комбінацією праймерів dG/CD28786, розведену кДНК із цієї реакції ампліфікували з використанням «гніздових» праймерів для CD28 CD28-182 і CD28-239. Виразний бенд був присутній в області приблизно 600 пар нуклеотидів. Цей продукт виділили з агарозного гелю і секвенували з підтвердженням наявності в ньому 3'-фрагмента, включаючи старт-кодон і фланкуючу послідовність за його межами (Фіг.22). 57 87470 На основі нуклеотидної послідовності цих продуктів був сформований прямий праймер, що включав старт-кодон. Цей праймер у сполученні з 3'-конструкцією використовували для ампліфікації кДНК з екстрактів РНК клітин РВМС, взятих у тварин ЕК6 і ED3 і простимульованих Кон-А, і одержали 754-нуклеотидний фрагмент (Фіг.23). Принаймні два продукти від кожної тварини секвенували повністю і кожен нуклеотид перевіряли і підтверджували принаймні за трьома незалежним точно ліченими послідовностями. Після цього повнорозмірний продукт секвенували зі складу клонуючого вектора ТА з метою підтвердження точності і відтворюваності отриманого продукту. В остаточному 685-нуклеотидному фрагменті, що складає повну відкриту рамку, старт-кодон ATG знаходиться в положенні 1, стоп-кодон - у положенні 664-666, а ще 19 нуклеотидів складають 3'UTR (Фіг.24). Як і у випадку з молекулою CD80 кішки, положення старт-кодону ATG підтвердили за параметрами секвенування продуктів реакції 5'RACE (дані не включені). Ген CD28 кішки, будучи секвенованим, виявив найбільший рівень сумарної ідентичності з послідовностями кролика і людини (Фіг.25). Гомологія з кДНК також була значна, хоча ідентичність з послідовністю курки виражалася в меншому ступені і була порівняна з рівнями подібності інших генів, порівнюваних у курки і ссавців (табл. 2). Таблиця 2 Порівняння послідовностей CD28 кішки і CD28 миші, людини, курки і кролика Вид Людина Миша Кролик Курка Відсоток гомології з послідовністю кішки Амінокислотна Нуклеотидна 85% 82% 77% 74% 84% 84% 59% 50% Амінокислотна послідовність була розшифрована за нуклеотидною послідовністю відповідно до описаного вище. Величини ідентичності розшифрованої амінокислотної послідовності з іншими опублікованими послідовностями виявилися порівнянні з ідентичністю на рівні нуклеотидних послідовностей. Сигнальний сегмент пептиду простирається від старт-залишку метіоніну до 19-ої амінокислоти. Представляється, що, як і в інших клонованих поліпептидах CD28, у молекулі кішки єдиний позаклітинний варіабельний імуноглобуліноподібний домен приходиться на залишки 19-153. Гідрофобний трансмембранний домен займає наступні 27 залишки, а ще 41 амінокислота складають цитоплазматичний «хвіст». Як і молекула CD28 людини, поліпептид кішки включає п'ять сайтів потенційного N-глікозилування (Фіг.26). Порівняння розшифрованої амінокислотної послідовності білків CD28 кішки і людини показало наявність ділянок гомології при деяких розходженнях (Фіг.27). Більшість змін приходяться на трансмембранний домен, сигнальний сегмент і N 58 кінцевий домен. Найвищий рівень гомології характерний для центрального IgV-подібного домену і для цитоплазматичного «хвоста». Порівняння молекули CD28 кішки з розшифрованими амінокислотними послідовностями членів сімейства CD28/CTLA-4 людини і миші показало, що, хоча загальний рівень гомології членів цієї групи білків складає лише 25%, зберігаються специфічні ділянки і амінокислоти. Мотив MYPPPY зберігається в всіх членів цієї групи. В послідовності кішки передбачається наявність додаткових залишків, важливих для забезпечення структурної цілісності, включаючи ряд консервативних залишків цистеїну (Фіг.28). Цитоплазматичний домен у молекулі CD28 характеризується консерватизмом середнього ступеня в порівнянні з іншими опублікованими послідовностями, особливо послідовностями ссавців (Фіг.29). Передбачається, що різні внутрішньоклітинні сигнальні механізми опосередковуються перехресним зв'язуванням позаклітинного сегмента даного рецептора (Hutchcroft & Bierer, 1995). Графіки гідрофільності розшифрованої амінокислотної послідовності CD28 кішки при порівнянні з такими ж графіками поліпептиду людини додатково показують імовірність того, що кожен з цих білків характеризується подібною структурою. Однак, при наявності замін амінокислот це, очевидно, не приводить до істотних змін гідрофільності даної молекули: це відображає в основному гомологічну природу таких замін амінокислот. Потрібно відмітити, що дуже високий рівень подібності профілів гідрофільності характеризує трансмембранні домени пептидів кішки і людини (Фіг.30), що характеризуються лише 75%-вим рівнем гомології. Обґрунтування Усі послідовності клонованих молекул CD28 виявляють середній рівень еволюційного консерватизму. Можна припустити, що участь цієї молекули в активації і опосередкуванні Т-клітинного імунітету має місце в різних вищих хребетних тварин - від курячих птахів «через» гризунів і хижих ссавців до вищих приматів. Порівняння амінокислотних послідовностей кожної з цих молекул вказує на середній рівень гомології ділянок позаклітинного домену, що приблизно залучений у зв'язування ліганду, а також внутрішньоклітинних ділянок, що приблизно беруть участь у формуванні внутрішньоклітинних сигналів. У цілому, найвищий рівень гомології виявляється в ділянці, що оточує передбачуваний сайт зв'язування ліганду - MYPPPY, - розташований у складі IgV-подібного домену поліпептиду кішки, амінокислоти 118-123. Передбачуваний сигнальний сегмент відповідає ділянці від початкового метіоніну до 19-го залишку (Aruffo et al., 1987). Мономер CD28 складений єдиним позаклітинним варіабельним імуноглобуліно-подібним доменом, займаючим амінокислоти 19-153 (Aruffo et al., 1987). Гідрофобний трансмембранний домен приходиться на наступні 27 залишки, після якого розташований 41амінокислотний цитоплазматичний домен (Aruifo et al., 1987). Білок кішки включає 5 сайтів потенційного N-глікозилування в ідентичних положеннях сто 59 совно того, що було знайдено в поліпептиді людини. Цікаво, що сайтом глікозилування, що знаходиться в залишку 105 білка кішки, є мотив NQS, у той час як у послідовності людини він - NQT. Така амінокислотна дивергенція додатково підтверджує те, що, незважаючи на наявність змін у послідовностях, їх загальні структурні характеристики зберігаються. Як можна було очікувати виходячи з рівнів гомології, що виявляються цими білками, порівняння графіків гідрофільності CD28 кішки і людини показує, що ці молекули характеризуються в принципі подібними конформаційними параметрами. Однак також зрозуміло, що у випадку заміни амінокислоти результуючі зміни виявляються гомологічніми. При тому, що трансмембранний домен є областю даної молекули, що характеризується найменшим рівнем консерватизму при простому збереженні ним властивості гідрофобності, цитоплазматичний домен молекули CD28 кішки в порівнянні з іншими опублікованими послідовностями консервативний у середньому ступені. Передбачається існування ряду внутрішньоклітинних сигнальних механізмів, опосередкованих зв'язуванням на даному рецепторі, і, хоча внутрішньоклітинний сегмент поліпептиду CD28 не має власної каталітичної активності, проте зв'язування ним ліганду обумовлює активацію внутрішньоклітинних ефекторних молекул (Aruffo et al., 1987). Існує чотири консервативних залишки тирозину (положення 173, 188, 191 і 200), для яких передбачалося їх фосфорилування (Lu et al., 1992). З іншого боку, мотив MNM, що починається з 193 амінокислоти молекули кішки, розглядається як сайт домену SH2 у білках людини і миші (Prasad et al., 1995). Потенційний сайт фосфорилування за участю протеїнкінази-С залишається в залишку серину-185, у той час як треонін-202 може бути мішенню для атаки пролінорієнтованої активності серин-треонінових протеїнкіназ Erki або Erk2 (Hutchcroft & Bierer, 1996). Як зазначалося вище, сигнальна функція рецептора CD28 є різноманітною, тому зовсім не дивно те, що його цитоплазматичний домен включає трохи потенційних сайтів атаки для сигнальних медіаторів. Майбутнє використання молекули CD28 кішки повинне включати розробку способів виявлення поверхневої експресії цього рецептора і контролю експресії CD28 після зараження вірусом, таким як FIV. Якщо такий спосіб може бути об'єднаний із вже існуючими способами виявлення мРНК, то може бути отримана цінна інформація про рівень експресії в процесі інфікування. Наступний зв'язок параметрів експресії CD28 у ході хронічної FIVінфекції дозволить розглядати організм кішки як репрезентативну модель ВІЛ-інфекції людини, що дозволить дати більш точні дані про інфекційні процеси в обох видах організмів. Приклад 7 Експресія білків CD28/CD80 Введення При тому, що зв'язки в імунній системі за більшою частиною опосередковані «розчинними» (немембранними) факторами, ініціація первинної Т-клітинної відповіді в приматів і гризунів, як було 87470 60 встановлено, залежить від безпосереднього міжклітинного контакту (Mescher, 1992). Спочатку вважалося, що така взаємодія містить у собі лише взаємодію між TCR на поверхні Т-клітини і молекулою МНС на поверхні антиген-презентуючої клітини, однак потім стало зрозуміло, що зв'язування між допоміжними молекулами також необхідне для повної активації Т-клітини (Schwartz, 1992). Як обговорювалося вище, був отриманий доказ взаємодії між білками CD28 і CD80, як медіаторами такого допоміжного сигналу (Linsley et al., 1991a). Багато з важливих рецепторів і лігандів у хребетних тварин стосуються суперсімейства імуноглобулінів (Springer, 1990). Ці молекули характеризуються присутністю імуноглобуліно-подібної ділянки - звичайно в позаклітинній частині даної молекули (Buck, 1992). Хоча рівні консерватизму неоднакові, часто він обмежений саме тими залишками, що забезпечують просторове укладання білка за імуноглобуліновим типом (Веаіе, 1985). Характеристикою Ig-домену є наявність двох тісно взаємодіючих антипаралельних b-ланцюгів, зв'язаних петлею, що забезпечує консервативну топологію (Williams & Barclay, 1988). Хоча існують загальні ознаки структури членів даного сімейства, існує розмаїття у параметрах зв'язування і сигнальних властивостях у окремих представників даного сімейства (Andersen et al., 1988). Будучи членами сімейства IgSF, і CD28, і CD80 деякою мірою подібні за структурою своїх позаклітинних доменів. У CD28 існує єдиний Vподібний домен, хоча він і експресований у виді гетеродимеру, зв'язаного дисульфідними «містками» (Aniffo et al., 1987). Позаклітинна ділянка молекули CD80, однак, включає і V-, і С-подібні імуноглобулінові домени і експресується як мономер (Freedman et al., 1989). Оскільки члени сімейства IgSF характеризуються загальними структурними параметрами, принаймні в обмеженому ступені можна переносити деякі шаблони просторової структури на родинні молекули, що кристалізувати не вдається (Bajorath et al., 1993). Хоча кристалізація ні CD28, ні CD80 не була здійснена, методами рентгенографічної кристалографії були досліджені молекули CD2 (Driscoll et al., 1991) і CD8 (Leathy et al., 1992), що характеризуються аналогічними позаклітинними доменами, що дозволило визначити деякі принципи структури родинних молекул сімейства IgSF (Linsley et al., 1995а). Як зазначалося вище, CD80 і CD86 виявляють подібні активності за зв'язуванням на рецепторах CD28 і CTLA-4. Однак CD28 є менш афінним рецептором для цих лігандів, у той час як CTLA-4 більш афінний стосовно обох цих молекул (Linsley et al., 1994a). Хоча ймовірний механізм відомий, поки не зрозуміло, як низькоафінний рецептор, що характеризується високою швидкістю відщеплення ліганду, що характерно для CD28, здатний забезпечувати необхідний костимуляторний сигнал у диференціюванні Т-клітин (Linsley et al., 1995а). Передбачається, що зв'язування CD80 на CD28 на поверхні Т-клітин може сприяти олігомеризації даного рецептора, що і забезпечує ефективність зв'язування і вироблення сигналу (Linsley et al., 1995а). Було показано, що CD28 рівномірно роз