Виділена нуклеїнова кислота, що кодує ліганд сd86 кішки, діагностичний олігонуклеотид , клонуючий вектор, вакцина для модулювання імунної відповіді у кішки та способи індукціїї або пригнічення імунітету у кішки

1. Виділена нуклеїнова кислота, що кодує ліганд CD86 кішки, розчинний ліганд CD86 кішки або їх фрагменти, які мають імунорегуляторну актив (11) (21) 2000116864 (22) 30.04.1999 (24) 15.12.2006 (86) PCT/US99/09502, 30.04.1999 (31) 09/071,699 (32) 01.05.1998 (33) US (46) 15.12.2006, Бюл. № 12, 2006 р. (72) Коллісон Еллен В., US, Чой Ін-Соо , KR, Уінслоу Барбара Дж., US, Кокран Марк Д., US (73) ДЗЕ ТЕКСАС ЕЙ ЕНД ЕМ ЮНІВЕРСІТІ СІСТЕМ, US, ШЕРІНГ-ПЛАУ ЛТД., CH (56) Maher S. et al: "Porcine endothelial CD86 is a major costimulator of xenogeneic human T cells" JOURNAL OF IMMUNOLOGY, THE WILLIAMS AND WILKINS CO. BALTIMORE, US, vol. 157, no. 9, 1 November 1996 (1996-11-01), pages 3838-3844, XP002139206, ISSN: 0022-1767. WO A 9503408, 02.02.1995. Isono Takahiro et al: "Cloning and seguencing of the rabbit gene encoding T-cell costimulatiry molecules" 2 UA 1 (13) (54) ВИДІЛЕНА НУКЛЕЇНОВА КИСЛОТА, ЩО КОДУЄ ЛІГАНД СD86 КІШКИ, ДІАГНОСТИЧНИЙ ОЛІГОНУКЛЕОТИД , КЛОНУЮЧИЙ ВЕКТОР, ВАКЦИНА ДЛЯ МОДУЛЮВАННЯ ІМУННОЇ ВІДПОВІДІ У КІШКИ ТА СПОСОБИ ІНДУКЦІЇЇ АБО ПРИГНІЧЕННЯ ІМУНІТЕТУ У КІШКИ C2 ДО ПАТЕНТУ НА ВИНАХІД (19) ДЕРЖАВНИЙ ДЕПАРТАМЕНТ ІНТЕЛЕКТУАЛЬНОЇ ВЛАСНОСТІ 3 77382 4 ність, причому ліганд CD86 кішки кодується коду17. Вакцина за п.15 або 16, де ефективною кількісючою послідовністю SEQ ID NO: 5. тю є кількість від приблизно 0,01 мг до приблизно 2. Нуклеїнова кислота за п.1, де ліганд CD86 кішки 100 мг на одну дозу. містить амінокислотну послідовність SEQ ID NO: 6. 18. Вакцина за п.15 або 16, де ефективною кількіс3. Нуклеїнова кислота за п.1 або 2, де нуклеїнова тю є кількість від приблизно 0,25 мг/кг маси тіла кислота є РНК. кішки на добу до приблизно 25 мг/кг маси тіла кіш4. Нуклеїнова кислота за п.1 або 2, де нуклеїнова ки на добу. кислота є ДНК. 19. Вакцина за будь-яким з пп.15-18, що додатково 5. Нуклеїнова кислота за п.4, де ДНК є кДНК. містить імуноген, похідний від патогена. 6. Нуклеїнова кислота за п.4, де ДНК є геномною 20. Вакцина за п.19, де патоген є патогеном кішки, ДНК. вірусом сказу, хламідією, Тохорlаsmа gondii, 7. Діагностичний олігонуклеотид, що складається Dirofilaria immitis, патогеном блохи або бактеріальщонайменше з 12 нуклеотидів, який характеризуним патогеном. ється послідовністю, яка комплементарна послідо21. Вакцина за п.20, де патогеном кішки є вірус вності, що унікально присутня в нуклеїновій кислоімунодефіциту котячих (FIV), вірус лейкозу котячих ті за п.1 або 2, яка має нуклеотидну послідовність (FeLV), вірус інфекційного перитоніту котячих SEQ ID NO: 5. (FIP), вірус панлейкопенії котячих, каліцивірус ко8. Діагностичний олігонуклеотид за п.7, що склатячих, реовірус 3-го типу котячих, ротавірус котядається щонайменше з 15 або 16 нуклеотидів. чих, коронавірус котячих, респіраторно9. Діагностичний олігонуклеотид за п.7 або 8, де синцитіальний вірус котячих, вірус саркоми котяолігонуклеотид позначений міткою, що виявчих, герпесвірус котячих, вірус хвороби Борна кіляється. шок або паразит кішок. 10. Діагностичний олігонуклеотид за п.9, де мітка, 22. Спосіб індукції імунітету у кішки, що передбащо виявляється, містить радіоактивний ізотоп, чає введення кішці вакцини за будь-яким з флуорофор або біотин. пп.15-21. 11. Діагностичний олігонуклеотид за п.7 або 8, де 23. Спосіб посилення імунної відповіді у кішки, що олігонуклеотид вибірково метильований. передбачає введення кішці вакцини за будь-яким з 12. Клонуючий вектор, що містить нуклеїнову киспп.15-21. лоту за п.1 або 2. 24. Спосіб за п.22 або 23, де вакцину вводять під13. Вектор за п.12, позначений як В7-2# 19шкірно, внутрішньом'язово, системно, місцево або 2/011298 та депонований в АТСС під № 209821. перорально. 14. Вектор за п.12 або 13, що містить промотор, 25. Спосіб пригнічення імунної відповіді у кішки, що функціонально приєднаний до нуклеїнової киспередбачає введення кішці ефективно пригнічуюлоти. чої імунну відповідь кількості розчинного поліпеп15. Вакцина для модулювання імунної відповіді у тиду, що кодується нуклеїновою кислотою за п.1 кішки, що містить ефективну кількість поліпептиду, або 2. кодованого нуклеїновою кислотою за п.1 або 2, і 26. Спосіб за п.25, де вказана кількість складає від придатний носій. приблизно 0,25 мг/кг маси тіла на добу до прибли16. Вакцина за п.15, де поліпептид являє собою зно 25 мг/кг маси тіла на добу. ліганд CD86, розчинний ліганд CD86 кішки або їх 27. Спосіб за п.25, де кішка страждає на аутоімунфрагмент. не захворювання або є реципієнтом при пересадженні тканини або органа. Дана заявка має пріоритет [за патентною заявкою США N8 09/071699, поданою 1 травня 1998p.], повний зміст якої включений в дану заявку як посилання. У тексті даної заявки посилання на інші публікації приведені в дужках. Повну бібліографію для цих посилань можна знайти в кінці тексту безпосередньо перед списком послідовностей. Вміст цих публікацій в повному об'ємі включений в дану заявку як посилання з метою більш повного опису стану проблеми в тій області техніки, якої стосується даний винахід. Нині відсутні ефективні вакцини для профілактики імунодефіциту сімейства котячих і інфекційного перитоніту котячих у домашніх кішок. Зараз доступні вакцини проти вірусу лейкозу котячих, однак їх ефективність залишається сумнівною, а в ряді випадків вони можуть спричиняти захворювання. Отже, в даній області техніки є потреба в агентах і композиціях, які б захищали від цих і інших захворювань, проти яких поки що немає вакцин або вже існуючі і вакцини, що звичайно засто совуються проти цих захворювань, потрібно поліпшити. Крім того, утруднена вакцинація кошенят через неможливість протистояти материнським антитілам у них. Значить, також є необхідність в безпечних і ефективних агентах для подолання таких бар'єрів. Стимуляція в організмі активації і проліферації Т-лімфоцитів у відповідь на захворювання, як вважається, визначається двома взаємодіями: розпізнаванням Т-клітинного рецептора (TCR) імуногенними пептидами з участю молекул класу І головного комплексу гістосумісності (МНС) і повторна взаємодія допоміжних лігандів, таких як CD80 і CD86, з відповідними їм рецепторами CD28 і (або) CTLA-4 - на поверхні Т-лімфоциту. Ефективна взаємодія цих двох механізмів зумовлює активацію і проліферацію і СD4-позитивних, і СD8-позитивних Т-клітин і збільшення вироблення імунорегуляторних цитокінів типів Th1 і Th2. У відсутність адекватної костимуляції Т-клітин може розвиватися анергічний стан, при якому Т-клітини 5 77382 6 не здатні проліферувати і виділяти цитокіни. Пропісля зв'язування з участю антигену МНС, що знатягом багатьох років ключовими регулювальникаходиться на антиген-презентуючих клітинах (АРС), ми Т-клітинних відповідей вважалися дві молекули зумовлює передавання сигналу через нековалент- рецептор CD28 і його ліганди CD80 і CD86. CD28 ний комплекс поверхневих молекул, включаючи є первинним Т-клітинним костимуляторним рецепCD3 і δ-субодиниці (Clevers et al., 1988). Зв'язувантором, який за зв'язуванням з CD80 і CD86 посиня на TCR зумовлює фосфорилування CD3лює проліферацію Т-клітин і синтез цитокінів, закомплексу, що непрямим чином приводить до внепобігаючи загибелі Т-клітин. CTLA-4 (що також сення в клітину іонів кальцію, внаслідок чого відпозначається як CD152), що є гомологом CD28, бувається ініціація вироблення IL-2 і IL-2R (Weiss також відображає важливу роль в процесі кости& Littman, 1994). Цей каскад розглядається як помуляції. Хоча точно не визначено, передбачаєтьчаткова подія в активації Т-клітин. ся, що він пригнічує костимуляторні Т-клітинні відTCR розпізнає антиген тільки тоді, коли він повіді. Взаємодія між CD28, CTLA-4 і їх лігандами презентований з участю МНС. Відомі два класи CD80 і CD86 в процесі костимуляції є ключем до МНС-білків, які пов'язані з процесом презентуваніндукції і супресії імунних відповідей на захворюня антигену на Т-клітині. Молекули класу І МНС вання в організмі загалом. Шляхом маніпулювання виявляються практично на всіх ядерних клітинах цими чотирма костимуляторними молекулами, тіла, і їх функцією є перенесення ендогенних, пепмабуть, можна регулювати. Т-клітинну відповідь за тидів на поверхню клітин (Matasumura et al., J992). шляхом активації, пригнічення або зміни. надряму, Пептид, експресований з участю МНС класу І, розможна посилювати бажану імунну відповідь за пізнається Т-клітинами, експресуючими CD 8 в відношенням до конкретного патогену або захвоскріпленні з TCR (Littman, 1987). С08-позитивні Трювання. Зокрема, вони можуть бути використані клітини виконують функцію імунного нагляду за для вакцинації проти інфекційних захворювань, знищенням клітин, заражених вірусом, і пухлинних для лікування інфекційних захворювань і лікування клітин . Розпізнавання Т-клітиною CD8+ «чужих» пухлинних дегенеративних, аутоімунних і імуномолекул (пептидів або змінених своїх пептидів, що дефіцитних станів. може свідчити про розвиток пухлини) зумовлює Т-лімфоцити імунної системи ссавців виконуруйнування цієї клітини, здійснюване з участю циють і регуляторні, і ефекторні функції. Попереднитотоксичних Т-лімфоцитів (CTL) (Berke, 1994). ки Т-клітин виникають в кістковому мозку з стовбуМолекули класу II МНС, що представляють рових клітин і мігрують в тимус. У тимусі другу групу чинників головного комплексу гістосувідбуваються процеси дозрівання і селекції з утвомісності, в нормі виявляються тільки у спеціалізоренням популяції наївних імунокомпетентних кліваних антиген-презентуючих клітинах, включаючи тин, які здатні розпізнавати антиген при його преВ-лімфоцити, макрофаги/моноцити і дендритні зентації в поєднанні з головним комплексом клітини, хоча можлива їх індукція і в деяких інших гістосумісності (МНС), але при цьому не є ауторетипах клітин у відповідь на специфічні стимули активними. Після дозрівання в тимусі кожна Т(Germain, 1993). Молекула класу II МНС відповідає клітина несе клональний Т-клітинний рецептор за презентовання зовнішнього антигену на СD4(TCR), який визначає її антигенну специфічність. позитивну Т-клітину. Антиген, який був фагоцитіКрім того, Т-клітини двох основних підкласів, що ваний, ендоцитований або пов'язаний поверхневиявляються у більшості дорослих ссавців - CD4+ і вим Ig з подальшим поглинанням клітиною, зазнає ендогенної обробки і зв'язується з молекулою клаCD8+, - несуть TCR, складений - і βсу II МНС (Unanue, 1987). Потім така молекула субодиницями (Allison & Lanier, 1987). виходить на поверхню клітини і стає доступною Поліпептидна і генна організація білка TCR для розпізнавання її СD4-позитивними Т-клітинами схожа з такою, характерною для молекул імуноглобуліну (Ig), і вона виявляє характеристики, які β-TCR (Littman, 1987). Розпізнавання антигену Тсхожі в порівнянні з мембранозв'язаними Ig Вклітинами CD4+ зумовлює вироблення цитокінів і лімфоцитів (Allison & Lanier, 1987). Як і молекула чинників росту, необхідних для ініціації і поширенIg, TCR потенційно повинен розпізнавати безліч ня різних елементів активної імунної відповіді можливих антигенних послідовностей. З цієї точки (Mosmann & Coffman, 1987). зору організація і реаранжування гену TCR схожа Диференціювання груп Т-клітин β-TCR виза своєю складністю з такими в В-клітинах (Davis & значається наявністю CD4 і CD8, що пов'язано з Bjorkman, 1988). Як і у випадку з імуноглобулінами детермінацією функцій кожної з цих В-клітин, утворення ідіотипічного різноманіття Тгруп.Одночасна присутність CD4 і CD8 на Т-клітині клітин пов'язане з наявністю множинних копій генів виключена (Littman, 1987). Тобто в процесі селекваріабельних доменів (V) в лінії статевих клітин, ції і дозрівання в тимусі Т-клітини- β отримують що відбуваються випадковим чином реаранжувантільки CD4 або CD8. Ці молекули забезпечують нями - і β-субодиниць і з мінливістю, що зумовстабільність взаємодії між TCR і МНС-пов'язаним люється явищами з'єднань і вставок (Davis & антигеном і визначають для даної Т-клітини те, Bjorkman, 1988). Однак, на відміну від В-клітин, яким класом молекул МНС (І або II) презентується утворення різноманіття Т-клітин, мабуть, не пов'яантиген (Littman, 1987). Скріплюючий домен молезане з соматичними мутаціями, хоч потенційний кули CD4 або CD8 розпізнає відповідну неполіморепертуар молекул TCR не поступається такому рфну ділянку молекули класу І або класу II молекул Ig (Lechler et al., 1990). (Clayberger et al., 1994). Скріплення CD4 або CD8 з Молекула TCR, хоч і відповідає за розпізнацими специфічними ділянками забезпечує стабівання антигену, не здібна до передавання сигналу льність взаємодії TCR і МНС-зв'язаного антигену з (Allison & Lanier, 1987). Конформаційні зміни TCR точки зору ініціації Т-клітинної активації (Littman, 7 77382 8 1987). Таким чином, СО4-позитивні Т-клітини фунвідповіді 1-го типу, що, в свою чергу, є чинником кціонально взаємодіють тільки з клітинами АРС, негативної регуляції гуморальної відповіді презентуючими антиген за допомогою молекул (Mosmann & Coffman, 1989). класу II і ініціюючим тим самим Т-хелперну відпоКлітинні відповіді (1-й тип) індукуються не так, відь, в той час як CD8-позитивні Т-клітини розпіяк гуморальні відповіді (2-й тип) (Sher et al., 1992). знають тільки антиген, що презентується з участю Після активації Т-клітин і їх дозрівання для відпомолекул класу І, після зв'язування якого ініціюєтьвіді 1-го типу цією Т-клітиною виробляються чинся цитотоксична відповідь (Germain, 1993). Два ники, які сприяють клітинному імунітету. IL-2 є Тфенотипи- Т-хелпери і CTL, що розрізнюються клітинним чинником росту, який також активує можуть бути ідентифіковані за поверховоCTL-відповіді, в той час як -інтерферон активує клітинною експресією або CD4, або CD8. макрофаги, CTL і нейтрофіли (Wang et al., 1993). Більшість СD4-позитивних Т-лімфоцитів загаТаким чином, Т-хелпери здатні опосередковулом розглядаються як Т-хелперна популяція, хоч є вати дві принципово взаємовиключаючі відповіді. і передбачуваний СО4-позитивний CTL-підтип Ознака секреції цитокінів, пов'язана з ініціацією (Yasukawa et al., 1989). СD4-позитивні Т-хелпери є гуморальної відповіді, включає чинники, які є супосновними регулювальниками імунної відповіді за ресорами клітинної відповіді, і навпаки (Mosmann рахунок вироблення серії стимуляторних і супре& Coffman, 1989). Поки не зрозуміло, що примушує сорних цитокінів (Mosmann & Coffman, 1987). ЧинТ-клітину виявляти або ознаку 1-го типу (виробники, що виробляються цими клітинами є важлилення IL-2, -інтерферону і лімфотоксину), або вими медіаторами ініціації і гуморального, тобто ознаку 2-го типу (IL-4, IL-5, IL-6, IL-10 і IL-13), хоча опосередкованого антитілами, і клітинного, тобто передбачається, що на варіант цитокінового прогіперчттєвості сповільненого типу (DTH), відповіфілю, що формується можуть впливати тип АРС, дей (Mosmann & Coffman, 1987). Для того, щоб Тяка презентує даний антиген, або розчинні чинниклітини CD4+ активувалися за виробленням розки, що виробляються цією АРС (Mosmann & чинних чинників росту, повинен відбуватися склаCoffman, 1989). У доповнення до хелперних клітин дний каскад процесів. Антиген виявляється і за1-го і 2-го типів існує так званий 0-й тип хелперів, знає ендоцитозу специфічними АРС-клітинами, які який характеризується параметрами цитокінової в нормі є макрофагами (Unanue, 1984). АРС денасекреції, проміжними за відношенням до 1-го і 2-го турують антигенний білок і розділяють його на метипів (Gajewski et al., 1989). Хоча типи хелперів в нші фрагменти, після чого 15-18-амінокислотні основному були охарактеризовані в експерименпептиди зв'язуються молекулами МНС в ендоплатах in vitro, тобто можуть відображати культуральні зматчному ретикулюмі і після цього переносяться артефакти, вони є важливими моделями тієї ролі, на поверхню клітини (Rotzschke et al., 1994). Переяку Т-хелпер відображає в контролі розвитку спенесений на поверхню антиген стає в результаті цифічних відповідей в ситуації in vivo. «видимим» для Т-клітин і може бути розпізнаний У доповнення до СD4-позитивних Т-хелперних групами Т-клітин, експресуючих CD4 і, які мають лімфоцитів друга популяція Т-клітин- β складена відповідний TCR-ідіотип (Germain, 1993). Коли відСD8-позитивними цитотоксичними лімфоцитами бувається точне розпізнавання антигену Т(CTL). Вважається, що CTL-CD8+ відіграють ведучу клітиною і утворяться точні допоміжні сигнали, роль в системі імунного нагляду, основна функція відбувається диференціювання «наївного» лімфоякої пов'язана з руйнуванням клітин, інфікованих циту і запускається його клональна проліферація. вірусами або внутрішньоклітинними бактеріями, а За, поки що не встановленними причинами, відбутакож пухлинних клітин (Berke, 1994). Ці клітини вається переважне формування відповіді 1-го типу також способи виробляти цитокіни, але, загалом, (клітинного) за відношенням до відповіді 2-го типу тільки такі, які пов'язані з індукцією клітинних від(гуморального) (Mosmann & Coffman, 1989). повідей (IL-2, -інтерферон і TNF) (Fong & Участь Т-хелперів є необхідними для забезпеMosmann, 1990). Рецептор TCR цих клітин з учасчення активності і гуморальної, і клітинної відповітю CD8 розпізнає антиген, презентований за додей. У залежній від Т-клітин В-клітинної відповіді, помогою молекул класу І МНС (Littman, 1987). Занеобхідної для вироблення антитіл до більшості галом, всі ядерні клітини характеризуються антигенів, Т-хелпери потрібні для забезпечення поверхневою експресією молекул класу І, що преправильного дозрівання В-клітин (Chesnut et al., зентують внутрішньоклітинно синтезовані пептиди 1986). Після того, як експресований В-клітиною (Matasumara, 1992). Специфічні за імунною активповерхневий Ig зв'язав антиген, відбувається інтеністю ділянки, включаючи головний мозок і сім'ярналізація, процесинг і вивід антигену на поверхню ники, характеризуються низьким рівнем білкового молекулами класу II МНС (Germain, 1993). Безпосинтезу, хоч він і індукується в цих ділянках під середній міжклітинний контакт між Т-клітиною впливом інтерферону (Moffett & Paden, 1994). + CD4 , що має точний TCR-ідіотип, і В-клітиною Білки, що виробляються в ендоплазматичному сприяє активації і проліферації цієї Т-клітини ретикулюмі в ході нормальної життєдіяльності клі(Chesnut et al., 1986). Активований Т-хелпер може тини, денатуруються, частково розщеплюються і ініціювати відповідь 2-го типу за рахунок секреції за допомогою молекул класу І МНС виносяться на чинників, необхідних для росту і диференціювання поверхню (Engelhard, 1994). Ці поліпептиди протеВ-клітин (Mosmann & Coffman, 1989). Цими чинниолітично лінеаризуються і зв'язуються у вигляді 9ками є інтерлейкіни IL-4, IL-5 і IL-13, які здатні інду12-амінокислотних епітопів молекулами класу І, які кувати активацію і проліферацію В-клітин, а також потім виносяться на поверхню цієї клітини важливі в процесі ізотипічного перемикання моле(Engelhard, 1994). Теоретично таким чином на покул антитіл, в той час як IL-10 запобігає ініціації верхні можуть виявитися будь-які внутрішньоклі 9 77382 10 тинно синтезовані білки, тому внаслідок селекції в вності (Springer et al., 1987). CD2 є одним з перших тимусі зумовлюється ідеальна елімінація всіх аумаркерів, експресованих попередниками Ттореактивних Т-клітин, а система імунного нагляду лімфоцитів, і існує протягом всього життя цієї кліможе виявити присутність інфікованих вірусом або тини, в той час як LFA-1 експресується Ттрансформованих клітин (Berke, 1993). Розпізнаклітинами пізніше і позитивно регулюється в клітивання чужорідних пептидів, експресованих моленах пам'яті або за типом індуцибельності (Springer кулами класу І, здійснюється антигенet al., 1987). специфічними Т-клітинними рецепторами на повеКомплекси допоміжних молекул також вияврхні CTL-CD8+ (Lechler et al., 1990). Для активації ляють адгезійні властивості, але їх основною фуннеобхідний контакт між ефекторною клітиною і кцією, мабуть, є передавання міжклітинного сигнамішенню (Berke, 1994). Коли антиген, що розглялу після зв'язування ліганду (Anderson et al., 1988). дається як чужорідний, детектується рецептором Після встановлення взаємодії між рецептором і TCR, взаємодія молекул стабілізується за рахунок його лігандом відбувається така зміна конформазв'язування CD8 з молекулою класу І на поверхні ційної структури молекули, яка зумовлює передаінфікованої клітини (Littman, 1987). Після розпізнавання сигналу в цитоплазму однієї або обох клітин вання і активації Т-клітини утвориться «кон'югат» (Hutchcroft & Bierer, 1994). Сигнали, що передаміж клітиною-мішенню і ефекторною Т-клітиною, ються цими молекулами виконують ряд функцій після чого ефекторна клітина знищується (Taylor & для сприянню розвитку Т-клітин, однак у відсутCohen, 1992). Таким чином, в такому механізмі при ність сигналів, опосередкованими цими молекулазміні власних білків або при порушенні, клітинних ми, Т-клітини можуть ставати анергічними (Leung механізмів внаслідок атаки патогену пептиди ста& Lindsley, 1994). ють розпізнаваними системою імунного нагляду, Взаємодія CD28/CD80 є основним компоненвнаслідок чого даний елемент імунної системи том інтенсивної імунної відповіді, опосередкованозабезпечить знищення хворої клітини (Berke, го Т-клітинами (Linsley et al., 1993a). Взаємодія 1994). допоміжних молекул CD28 з відповідним лігандом Цитотоксичність, як вважається, зумовлюється CD80 необхідна для повної активації і проліфераодним з двох основних механізмів. Або в клітині ції «наївних» Т-клітин (Linsley et al., 1991а). Також індукується апоптоз, або вона лізується з участю ця взаємодія, як вважається, відображає ключову цитотоксичних гранул, що секретуються CTL роль в проліферації активованих СD4-позитивних (Berke, 1993). Апоптоз в клітинах-мішенях індукуТ-клітин пам'яті і в запобіганні апоптотичної загиється шляхом секреції клітинами CTL чинників, які белі клітин (Linsley et al., 1991a). Встановлення індукують експресію генів, що зумовлюють загитакої взаємодії і розшифрування його механізмів бель клітини (Russel, 1983). Перевагою цього медає ключ до розуміння процесів імунітету, опосеханізму є відсутність лізису клітини, що знижує редкованого Т-клітинами. імовірність виходу потенційно інфекційно небезпеДаний винахід стосується виділеної і очищеної чного вмісту цієї клітини (Nagata & Golstein, 1995). ДНК, що кодує ліганд CD80 (В7-1) кішки, ліганд Однак, клітинний лізис може бути найбільш загаCD86 (В7-2) кішки, рецептор CD28 кішки або рецельним механізмом, відповідно до якого відбуваптор CTLA-4 (CD152) кішки, а також векторів, що ється направлене знищення клітин. Основним включають нуклеїнову кислоту, що кодує CD80 компонентом «цитотоксичних гранул», що виробкішки, CD86 кішки, CD28 кішки або CTLA-4 кішки. ляються клітинами CTL є білок перфорин, який Даний винахід стосується клітин-господарів, тран«протикає» мембрани клітин-мішеней (Liu et al., сформованих CD80-кодуючими векторами, CD861995). Хоч існують і інші типи клітин, залучених до кодуючими векторами, CD28-кодуючими вектораданої форми імунного нагляду, вважається, що ми або CTLA-4-кодуючими векторами. Даний виCTL є основним компонентом противірусного і нахід стосується поліпептидів, що кодуються нукпротипухлинного імунітету і розглядаються як нелеїновою кислотою CD80 кішки, CD86 кішки, CD28 обхідна ланка в захисті від конкретних патогенів кішки або CTLA-4 кішки. (Kupfer & Singer, 1989). Даний винахід стосується вакцини, що містить Початково поверхово-клітинні білки викорисефективну кількість поліпептидів, що кодуються товувалися для розмежування конкретних клітиннуклеїновою кислотою CD80 кішки, CD86 кішки, них популяцій. Пізніше були встановлені функціоCD28 кішки або CTLA-4 кішки. Також даний винанальні аспекти багатьох з цих молекул, а з хід стосується вакцин, які додатково містять імуноурахуванням їх значення для диференціювання гени, похідні від патогенів. Даний винахід стосуклітинних популяцій стала більш зрозумілою їх ється вакцин, здатних посилювати імунну важлива роль в функціонуванні багатьох клітин . відповідь. Також даний винахід стосується вакцин, Різні допоміжні молекули і молекули адгезії, які здатних пригнічувати імунну відповідь. беруть участь в розвитку імунної відповіді, експреФіг.1А. Нуклеотидна і амінокислотна послідовсуються Т-клітинами і антигенм-презентуючими ності CD80 (В7-1) кішки (TAMU) (SEQ ID NO: 1 і 2). клітинами (van Seventer et al., 1991). Молекули Фіг.1В. Спектр гідрофобності амінокислотної адгезії експресуються на певному рівні більшістю послідовності CD80 (В7-1) кішки (TAMU). клітин імунної системи. Вони важливі для збереФіг.2А. Нуклеотидна і амінокислотна послідовження клітин в певній ділянці і для ініціації і підтності CD80 (В7-1) кішки (SYNTRO) (SEQ ID римки міжклітинних контактів (Mescher, 1992). NO: 3 і 4). Два комплекси молекул адгезії - CD2/LFA-3 Фіг.2В. Спектр гідрофобності амінокислотної (CD58) і LFA-1/ICAM-1 - беруть участь в стабілізапослідовності CD80 (В7-1) кішки (SYNTRO). ції взаємодії Т-клітин і клітин АРС і посиленні актиФіг.3А. Нуклеотидна і амінокислотна послідов 11 77382 12 ності CD86 (В7-2) кішки (SEQ ID NO: 5 і 6). чає нуклеїнову кислоту, що кодує ліганд CD80 кішФіг.3В. Спектр гідрофобності амінокислотної ки або розчинний ліганд CD80 кішки. У іншому послідовності CD86 (В7-2) кішки. здійсненні даного винаходу представляється плаФіг.4А. Нуклеотидна і амінокислотна послідовзмідний вектор, позначений PSI-B7-1/871-35 [Коності CD28 кішки (SEQ ID NO: 7 і 8). лекція АТСС, депозитарний N8 209817]. Ця плазФіг.4В. Спектр гідрофобності амінокислотної міда була депонована [в Американську колекцію послідовності CD28 кішки. типових культур (АТСС) 29 квітня 1998 року (адреФіг.5А. Нуклеотидна і амінокислотна послідовса якої - 10801 University Boulevard, Manassas, VA ності CTLA-4 (CD 152) кішки (SEQ ID NO: 9 і 10). 20108-0971, США)] відповідно за Будапештською Фіг.5В. Спектр гідрофобності амінокислотної угодою про Міжнародні правила депонування мікпослідовності CTLA-4 (CD 152) кішки. роорганізмів для цілей здійснення процедури паДаний винахід представляє виділену нуклеїтентування. нову кислоту, що кодує ліганд CD80 кішки або розДаний винахід представляє вектор, що включинний ліганд CD80 кішки. Також даний винахід чає нуклеїнову кислоту, що кодує ліганд CD86 кішпредставляє виділену нуклеїнову кислоту, що коки або розчинний ліганд CD86 кішки. У іншому дує ліганд CD86 кішки або розчинний ліганд CD86 здійсненні даного винаходу представляється плакішки. Також даний винахід представляє виділену змідний вектор, позначений В7-2# 19-2/011298 нуклеїнову кислоту, що кодує рецептор CD28 кішки [АТСС, депозитарний №209821]. Ця плазміда була або розчинний рецептор CD28 кішки. Також даний депонована [в Американську колекцію типових винахід представляє виділену нуклеїнову кислоту, культур (АТСС) 29 квітня 1998 року (адреса якої що кодує рецептор CTLA-4 кішки або розчинний 10801 University Boulevard, Manassas, VA 20108рецептор CTLA-4 кішки. 0971, США)] відповідно за Будапештською угодою У одному з здійснень даний винахід представпро Міжнародні правила депонування мікроорганіляє нуклеїнову кислоту, що кодує ліганд CD80 кішзмів для цілей здійснення процедури патенки, який характеризується амінокислотною послітування. довністю, показаною на Фіг.1А, починаючи із Даний винахід представляє вектор, що вклюзалишку метіоніну і закінчуючи залишком треоніну чає нуклеїнову кислоту, що кодує рецептор CD28 (SEQ ID NO: 1). У іншому здійсненні даний винахід кішки або розчинний рецептор CD28 кішки. У інпредставляє нуклеїнову кислоту, що кодує ліганд шому здійсненні даного винаходу представляється CD86 кішки, який характеризується амінокислотплазмідний вектор, позначений PSI-CD28-#7/l ною послідовністю, показаною на фіг. 3А, почина00296 [АТСС, депозитарний №209819]. Ця плазміючи із залишку метіоніну і закінчуючи залишком да була [депонована в Американську колекцію глутаміну (SEQ ID NO: 5). Ще в одному здійсненні типових культур (АТСС) 29 квітня 1998 року (адреданий винахід представляє нуклеїнову кислоту, що са якої - 10801 University Boulevard, Manassas, VA кодує рецептор CD28 кішки, який характеризуєть20108-0971, США)] відповідно за Будапештською ся амінокислотною послідовністю, показаною на угодою про Міжнародні правила депонування мікФіг.4А, починаючи із залишку метіоніну і закінчуюроорганізмів для цілей здійснення процедури пачи залишком серину (SEQ ID NO: 7). У іншому тентування. здійсненні даний винахід представляє нуклеїнову Даний винахід представляє вектор, що вклюкислоту, що кодує рецептор CTLA-4 кішки, який чає нуклеїнову кислоту, що кодує рецептор CTLAхарактеризується амінокислотною послідовністю, 4 кішки або розчинний рецептор CTLA-4 кішки. У показаною на Фіг.5А, починаючи із залишку метіоіншому здійсненні даного винаходу представляніну і закінчуючи залишком аспарагіну (SEQ ID ється плазмідний вектор, позначений CTLA-4-# NО: 9). 1/091997 [АТСС, депозитарний №209820]. Ця плаУ здійсненні винаходу, що описується вище зміда була депонована [в Американську колекцію нуклеїновою кислотою є ДНК або РНК. У іншому типових культур (АТСС) 29 квітня 1998 року (адрездійсненні ДНК є кДНК або геномною ДНК. са якої -10801 University Boulevard, Manassas, VA Даний винахід представляє олігонуклеотид, 20108-0971, США)] у відповідності за Будапештсьщо складається принаймні з 12 нуклеотидів, що кою угодою про Міжнародні правила депонування характеризується комплементарністю за відномікроорганізмів для цілей здійснення процедури шенням до унікальної послідовності, що є в складі патентування. нуклеїнової кислоти, що кодує CD28, CD80, CD86 Даний винахід представляє описаний вище або CTLA-4, описаної вище. У іншому здійсненні вектор, який додатково включає промотор, функданого винаходу представляється олігонуклеотид, ціонально приєднаний до нуклеїнової кислоти. У що складається принаймні з 15 або 16 нуклеотиіншому здійсненні даний винахід представляє клідів, який характеризується комплементарністю за тину-господаря, яка несе будь-який із згадуваних відношенням до унікальної послідовності, присутвище векторів. У одному із здійсненні такою клітиньої в складі нуклеїнової кислоти, що кодує CD28, ною-господарем, несучою один із згаданих вище CD80, CD86 або CTLA-4, описаної вище. векторів, є еукаріотична або прокаріотична клітиУ іншому здійсненні винаходу, що описується на. У іншому здійсненні клітиною-господарем є вище представляється олігонуклеотид, який поміклітини Е.соlі, клітини дріжджів, клітини COS, клічений міткою, що визначається. У одному із здійстини PC12, клітини СНО або клітини GH4C1. ненні міткою, що виявляється є радіоактивний ізоДаний винахід представляє поліпептид, що топ, флуорофор або біотин. У іншому здійсненні кодується нуклеїновою кислотою ліганду CD80 такий олігонуклеотид виборче метилований. кішки або розчинним ліганду CD80 кішки. У здійсДаний винахід представляє вектор, що вклюненні даного винаходу представляється поліпеп 13 77382 14 тид, що кодується нуклеїновою кислотою ліганду нуклеїновою кислотою CTLA-4 кішки, в кількості від CD86 кішки або розчинним лігандом CD86 кішки. У приблизно 0,25мг на 1кг ваги тіла на день до 25мг іншому здійсненні даного винаходу представляна 1кг ваги тіла на день. У іншому здійсненні винається поліпептид, що кодується нуклеїновою кисходу представляється спосіб пригнічення імунної лотою рецептора CD28 кішки або розчинного ревідповіді у кішки шляхом введення поліпептиду, цептора CD28 кішки. Даний винахід представляє що кодується CD80 кішки, CD86 кішки або. GD28 поліпептид, що кодується нуклеїновою кислотою кішки, в кількості від приблизно 0,25мг на 1кг ваги рецептора -CTLA-4 кішки або розчинного рецептотіла на день до 25мг на 1кг ваги тіла на день. ра CTLA-4 кішки. Також даний винахід представляє спосіб пригУ іншому здійсненні даного винаходу предстанічення імунної відповіді у кішки з діагнозом аутоівляється спосіб продукції згадуваних вище поліпемунного захворювання або у кішки-реципієнта пептидів шляхом культивування клітини-господаря, ресадки тканини або органу шляхом введення цій яка експресує ці поліпептиди, і виділення цих полікішці ефективної за пригніченням імунної відповіді пептидів, що отримуються таким чином. кількості поліпептиду, що кодується нуклеїновою Даний винахід представляє вакцину, що міскислотою CTLA-4 кішки. тить ефективну кількість згадуваних вище поліпепДаний винахід також представляє спосіб пригтидів і відповідного носія. У іншому здійсненні винічення імунної відповіді у кішки з діагнозом аутоінаходу представляється вакцина, в складі якої мунного захворювання або у кішки-реципієнта пеефективна кількість згаданого вище поліпетиду і ресадки тканини або органу шляхом введення цій відповідного носія є кількістю від приблизно 0,01мг кішці ефективної за пригніченням імунної відповіді до приблизно 100мг на 1 дозу. У іншому здійсненні кількості поліпептиду, що кодується CD80 кішки, винаходу представляється вакцина, в якій ефектиCD86 кішки або CD28 кішки. вна кількість згаданого вище поліпетиду і відповідДаний винахід представляє виділену і очищеного носія є кількістю від приблизно 0,25мг на 1кг ну кДНК CD80 (В7-1) довжиною приблизно 941 ваги тіла кішки на день до приблизно 25мг на 1кг нуклеотидів. Винахід також представляє виділений ваги тіла кішки на день. і очищений поліпептид CD80 кішки, що складаєтьДалі даний винахід представляє згадувану ся приблизно з 292 амінокислот, що є зв'язаною з вище вакцину, яка додатково містить імуноген, мембранною або зрілою формою з молекулярною похідний від патогену. У іншому здійсненні винамасою 33,485кДа, ізоелектричною точкою приблиходу такий імуноген в складі вакцини походить від зно рІ=9,1 і загальним зарядом при рН=7,0 рівним котячого патогену, вірусу сказу, хламідії, 10. Коекспресія CD80 з костимуляторною молекуToxoplasma gondii, Dirofilaria immitis, бліх або баклою CD28 і з пухлинним антигеном або антигеном терійних патогенів. У іншому здійсненні винаходу патогенного організму виявляє здібність до актипредставляється вакцина, в складі якої патогеном вації або посилення активації Т-лімфоцитів, індує вірус імунодефіциту котячих (FIV), вірус лейкозу куючи тим самим вироблення імуностимулюючих котячих (FeLV), вірус інфекційного перитоніту коцитокінів, і до регуляції росту інших клітинних титячих (FIP), вірус панлейкопенії котячих, каліцивіпів. Коекспресія CD80 з костимуляторною молекурус котячих, реовірус котячих 3-го типу, ротавірус лою CTLA-4 виявляє здібність до регуляції активакотячих, коронавірус котячих, респіраторносинциції Т-лімфоцитів. тиальний вірус котячих, вірус саркоми котячих, Даний винахід представляє виділену і очищегерпесвірус котячих, вірус хвороби Борна кішок ну кДНК CD86 (В7-2) довжиною приблизно 1176 або котячий паразит. нуклеотидів. Також винахід представляє виділений Також даний винахід представляє спосіб індуі очищений поліпептид CD86 кішки, що складаєтькції імунітету у кішок, який включає введення кішці ся приблизно з 320 амінокислот, що є зв'язаною з дози вакцини, що містить будь-який з імуногенів, мембранною або зрілою формою з молекулярною що вказувалися вище. Також даний винахід предмасою 36,394кДа, ізоелектричною точкою приблиставляє спосіб посилення імунної відповіді у кішки, зно рІ=9,19 і загальним зарядом при рН=7,0 рівну який включає ефективну дозу поліпептиду, імуно11,27. Коекспресія CD86 з костимуляторною молегену і відповідного носія. Даний винахід представкулою CD28 і з пухлинним антигеном або антигеляє спосіб введення згадуваної вище вакцини підном патогенного організму виявляє здібність до шкірно, внутрішньом'язово, системно, місцево або активації або посилення активації Т-лімфоцитів, перорально. індукуючи тим самим вироблення імуностимулююУ іншому здійсненні даного винаходу предстачих цитокінів, і до регуляції росту інших клітинних вляється спосіб пригнічення імунної відповіді у типів. Коекспресія CD86 з костимуляторною молекішки, який включає введення цій кішці ефективної кулою CTLA-4 виявляє здібність до регуляції актиза пригніченням імунної відповіді кількості поліпепвації Т-лімфоцитів. тиду, що кодується нуклеїновою кислотою CTLA-4 CD80 або CD86 кішки за даним винаходом букішки. У іншому здійсненні винаходу представляли отримані з нативних або рекомбінантних джеється спосіб пригнічення імунної відповіді у кішки, рел. CD80 або CD86 кішки за даним винаходом що включає введення цій кішці ефективної за привключають нативну і зв'язану з мембраною форму гніченням імунної відповіді кількості розчинного або форму, що секретується, яка втратила трансполіпептиду, що кодується CD80 кішки, CD86 кішки мембранний домен. або CD28 кішки. Даний винахід представляє виділену і очищеУ іншому здійсненні даного винаходу предстану кДНК CD28 довжиною приблизно 689 нуклеотивляється спосіб пригнічення імунної відповіді у дів. Також винахід, представляє виділений і очикішки шляхом введення поліпептиду, що кодується щений поліпептид CD28 кішки, що складається 15 77382 16 приблизно з 221 амінокислот, що є зв'язаним з Даний винахід представляє виділені і очищені нукмембранною або зрілою формою з молекулярною леїнові кислоти, що кодують частково або повнісмасою 25,319кДа, ізоелектричною точкою приблитю CD80 кішки, CD86 кішки, CD28 кішки і CTLA-4 зно рІ=9,17 і сумарним зарядом при рН=7,0 рівним кішки, рівно як і поліпептиди CD80, CD86, CD28 9,58. або CTLA-4, очищені або з нативних, або з рекомТакож даний винахід представляє виділену і бінантних джерел. Вироблені відповідно за даним очищену кДНК CTLA-4 довжиною приблизно 749 винаходом CD80, CD86, CD28 або CTLA-4 кішки нуклеотидів. Також винахід представляє виділений використовують для підвищення ефективність коі очищений поліпептид CTLA-4 кішки, що складатячих вакцин проти пухлин і патогенних організмів, ється приблизно з 223 амінокислот, що є зв'язаним а також як лікарський засіб для лікування вірусних з мембранною або зрілою формою з молекулярі бактерійних хвороб домашніх кішок. Вироблені ною масою 24,381кДа, ізоелектричною точкою відповідно за даним винаходом CD80, CD86, CD28 приблизно рІ=6,34 і сумарним зарядом при рН=7,0 або CTLA-4 кішки також використовують для осларівним -0,99. блення захворювання за рахунок надактивних, У іншому аспекті даний винахід представляє гіперактивних або перенаправлених імунних відспосіб посилення імунної відповіді у кішки на імуповідей. ноген, що досягається введенням цього імуногену Нуклеїнові кислоти, вектори, трансформанти до, після або по суті одночасно з CD80 кішки або Послідовності кДНК, що кодують CD80 кішки CD86 кішки разом з CD28 кішки або CTLA-4 кішки (SEQ ID NO: 1), CD86 кішки (SEQ ID NO: 5), CD28 або без них в кількості, ефективній при підсиленні кішки (SEQ ID NO: 7) або CTLA-4 кішки (SEQ ID імунної відповіді. NO: 9) показані на Фіг.1-5, a розшифровані аміноУ іншому аспекті даного винаходу представлякислотні послідовності CD80 кішки (SEQ ID NO: 2), ється спосіб пригнічення імунної відповіді у кішки CD86 кішки (SEQ ID NO: 6), CD28 кішки (SEQ ID на імуноген, що досягається введенням цього імуNO: 8) або CTLA-4 кішки (SEQ ID NO: 10) показані ногену до, після або по суті одночасно з CD80 кішна Фіг.1-5. Ідентифікація цих котячих поліпептидів ки або CD86 кішки разом з CD28 кішки або CTLA-4 таких як CD80, CD86, CD28 або CTLA-4 засновукішки або без них або з антисмисловою РНК або ється на певному рівні гомології амінокислотних ДНК, частково або повністю кодуючих CD80 кішки послідовностей і гомологічних поліпептидів людиабо CD86 кішки, або CD28 кішки, або CTLA-4 кішни або миші, або кролика, і на здатності поліпепки, в кількості, ефективній при пригніченні імунної тидів CD80 або CD86 зв'язуватися з рецептором відповіді. CD28 кішки (див. нижче) або з CTLA-4 і активувати У наступному аспекті даного винаходу предабо стимулювати, або будь-яким іншим чином реставляється вакцина для індукції імунної відповіді гулювати активацію Т-лімфоцитів. Більш того не у кішок на імуноген, що містить цей імуноген і кільобмежуючись будь-якою теорією, передбачається, кість CD80, ефективна при посиленні імунної відщо поліпептиди CD80 кішки або CD86 кішки також повіді. Імуноген є похідним, наприклад, від котячих виявляють одну або більше з наступної біологічної патогенів, таких як вірус імунодефіциту кішки, вірус активності: активація клітин NK (нативні клітинилейкозу кішки, парвовірус кішки, коронавірус кішки, кілери), стимуляція дозрівання В-клітин, активація лептовірус кішки і подібне. обмежених за МНС цитотоксичних Т-лімфоцитів, У іншому аспекті даного винаходу представляпроліферація огрядних клітин, взаємодія з рецепється вакцина для індукції імунної відповіді у кішки торами цитокінів і індукція імунорегулюючих цитона імуноген, що досягається введенням ДНК або кінов. РНК імуногену і ДНК або РНК допоміжних молекул Через виродженість генетичний код (тобто наCD80, CD86, CD28 кішки в будь-якому поєднанні, явності більше за один кодон, що кодує деякі аміякі кодують білки або білкові фрагменти, в кількоснокислоти) послідовності ДНК, що не співпадають ті, ефективній при модуляції імунної відповіді. з показаними на Фіг.1-5, також можуть кодувати Білок CD80 кішки характеризується амінокисамінокислотні послідовності CD80, CD86, CD28 лотною послідовністю, яка на 59% і 46% ідентична або CTLA-4 кішки, показані на Фіг.1-5. Такі «інші поліпептидам людини і миші, відповідно. Білок ДНК» включають ті послідовності, які включають CD86 кішки характеризується амінокислотною по«структурно консервативні» зміни, при яких зміна слідовністю, яка на 68% і 64% ідентична таким одного або більшого числа нуклеотидів в складі білкам людини і кролика, відповідно. Білок CD28 даного кодону не приводить до зміни амінокислокішки характеризується амінокислотною послідовти, що кодується цим кодоном. Більш того даний ністю, яка на 82% і 74% ідентична поліпептидам амінокислотний залишок в поліпептиді часто може людини і миші, відповідно. Білок CTLA-4 кішки хабути змінений без зміни загальної конформації і рактеризується амінокислотною послідовністю, яка функцій нативного поліпептиду. Такі «функціонана 88% і 78% ідентична поліпептидам людини і льно консервативні» варіанти включають, тим самиші, відповідно. Білки CD80 або CD86 миші або мим не обмежуючись, заміну амінокислоти на амілюдини не можуть функціонально замінити котячі нокислоту, що характеризується схожими фізикобілки CD80 або CD86. Отже, білки CD80 кішки, хімічними параметрами, такими як, наприклад, CD86 кішки, CD28 кішки і CTLA-4 кішки є новими кислі, основні, гідрофобні, гідрофільні, ароматичні реагентами, необхідними для контролю імунітету у і подібні властивості (наприклад, заміна лізину на кішок. аргінін, аспарагінової кислоти на глутамінову кисДаний винахід охоплює Т-клітинні регуляторні лоту або гліцину на аланін). Крім того, амінокислодопоміжні молекули - CD80 (В7-1) або CD86 (В7тні послідовності додаються або віддаляються без 2), або CD28, або CTLA-4 (CD152) домашніх кішок. порушення біологічної активності даної молекули. 17 77382 18 Наприклад, додаткові амінокислотні послідовності CD80, CD86, CD28 або CTLA-4, що визначаються додають або з N-, або з С-кінця, які служать міткаяк поліпептиди, що кодуються ДНК, які характерими для очищення даного білка, такими як полігісзуються принаймні приблизно 25%-вим рівнем тидинові мітки (тобто для забезпечення одноетапідентичності з амінокислотними послідовностями ного очищення даного білка, після чого їх CD80, CD86, CD28 або CTLA-4 кішки. видаляють хімічним або каталітичним шляхом). З Загалом, в маніпуляціях нуклеїновими кислоіншого боку, додаткові послідовності надають дотами відповідно даному винаходу використовудатковий сайт поверхневого зв'язування або будьються методи, які добре відомі в науці, такі як ті, яким іншим шляхом змінюють специфічність CD80, які описані, [наприклад, в Sambrook, Fritsch & CD86, CD28 або CTLA-4 кішки відносно клітинManiatis, 1989, "Molecular Cloning: A Laboratory мішеней, наприклад, шляхом додання антигенManual", 2nd ed.. Cold Spring Harbor або "Current зв'язуючого сайту для антитіл. Protocols in Molecular Biology", eds. Ausubel, Brent, кДНК CD80 кішки або CD86 кішки, або CD28 Kingston, More, Feidman, Smith & Stuhl, Greene кішки, або CTLA-4 кішки, що попадають в об'єм Publ. Assoc, Wiley-Interscience, NY, 1992]. даного винаходу, відповідають послідовностям, Даний винахід охоплює послідовності кДНК і показаним на фіг. 1-5, структурно-консервативним РНК в смисловому і антисмисловому порядках. варіантам ДНК, послідовностям ДНК, що кодують Також винахід охоплює послідовності геномної функціонально-консервативні варіанти поліпептиДНК CD80, CD86, CD28 або CTLA-4 кішки і фландів, і їх комбінацій. Даний винахід охоплює фрагкуючі послідовності, включаючи, але тим самим не менти CD80, CD86, CD28 або CTLA-4 кішки, які обмежуючись, регуляторні послідовності. Нуклеївиявляють ефективну міру біологічної активності нові послідовності, що кодують поліпептиди CD80, як окремо, так і в поєднанні з іншими послідовносCD86, CD28 або CTLA-4 кішки, також зв'язують з тями або компонентами. Як буде пояснено далі, в гетерологічними послідовностями, включаючи компетенції фахівця в даній області техніки пепромотори, енхансери, регуляторні елементи, сигредбачити результати маніпуляцій послідовностянальні послідовності, сигнали поліаденілування, ми CD80, CD86, CD28 або CTLA-4 і встановити, інтрони, 5'- і 3'-некодуючі сегменти і подібне. Транабо буде даний варіант CD80, CD86, CD28 або скрипційними регуляторними елементами, які фуCTLA-4 кішки виявляти відповідну стабільність і нкціонально пов'язані з послідовностями кДНК біологічну активність відносно даного застосуванCD80, CD86, CD28 або CTLA-4 кішки, є без будьня, або визначити параметри, які порушують актияких обмежень послідовності, здатні контролювати вність за зв'язуванням цих молекул, що обумовить експресію генів, похідні від прокаріотичних клітин, підвищення ефективності. Кожний з CD80 і CD86 еукаріотичних клітин, вірусів прокаріот, вірусів еукішки зв'язується з корецептором CD28 або корекаріот і будь-яких їх комбінацій. Також в даній обцептором CTLA-4. Цього можна досягти шляхом ласті техніки відомі і інші гетерологічні регуляторні експресії і очищення варіантних поліпептидів послідовності. CD80, CD86, CD28 або CTLA-4 в рекомбінантної Нуклеїнові кислоти за даним винаходом мосистеми і оцінки їх Т-стимуляторної активності і дифікують із застосуванням методів, відомих в (або) активності за активацією росту в клітинних даній області техніки, з метою зміни їх стабільноскультурах і у тварин з подальшим тестуванням на ті, розчинності, афінності зв'язування і специфічможливе застосування. Варіант CD80 тестують за ності. Наприклад, послідовності метилують селекйого біологічною активністю за функціональним тивним чином. Також нуклеотидні послідовності за зв'язуванням з рецепторами CD28 або CTLA-4. даним винаходом модифікують міткою, здатною Варіант CD86 тестують за його біологічною активзабезпечувати ефективний прямий або непрямий ністю за функціональним зв'язуванням з рецептосигнал. Прикладами міток є радіоактивні ізотопи, рами CD28 або CTLA-4. Схожим чином варіант флуоресцентні молекули, біотин і подібне. CD28 або варіант CTLA-4 тестують за їх біологічТакож даний винахід представляє вектори, які ною активністю. включають нуклеїнові кислоти, що кодують поліпеТакож даний винахід охоплює ДНК CD80, птиди CD80, CD86, CD28 або CTLA-4 частково або CD86, CD28 або CTLA-4 кішки (і поліпептиди), поповністю. Такими векторами є, наприклад, плазмі хідні від інших видів котячих, включаючи, але тим дні вектори, призначені для експресії в різних просамим не обмежуючись, домашніх кішок, левів, каріотичних і еукаріотичних організмахтигрів, гепардів, рисей і т.д. Гомологи CD80, CD86, господарях. Переважно вектори також включають CD28 або CTLA-4 кішки за відношенням до покапромотор, функціонально приєднаний до ділянок, заного на Фіг.1-5 можуть бути легко ідентифіковані що кодують CD80, CD86, CD28 або CTLA-4 кішки. шляхом скринінгу бібліотек кДНК або геномних Котячі CD80, що кодуються, CD86, CD28 або клонотек з метою ідентифікації клонів, які гібридиCTLA-4 експресуються з використанням будь-яких зуються із зондами, що включають повністю або відповідних векторів і клітин-господарів відповідно частково послідовність, показану на Фіг.1-5. З індо описаного в даному тексті і у відповідності з шого боку, експресійні бібліотеки піддають скринінвідомим фахівцям в даній області техніки. гу з використанням антитіл, які розпізнають CD80, Відповідними векторами для використання в CD86, CD28 або CTLA-4 кішки. Поза зв'язком з практиці даного винаходу є, тим самим не обмебудь-якою теорією можна вважати, що гени CD80 жуючись, УЕр352, pcDNAI (Invitrogen, Carlsbad, або CD86 кішки інших видів котячих будуть приCA), pRc/CMV (Invitrogen) i pSFVl (Gibco BRL), наймні на 70% гомологічні генам CD80, CD86, Gaithersburg, MD). Одним з переважних за викориCD28 або CTLA-4 кішки. Також в об'єм даного вистанням в даному винаході вектором є pSFVl. Віднаходу попадають ДНК, які кодують гомологи повідними клітинами-господарями є клітини Е.соlі, 19 77382 20 клітини дріжджів, клітини COS, клітини PC12, клічає гени, що кодують імуноген(и) котячих патогетини СНО, клітини GH4C1, клітини ВНК-21 і клітинів, і гени CD80, CD86 разом з CD28 кішки або ни меланофорів амфібій. Клітини ВНК-21 є переCTLA-4 кішки або без них, для посилення або приважними клітинами-господарями з точки зору гнічення імунної відповіді. використання в практиці даного винаходу. ВідповіПоліпептиди CD80, CD86, CD28 або CTLA-4 дними векторами для конструювання «голої» ДНК кішки або для «генетичної вакцинації», є, тим самим не Ген CD80 кішки (кДНК і відповідна їй амінокисобмежуючись, pTarget (Promega, Madison, WI), pSI лотна послідовність показані на Фіг.1 і 2) кодує (Promega, Madison, WI) і pcDNA (Invitrogen, поліпептид, що складається приблизно з 292 аміCarlsbad, CA). нокислот. Ген CD86 кішки (кДНК і відповідна їй Нуклеїнові кислоти, що кодують поліпептиди амінокислотна послідовність показані на Фіг.3) CD80 , CDS6, CD2S або CTLA-4 кішки, також внокодує поліпептид, що складається приблизно з 320 сять в клітини за допомогою рекомбінантних приамінокислот. Ген CD28 кішки (кДНК і відповідна їй йомів. Наприклад, таку послідовність вносять в амінокислотна послідовність показані на Фіг.4) клітину з допомогою мікроін'єкції, забезпечуючи кодує поліпептид, що складається приблизно з 221 гомологічну рекомбінацію за сайтом локалізації амінокислот. Ген CTLA-4 кішки (кДНК і відповідна ендогенного гену, що кодує такий поліпептид, його їй амінокислотна послідовність показані на Фіг.5) аналог або псевдоген, або послідовності, що харакодує поліпептид, що складається приблизно з 223 ктеризується істотним рівнем гомології з геном, що амінокислот. кодує CD80, CD86, CD28 або CTLA-4 кішки. Також Очищення CD80, CD86, CD28 або CTLA-4 кішможуть бути використані інші рекомбінантні метоки з натуральних або рекомбінантних джерел проди, такі як забезпечення негомологічної рекомбіводять із застосуванням методів, добре відомих в нації і делегування ендогенного гену шляхом годаній області техніки, включаючи, але тим самим мологічної рекомбінації, особливо в геномі не обмежуючись, іонообмінну хроматографію, плюрипотентної клітини. обернено-фазну хроматографію на колонках С4, Даний винахід представляє спосіб посилення гель-фільтрацію, ізоелелектричне фокусування, у кішки імунної відповіді на імуноген, що досягаафінну хроматографію і подібне. У переважному ється введенням імуногену до, після або по суті здійсненні велика кількість біологічно активного одночасно з CD80 або CD86 кішки поряд з CD28 білка CD80, CD86, CD28 або CTLA-4 кішки отрикішки або CTLA-4 кішки або без них в кількості, мують шляхом конструювання рекомбінантної поефективній при підсиленні імунної відповіді. слідовності ДНК, що включає кодуючу ділянку Даний винахід представляє спосіб посилення CD80, CD86, CD28 або CTLA-4 кішки, яка в загау кішки імунної відповіді на імуноген, що досягальній кодуючій рамці об'єднана з послідовністю, ється введенням експресуючого вектора, який що кодує 6 С-кінцевих залишків гістидину в реплівключає похідний від котячого патогену імуноген, коні pSFVl (Gibco BRL). мРНК, що кодується цією до, після або по суті одночасно з CD80 або CD86 плазмідою синтезують із застосуванням методів, кішки поряд з CD28 кішки або CTLA-4кішки або добре відомих фахівцям в даній області техніки, і без них, в кількості, ефективній при підсиленні вносять в клітини лінії ВНК-21 методом електроімунної відповіді. порації. Клітини виробляють і секретують процесіДаний винахід представляє спосіб перенапрайовані глікозиловані поліпептиди CD80, CD86, вления у кішки імунної відповіді на імуноген, що CD28 або CTLA-4 кішки, що включають С-кінцевий досягається введенням експресуючого вектора, гексагістидин. Модифіковані котячі поліпептиди який включає похідний від котячого патогену імуCD80, CD86, CD28 або CTLA-4 очищають з клітинноген, до, після або по суті одночасно з CD80 або ного супернатанту методом афінної хроматографії CD86 кішки поряд з CD28 кішки або CTLA-4 кішки з використанням гістидин-зв'язуючої смоли (Hisабо без них, в кількості, ефективній при підсиленні bind: Novagen, Madison, WI). імунної відповіді. Поліпептиди CD80 кішки або CD86 кішки, видіДаний винахід представляє спосіб пригнічення лені з будь-яких джерел, модифікують із застосуу кішки імунної відповіді на імуноген, що досягаванням методів, відомих в даних області техніки. ється введенням експресуючого вектора, який Наприклад, котячі CD80, CD86, CD28 або CTLA-4 включає похідний від котячого патогену імуноген, фосфорилують або дефосфорилують, глікозилудо, після або по суті одночасно з CD80 або CD86 ють або деглікозилують і подібне. Найбільш застокішки поряд з CD28 кішки або CTLA-4 кішки або з совними модифікаціями є ті, які змінюють розчинантисмисловий РНК або ДНК, що кодує CD80 кішність, стабільність, а також специфічність і ки, CD86 кішки, CD28 кішки або CTLA-4 кішки, в афінність зв'язування у CD80, CD86, CD28 або кількості, ефективній при пригніченні імунної відCTLA-4 кішки. повіді. Химерні молекули CD80, CD86, CD28 або Даний винахід представляє вакцину для індукCTLA-4 кішки ції у кішки імунної відповіді на імуноген(и), що місДаний винахід охоплює отримання химерних тить імуноген і ефективну кількість CD80 кішки або молекул, що утворюються фрагментами котячих CD86 кішки разом з CD28 кішки або CTLA-4 кішки CD80, CD86, CD28 або CTLA-4 в будь-якому поєдабо без них, для посилення імунної відповіді або нанні. Наприклад, внесення сайту зв'язування CD80 кішки або CD86 кішки разом з CTLA-4 кішки CTLA-4 замість сайту зв'язування CD28 повинне для пригнічення імунної відповіді. У іншому здійспідвищити афінність зв'язування CD28 із зберененні за даним винаходом представляється вакженням посиленої імунної відповіді. цина, що містить експресуючий вектор, що вклюУ одному здійсненні сайти зв'язування CD80 21 77382 22 або CD86 на молекулах CTLA-4 і CD28 замінюідентифікації і кількісного аналізу котячих CD80, ються таким чином, що сайт зв'язування на CD28 CD86, CD28 або CTLA-4, застосовуючи такі імунозамінюється на сайт зв'язування CTLA-4. Вплив логічний тести, як ТІФА, РІА і подібне. Антитіла до химерної молекули CD28, що включає сайт зв'язуCD80 кішки, до CD86 кішки, до CD28 кішки і до вання CTLA-4, пов'язаний з підвищенням афінносCTLA-4 кішки також використовують для імунологіті CD28 у відношенні CD80 або CD86 і підвищенчного виснаження екстрактів CD80 кішки, CD86 ням міри посилення імунної відповіді. У кішки, CD28 кішки або CTLA-4 кішки. Крім того, ці альтернативному здійсненні химерні молекули антитіла можуть бути використані для ідентифікаCD80 і CD28 або СD86 і CD28 або їх фрагменти є ції, виділення і очищення котячих CD80, CD86, зв'язаними з мембранами формами і поліпшують CD28 або CTLA-4, що походять від різних джерел, властивості цих молекул при підсиленні імунної і для досліджень за субклітинним і гістохімічним відповіді. У іншому здійсненні химерні молекули картируванням. CD80 і CTLA-4 або CD86 і CTLA-4 або їх фрагменЗастосування ти є зв'язаними з мембранами формами, які є моЛіганд CD80 (В7-1) кішки, ліганд CD86 (В7-2) лекулами, більш ефективними при пригніченні кішки, рецептор CD28 кішки або рецептор CTLA-4 імунної відповіді. У іншому здійсненні химерні мо(CD 152) кішки, вироблені відповідно за даним лекули CD80 і CTLA-4 або CD86 і CTLA-4 або їх винаходом, можуть бути ефективно використані як фрагменти є зв'язаними з мембранами формами, вакцина для профілактики інфекційного захворюякі перенаправляють імунну відповідь з досягненвання або сприяння росту у гомологічних або геням бажаного ефекту. терологічних видів котячих. Наприклад, коекспреАнтитіла, специфічні у відношенні CD80, сія CD80 або CD86 з костимуляторними CD86, CD28 або CTLA-4 кішки молекулами CD28 або CTLA-4 в будь-якому поєдДаний винахід охоплює антитіла, специфічні у нанні з пухлинним антигеном або антигеном патовідношенні поліпептидів CD80, CD86, CD28 або генного організму. Коекспресія CD80 або CD86 з CTLA-4 кішки, ідентифікованих відповідно до опикішки з рецептором CTLA-4 кішки забезпечує здатсаного вище. Антитілами є поліклональні або моність пригнічувати активацію Т-лімфоцитів і пригніноклональні антитіла, що розділяють CD80, CD86, чувати імунну відповідь. Конкретним прикладом CD28 або CTLA-4 кішки і інші білки, що ідентифіповинна бути коекспресія CD80 або CD86 з імунокують їх функціональні домени і подібне. Такі ангенами, похідними від вірусів FIV, FeLV або FIP, з титіла отримують стандартними способами за довірусного вектора або ДНК-експресуючого вектора, помогою методів і композицій, [описаних у Harlow який, у разі введення у вигляді вакцини, буде ак& Lane, 1988, "Antibodies: A Laboratory Manual", тивувати, посилювати або регулювати проліфераCold Spring Harbor Lab.], а також з використанням цію СD4-позитивних і CD8-позитивних Тімунологічних і гібридомних методів, відомих в лімфоцитів і індукувати вироблення імунорегуляданій області техніки. У разі використання нативторних цитокінів, таких як IL-2, IFN- , IL-12, TNF , них або синтетичних пептидів, похідних від CD80, IL-6 і т.п.Іншим конкретним прикладом повинна CD86, CD28 або CTLA-4 кішки, для індукції у кішки бути експресія CD80, CD86, CD28 або CTLA-4 з CD80-, CD86-, CD28- або CTLA-4-специфічної імувірусного вектора або ДНК-експресуючого вектора, нної відповіді ці пептиди стандартним чином з'єдякий, у разі введення у вигляді лікарського засобу, нують з відповідним носієм, таким як гемоціанін буде регулювати або перенаправляти імунну відслизня (KLH), і вводять з відповідним ад'ювантом, повідь. таким як ад'юванти Фройнда. Посилення імунітету за рахунок взаємодії коПереважно відібрані пептиди з'єднують з носітячих CD80 або CD86 з CD28 або CTLA-4 або приєм, маючим «лізинову серцевину», по суті відповігнічення імунної відповіді за рахунок взаємодії кодну методам Tan, 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, тячих CD80 або CD86 з CTLA-4 забезпечує 85, 5409-5413. Такі антитіла, особливо так звані переваги в природному процесі регуляції в більшій антиідіотипічні антитіла «внутрішньої відповідносмірі, ніж при доданні чужорідних субстанцій, які б ті», також приготовляють з використанням відомих надавали множинні і навіть шкідливі впливи на методів. здоров'ї загалом або протягом тривалого часу. У одному із здійсненні очищені котячі CD80, Молекули CD80, CD86, CD28 або CTLA-4 вводять CD86, CD28 або CTLA-4 використовують для імунарівні з іншими рекомбінантними молекулами, нізації мишей, після чого у них видаляють селезінтакими як ті, які кодують антигени, що є бажаними ку і спленоцити використовують для отримання з точки зору індукції імунітету. Ген CD80, CD86, клітинних гібридів з мієломними клітинами з метою CD28 або CTLA-4 кішки вбудовують до складу ексотримання клонів секретуючих антитіло клітин у пресуючого вектора і інфікують ним або трансфівідповідності зі стандартними методами даної обціюють клітину-мішень з подальшою експресією ласті техніки. Отримані в результаті моноклональгенного продукту в цій клітині-мішені так, що він ні антитіла, що секретуються такими клітинами, прикріпляється до плазмалеми цієї клітини-мішені піддають скринінгу в тестах in vitro на наступну або антиген-презентуючої клітини або секретуєтьактивність: зв'язування з котячими білками CD80, ся у зовнішнє для цієї клітини-мішені або антигенCD86, CD28 або CTLA-4, пригнічення активності презентуючої клітини середовище. Екпресуючий CD80, CD86, CD28 або CTLA-4 за зв'язуванням вектор, такий як плазміда, вірус Semliki Forest, рецепторів і пригнічення Т-клітинної стимуляторної поксивірус або герпесвірус, переносить ген в антиактивності CD80, CD86, CD28 або CTLA-4. ген-презентуючу клітину. Ген CD80, CD86, CD28 Антитіла до CD80 кішки, до CD86 кішки, до або CTLA-4 кішки або фрагменти цих генів в будьCD28 кішки і до CTLA-4 кішки використовують для якому поєднанні вбудовують в склад ДНК- або 23 77382 24 РНК-експресуючого вектора і ін'єкують кішці з ексзнаходиться в діапазоні від приблизно 0,01 до пресією даного генного продукту у кішки у вигляді 100,0мг на одну вакцинацію однієї кішки. «голої» ДНК/РНК або генетичної вакцини. КоекспФахівцям в даній області техніки відомі комерресія імуногену і CD80, CD86, CD28 або CTLA-4 в ційні джерела вакцин для кішок (Compendium of клітині-мішені або в організмі кішки зумовлює акVeterinary Pharmaceuticals, 1997), які можуть бути тивацію, посилену активацію або регуляцію Твикористані в поєднанні з даним винаходом для лімфоцитів, В-лімфоцитів і інших клітин. З іншого отримання більш ефективної вакцини. боку, експресований білок може бути введений Вакцина для індукції і регуляції у кішки імунної після експресії з плазміди. Котячі білки CD80, відповіді на імуноген- містить імуноген і ефективну CD86, CD28 або -CTLA-4 в нормі функціонують, кількість CD80 кішки або CD86 кішки разом з CD28 будучи прикріпленими до мембрани клітини, як кішки або CTLA-4 кішки або без них для посилення допоміжні молекули клітинної мембрани, але моімунної відповіді або CD80 "кішки або CD86 разом жуть бути презентованими і в інших формах, зокз CNLA-4 кішки для пригнічення імунної відповіді. рема, у відсутності в їх складі «мембранних якоІмуноген вибирають з групи, яка включає, тим рів». самим не обмежуючись, котячі патогени, такі як У одному здійсненні CD80 кішки і CD86 кішки вірус імунодефіциту котячих, вірус лейкозу котярозчинні («вільні» в клітинних і позаклітинних рідичих, вірус інфекційного перитоніту котячих, вірус нах) за рахунок втрати трансмембранного домену панлейкопенії котячих (парвовірус), каліцивірус або гідрофобної ділянки і взаємодіють з костимукотячих, реовірус 3-го типу котячих, ротавірус коляторними молекулами CD28 або CTLA-4, що знатячих, коронавірус котячих (інфекційний перитоходяться або в зв'язаній з мембраною, або в розніт), вірус сказу, респіраторно-синцитіальний вірус чинній формі. У іншому варіанті CD80 кішки і CD86 котячих, вірус саркоми котячих, герпесвірус котякішки знаходяться в зв'язаній з мембраною формі, чих (вірус ринотрахеїту), вірус хвороби Борна кіа костимуляторні молекули CD28 або CTLA-4 - в шок, хламідії, Toxoplasmosis gondii, паразити кірозчинній формі, тобто не мають трансмембраншок, Dirofilaria immitis, блохи, бактерійні патогени і ного домену або гідрофобної ділянки. Розчинні подібне. CD28 або CTLA-4, що переважно знаходяться в Регуляція росту або регуляція активації кліформі димерів, застосовуються для лікування кітинного типу, такого як Т-лімфоцит, визначає те. шок, зв'язаного з імуносупресією, опосередкованої що регуляторна відповідь або стимулює, або пригТ-клітинами. Розчинні CD28 або CTLA-4 запобіганічує ріст клітин. Регуляція імунної відповіді у кішки ють відторганню пересадженої тканини і можуть визначає те, що ця імунна відповідь або стимулюбути використані для лікування аутоімунного зається, або пригнічується в зв'язку з лікуванням хворювання. Конкретні розчинні CD28 або CTLA-4 захворювання або впливом на інфекційний агент у застосовуються для профілактики реакції «транскішки. плантат проти господаря» при пересадках кісткоЕкспресія CD80, CD86, CD28 або CTLA-4 кішки вого мозку. Розчинні CD28 або CTLA-4 запобігають окремо або в будь-якому поєднанні частин або зв'язуванню клітини, несучої мембранні форми цілого в складі експресуючого вектора, що вклюкотячих лігандів CD80 або CD86. чає ген(и) котячих імуногенів для цілей введення у Структурно консервативні і функціонально вигляді генетичної вакцини або «голої ДНКконсервативні варіанти ДНК і поліпептидів CD80, вакцини». Векторами є, тим самим не обмежуюCD86, CD28 або CTLA-4 кішки або біологічно актичись, pTarget (Promega, Madison, WI), pcDNA вний фрагмент або субфрагмент CTLA-4 об'єдну(Invitrogen, Carlsbad, CA) [J.J. Donnelly et al., 1997; ють в загальній рамці зчитування з іншою послідоHassett & Whitton, 1996]. вністю, такою як цитокін, інтерлейкін, інтерферон, Гени або фрагменти генів CD80, CD86, CD28 колонієстимулюючий чинник, антиген патогенного або CTLA-4 окремо або в поєднанні, повнорозмірні мікроорганізму, антитіло або необхідна для очиабо часткові, можуть бути вбудовані або трансфіщення послідовність, така як полігістидинова мітційовані в геном кішки або іншого ссавця. Така ка, або ген-репортер, такий як гени lacZ і uidA інтеграція генів або фрагментів цих генів, яка може E.coli, або зелений флуоресцентний білок. бути досягнута з використанням ретровірусного Вакцини вектора, може бути використана для цілей генотеДаний винахід охоплює способи і композиції рапії. для підвищення ефективності імунної відповіді у Даний винахід представляє способи і комподомашніх кішок. У цьому здійсненні котячі CD80, зиції для підвищення стійкості до захворювання у CD86, CD28 або CTLA-4 використовують разом з домашніх кішок, для застосування в медичних і імуногеном, відносно якого бажано індукувати іму(або) комерційних цілях. У цьому здійсненні CD80, нну відповідь. Наприклад, до складу вакцин для CD86, CD28 або CTLA-4 кішки, що експресуються кішок, що містять імуногени таких патогенів, як окремо або в будь-якому поєднанні, повнорозмірні вірус імунодефіциту котячих і вірус лейкозу котяабо часткові, і в поєднанні з генами, що кодують чих, і інші патогенів, такі як парвовірус котячих, котячі імуногени, або без цього, вводять кішці з лептовірус котячих і коронавірус котячих, бажано використанням відповідного способу введення. включити CD80, CD86, CD28 або CTLA-4 кішки з Для сприяння росту або стійкості до захворювання метою регуляції міри і ефективності імунної відпокотячі CD80, CD86, CD28 або CTLA-4, що експревіді. Для цієї мети котячі CD80, CD86, CD28 або суються окремо або в будь-якому поєднанні, ввоCTLA-4, очищені з нативних або рекомбінантних дять у вигляді композиції в концентрації, що варіджерел відповідно до описаного вище, включають юється від приблизно 0,01 до 100,0мг на 1 дозу до складу вакцинної композиції в концентрації, що вакцини на 1 кішку, переважно в композиції в кон 25 77382 26 центрації від приблизно 0,25мг/кг на день до прибклонували в плазміду pSI, що включає промотор лизно 25мг/кг на день. Повинно бути зрозуміло, що SV40, і плазміду SFV. Плазміду pSI використали потрібна кількість CD80, CD86, CD28 або CTLA-4 для встановлення функціональної взаємодії В7-1 з кішки може бути визначена за допомогою рутинних котячим CD28. тестів, добре відомих в даній області техніки, так, ДНК-праймери, що використовувалися для щоб встановити схему дозування і частоти їх ввеОТ-ПЛР кДНК CD80 (В7-1) кішки, були такими: дення і порівняти групи експериментальних одиПрямий праймер: 5'ниць або суб'єктів за кожною точкою такої схеми. CGCGGATCCGCACCATGGGTCACGCAGCAAAGВідповідно до даного винаходу нативні або реTGGAAAAC-3' (SEQ ID NO: 11) комбінантні котячі CD80, CD86, CD28 або CTLA-4 Зворотний праймер: 5'приготовляють з фізіологічно прийнятним носієм, CCTAGTAGAGAAGAGCTAAAGAGGC-3' (SEQ ID таким як, наприклад, фосфатно-сольовий буфер NO: 12) (див. вище повний перелік праймерів для або деіонізована вода. Дана композиція також мокДНК CD28). же містити наповнювачі, включаючи мастячі комДНК-праймери, що використовувалися для поненти, пластифікатори, підсилювачі поглинання, ОТ-ПЛР кДНК CD28 кішки, були такими: бактерициди і подібне, що добре відомо в даній Прямий праймер: 5'області техніки. Поліпептиди CD80, CD86, CD28 CGCGGATCCACCGGTAGCACAATGATCCTCAGGабо CTLA-4 кішки за даним винаходом вводять 3' (SEQ ID NO: 13) будь-яким ефективним шляхом, включаючи, тим Зворотний праймер: 5'самим не вичерпуючись, внутрішньовенний, підшCGCGGATCCTCTGGATAGGGGTCCATGTCAG-3' кірний, внутрішньом'язовий, черезм'язовий, місце(SEQ ID NO: 14) (див. вище повний перелік прайвий або пероральний шлях. Для підшкірного ввемерів для кДНК CD28). дення, наприклад, доза включає котячий CD80, ДНК-праймери, що використовувалися для CD86, CD28 або CTLA-4 в стерильному фізіологічОТ-ПЛР кДНК CTLA-4 кішки, були такими: ному розчині. Для перорального або інгаляційного 1. Вироджені праймери для першого ПЛРвведення котячі CD80, CD86, CD28 або CTLA-4 продукту (672 нуклеотиду): упаковують на мікро- або макрорівнях, наприклад, Deg-5'-P: 5'в ліпосоми або мікросфери. Також можуть бути ATGGCTT(C)GCCTTGGATTT(C)CAGC(A)GG-3' використані шкірні бляшки (або інші форми з пові(SEQ ID NO: 15) льною секрецією). Deg-3'-P: 5'Приклад 1А TCAATTG(A)ATG(A)GGAATAAAATAAGGCTG-3' Клонування кДНК CD80 (B7-1)-TAMU, CD86 (SEQ ID NO: 16) (В7-2), CD28 і CTLA-4 кішки 2. 5'- Кінцева послідовність CTLA-4 (455 нукПослідовності котячих CD80 (В7-1), CD86 (В7леотидів): вироджені ген-специфічні (GSP) «гніз2), CD28 і CTLA-4 клонували спочатку шляхом дові» ген-специфічні (NGSP) праймери: ампліфікування методом ОТ-ПЛР (полімеразна Перший раунд ПЛР: ланцюгова реакція з ревертуванням, або із звороDeg-5'-P: 5'тною транскриптазою) ділянки між двома послідоTGTTGGGTTTC(T)G(A)CTCTG(A)CTT(C)CCTG-3' вностями, які досить консервативні для того, щоб (SEQ ID NO: 17) сформувати вироджені праймери, взаємодіючі з 3'GSP: 5'котячою мРНК. Джерелом мРНК були моноядерні GCATAGTAGGGTGGTGGGTACATG-3' (SEQ ID клітини периферичної крові (РВМС), простимульоNO: 18) вані конканаваліном-А принаймні протягом 16 го«Гніздова» ПЛР з ПЛР-продуктом, отриманим дин. Отриманий ПЛР-продукт секвенували. Отрив першому раунді: ману послідовність використовували для Deg-5'-P: 5'конструювання праймерів для RACE (швидка ампTGTTGGGTTTC(T)G(A)CTCTG(A)CTT(C)CCTG-3' ліфікація кДНК-кінців). 5'-Кінець ампліфікували (SEQ ID NO: 19) спочатку з отриманням кДНК із зворотним прайме3'- NGSP: S'-ACATGAGCTCCACCTTGCAG- У ром, комплементарним заново секвенованій кон(SEQ ID NO: 20). сервативній ділянці. Олігонуклеотид лігували на 3'3. 3'- Кінцева послідовність CTLA-4: адапторкінець кДНК (комплемент 5'-кінцю мРНК). Ця посний праймер-1 (API; Clontech Lab. Inc., Palo Alto, С лідовність була сайтом зв'язування для прямого А); «гніздовий» адапторний праймер (АР2; прайм ера, який сумісний за ПЛР із зворотним Clontech Lab.), ген-специфічний праймер (GSP) і ПЛР-праймером, відповідним іншій ділянці нової «гніздовий» ген-специфічний праймер (NGSP): секвенованої ділянки. Виродженні праймери вико3'-RACE: ристали в неодноразових циклах «гніздових» реаАРІ: 5'кцій для отримання 3'-кінцевої послідовності. Цей CCATCCTAATACGACTCACTATAGGGC-3' (SEQ ID прямий праймер для ПЛР конструювали для взаєNO: 21) модії з послідовністю нового секвенованого сегме5'-GSP: 5'-GTGAATATGGGTCTTCAGGCAATGнта. Продукти або секвенували напряму, або кло3' (SEQ ID NO: 22) нували в клонуючий вектор ТА і секвенували з 3'- Гніздова RACE з продуктом 3'-RACE: отриманої плазміди. Повнорозмірну кодуючу рамку AP2: 5'- ACTCACTATAGGGCTCGAGCGGC-3' (ORF) клонували шляхом ампліфікації по всій її (SEQ ID NO: 23) довжині з використанням праймерів, сконструйо5'-NGSP: 5'ваних за параметрами відомих послідовностей. GAAATCCGAGTGACTGTGCTGAG-3' (SEQ ID NO: ORF клонували і секвенували тричі. ORF B7-1 суб24). 27 77382 28 4. Праймери для повнорозмірного гену CTLAПісля цього клітини центрифугували, промивали в 4: ФСБ і використовували для виділення тотального Fel CTLA-4 5'-праймер: 5'пулу РНК в системі RNeasy (Qiagen). Тотальну AACCTGAACACTGCTCCCATAAAG-3' (SEQ ID NO: РНК обробляли ДНКазою-1 (Boehringer Mannheim) 25) з метою видалення ДНК, що забруднює препарат Fel CTLA-4 3'-праймер: 5'РНК. Потім з цих препаратів виділяли мРНК з виGCCTCAGCTCTTAGAAATTGGACAG-3' (SEQ ID користанням кульок Oligotex (Qiagen, Santa Clara, NO: 26). CA) і високошвидкісних колонок. З матриць мРНК ДНК-праймери, що використовувалися для синтезували ДНК-копії в присутності випадкових ОТ-ПЛР кДНК CD86 (В7-2) кішки, були такими: гексамерів, dNTP, RNAsin, зворотної транскрипта1. Вироджені праймери для першого ПЛРзи (Promega) і зворотно-транскриптазного буфере продукту (423 нуклеотиду): (Promega) з інкубацією протягом 30 хвилин при Deg-5'-P: 5'-TAGTATTTTGGCAGGACCAGG-3' 42°С. Потім для отримання дволанцюгових моле(SEQ ID NO: 27) кул повнорозмірного кДНК-клону кодуючої рамки Deg-3'-Р: 5'- CTGTGACATTATCTTGAGATTTC(ORF) B7-1 кішки застосовували ПЛР зі смисловим 3' (SEQ ID NО:28). праймером 5/97.50 (5'2. Вироджені праймери для другого ПЛРATGGGTCACGCAGCAAAGTG-3') (SEQ ID NO: 41) і продукту (574 нуклеотиду): антисмисловим праймером 5/97.51 (5'Deg-5'-P: 5'CTATGTAGACAGGTGAGATC-3') (SEQ ID NO: 42), GA(G)CA(T)GCACT(A)ATGGGACTGAG-3' (SEQ ID dNTP, кДНК В7-1 (перший ланцюг), сульфатом NO: 29) магнію, полімеразою Vent (Gibco BRL) і VentDeg-3'-P: 5'-CTGTGACATTATCTTGAGATTTCполімеразного буфера (Gibco BRL). Умови ПЛР: 1 3' (SEQ ID NO: 30). цикл 15 секунд при 94°С; 35 циклів - 30 секунд при 3. 5'- Кінець CD86: API, AP2 (Clontech Lab.), 94°С, 2 хвилини при 48°С, 2 хвилини при 72°С; 1 вироджений 3'- ген-специфічний (GSP) і 3'цикл добудування при 72°С протягом 10 хвилин. «гніздовий» ген-специфічний (NGSP) праймери: ПЛР здійснювали в 1%-вій низькоплавкій агарозі і 5'- RACE: виділяли ДНК-фрагменти, відповідні очікуваному АРІ: 5'розміру ORF B7-1, очищали в гелі (набір реактивів CCATCCTAATACGACTCACTATAGGGC-3' (SEQ ID для гель-очищення Qiagen, Santa Clara, СА) і клоNO: 31) нували в плазміду pCR-BLUNT з використанням 3'-GSP: 5'набору Zero Blunt PCR Cloning Kit (Invitrogen, San TGGGTAACCTTGTATAGATGAGCAGGTC-3' (SEQ Diego, СА). ДНК, екстраговану з резистентних до ID NО:32). канаміцину бактерійних колоній, піддавали попе«Гніздова» 5'-RACE з ПЛР-продуктом 5-RACE: редньому скринінгу на присутність унікального АР2: 5'-ACTCACTATAGGGCTCGAGCGGC-3' Nhel-сайту (що є в складі CD80 [B7-1]-)(TAMU кіш(SEQ ID NO: 33) ки). Вставки розміром 800-900 пар нуклеотидів 3'-NGSP: 5'(п.н.), що мали Nhel-сайт, секвенували методом CACCTTCACTCAACTTACCAACCAC-3' (SEQ ID флуоресцентного автоматичного секвенування на NО:34). відповідному обладнанні фірми Perkin-Elmer-Cetus 4. 3'-Кінцева послідовність В7-2: праймери (Applied Biosystems Inc.). Плазмідний вектор і В7-1, API, AP2, 5'-GSP і 5'-NGSP: генспецифічні праймери, похідні від раніше клоно3'-RACE: ваного гену В7-1, використали для отримання посAPI: 5'лідовності pCR-Blunt: праймери - 1/97.36 (5'CCATCCTAATACGACTCACTATAGGGC-3' (SEQ ID CAGGAAACAGCTATGAC-3') (SEQ ID NO: 43) і NO: 35) 1/97.37 (5'-AATACGACTCACTATAGG-3') (SEQ ID 5'-GSP: 5'NO: 44). Специфічні для гену В7-1 праймери GGACAAGGGCACATATCACTGTTTC-3' (SEQ ID 12/96.22 (5'-ААСАССАТТТСАТСАТССТТТ-3') (SEQ NО: 36). ID NO: 45), 1/97.33 (5'«Гніздова» 3'-RACE з ПЛР-продуктом 3'-RACE: ATACAAGTGTATTTGCCATTGTC-3') (SEQ ID NO: AP2: 5'-ACTCACTATAGGGCTCGAGCGGC-3' 46), 12/96.20 (5'-AGCTCTGACCAATAACATCA-3') (SEQ ID NO: 37) (SEQ ID NO: 47), 12/96.21 (5'5'-NGSP: S'ATTAGAAATCCAGTTCACTGCT-3') (SEQ ID NO: CAGTGCTTGCTAACTTCAGTCAACC-3' (SEQ ID 48), 1/97.32 (5'-TCATGTCTGGCAAAGTACAAG-3') NО: 38). (SEQ ID NO: 49), 11/96.32 (5'Повнорозмірний ген CD86: ATTCACTGACGTCACCGA-31') (SEQ ID NO: 50) Прямий праймер Fel-B72 (І): 5'11/96.31 (5'-AAGGCTGTGGCTCTGA-3') (SEQ ID CGGGAATGTCACTGAGCTTATAG-3' (SEQ ID NO: NO: 51). Були ідентифіковані два клони, які вклю39) чають повнорозмірну послідовність CD80, відповіЗворотний праймер Fel-B72 (1176): 57дну початковій послідовності CD80, за винятком GATCTTTTTCAGGTTAGCAGGGG-3' (SEQ ID NO: двох точкових мутацій. Одна така мутація аміноки40). слотну послідовність не змінювала. Інша мутація Приклад 1B приводила до заміни лейцину на ізолейцин. ОтриКлонування CD80 (B7-1)-Syntro/SPAH; плазміманий внаслідок клон CD80 кішки був позначений да 917-19-8/16 917-19.8/16 (CD80-Syntro/SPAH). Відбирали клітини котячої селезінки і культиДля полегшення клонування гену CD 80 (В7-1) вували їх з конканаваліном-А протягом 5 годин. кішки, що знаходиться за будь-яким промотором 29 77382 30 вірусу віспи (поксивірусу), включаючим EcoRI- і зрілої форми з молекулярною масою приблизно BamHI-сайти клонування, два нових праймери 33,485кДа, ізоелектричною точкою 9,1 і сумарним були сконструйовані таким чином, щоб внести резарядом 10,24 при рН=7,0. Трансмембранний дострикційні EcoRI- і ВаmНІ-сайти клонування за 5'- і мен цього білка орієнтовно доводиться на аміно3'-кінцями кодуючої рамки CD80, відповідно. Ці два кислоти 241-271. праймери були такими: прямий праймер 1/97.43 Котячі CD80-TAMU і CD80-Syntro/SPAH - це C5'-TGCAGAATTCGGGTCACGCAGCAAAGTGG-3') кДНК і відповідні поліпептиди, які були виділені (SEQ ID NO: 52) і зворотний праймер1/97.6 (5'незалежно один від одного з двох різних джерел, і GCTAGGATCCAATCTATGTAGACAGGTGAGAT-3') при цьому їх нуклеотидні і амінокислотні послідов(SEQ ID NO: 53). Отриманий ПЛР-фрагмент розності трохи розрізнюються. Джерелом мРНК щеплювали рестриктазами - EcoRI і BamHI і клоCD80*TAMU були моноядерні клітини периферичнували до складу вектора O1L-SPV (за АссІної крові кішки, простимульовані конканаваліномсайтом в послідовності геномного HindlllА, а джерелом мРНК CD80-Syntro/SPAH були фрагмента Μ поксвірусу свиней - SPV) з отриманспленоцити кішки, простимульовані конканаваліням рекомбінантного вірусу SPV. У результаті буном-А. Відмінність за послідовністю кДНК між ла отримана касета 930-23. А1 - вектор O1L-SPV, CD80-TAMU і CD80-Syntro/SPAH пов'язана з нукщо включає кодуючу рамку CD80 кішки, що знахолеотидними замінами Τ С в 351-м положенні і диться за синтетичним «пізно-раннім» промотором С А в 670-м положенні. За амінокислотною посLP2EP2 геному SPV і що примикає до касети марлідовністю заміна 351-го нуклеотиду є несмислокерного гену lacZ E.coli, що знаходиться під контвою, а заміна 670-го нуклеотиду приводить до заролем синтетичного промотора пізнього гену LP2. міни нейтральної амінокислоти на нейтральну Плазмідний вектор 930-23. А1 котрансфікували лейцину на ізолейцин - в 224-м положенні поліпепразом з SPV-001 з отриманням рекомбінантного тиду. вірусу SPV, експресуючого білок В7-1 кішки і βВиділена і очищена кДНК CD86 (В7-2) кішки галактозидазу E.coli. складається приблизно з 1176 нуклеотидів, відпоПриклад 1С відаючи відкритій рамці, кодуючої поліпептид Субклоновані CD28 в гомологічний поксивіруCD86 кішки, що складається з приблизно 320 амісному геному вектор нокислот, у вигляді нативної пов'язаної з мембраКодуючий сегмент гену CD28 ампліфікували з ною або зрілою формою з молекулярною масою допомогою ПЛР з синтетичними праймерами, що приблизно 36,394кДа, ізоелектричною точкою 9,19 включають стандартні сайти клонування, що поі сумарним зарядом 11,27 при рН=7,0. винно полегшити клонування CD28 за будь-яким Виділена і очищена кДНК CD28 кішки складапромотором геному поксивірусу в ході конструюється приблизно з 689 нуклеотидів, відповідаючи вання специфічного вектора, гомологічного поксвівідкритій рамці, кодуючої поліпептид CD28 кішки, русу. Синтетичні праймери були сформовані так, що складається з приблизно 221 амінокислоти, у щоб внести EcoRI- і Bglll-сайти клонування за 5'- і вигляді нативної пов'язаної з мембраною або зрі3'-кінцями ПЛР-фрагмента, відповідно. Ці два лою формою з молекулярною масою приблизно праймери були такими: прямий праймер 7/97.1 (5'25,319кДа, ізоелектричною точкою 9,17 і сумарним GATGAATTCCATGATCCTCAGGCTGGGCTTCT-3') зарядом 9/58 при рН=7,0. (SEQ ID NO: 54) і зворотний праймер 7/97.2 (5'Виділена і очищена кДНК CTLA-4 кішки склаGATCAGATCTCAGGAACGGTATGCCGCAA-3') дається приблизно з 749 нуклеотидів, відповідаю(SEQ ID NO: 55). Отриманий внаслідок проведення чи відкритій рамці, кодуючої поліпептид CTLA-4 ПЛР ДНК-фрагмент розщеплювали рестриктазами кішки, що складається з приблизно 223 амінокисEcoRI і Bglll і клонували до складу вектора 01Lлот, у вигляді нативної пов'язаної з мембраною SPV з метою отримання рекомбінантного поксвіабо зрілою формою з молекулярною масою прибрусу. Була отримана касета 930-26. А1 - вектор лизно 24,381кДа, ізоелектричною точкою 6,34 і O1L-SPV, що включає (за АссІ-сайтом у послідовсумарним зарядом -0,99 при рН=7,0. ності геномного HindIII-фрагмента Μ поксвірусу Коекспресія CD80 з костимуляторною молекусвиней) кодуючу рамку CD28 кішки, що знаходитьлою CD28 або CTLA-4 і з пухлинним антигеном ся за синтетичним «пізно-раннім» промотором або антигеном патогенного організму зумовлює LP2EP2 геному SPV і що примикає до касети марздатність активувати або посилювати активацію Ткерного гену lacZ E.coli, що знаходиться під контлімфоцитів, зокрема, лімфоцитів пулу Th-1, і актиролем синтетичного промотора пізнього гену LP2. вувати ріст інших типів клітин. Коекспресія CD80 з Гомологічний плазмідний вектор 930-26. А1 котракостимуляторною молекулою CTLA-4 зумовлює нсфікували разом з SPV-001 з отриманням рекомздатність пригнічувати активацію Т-лімфоцитів, бінантного вірусу SPV, експресуючого білок CD28 зокрема, лімфоцитів пулу Th-1 Коекспресія CD86 з кішки і β-галактозидазу E.coli. костимуляторною молекулою CD28 або CTLA-4 і з Приклад 2 пухлинним антигеном або антигеном патогенного Характеристика кДНК і поліпептидів CD80 (B7організму зумовлює здатність активувати або по1)-TAMU, CD86 (В7-2), CD28, CTLA-4 і CD80 (B7силювати активацію Т-лімфоцитів, зокрема, лім1)-Syntro/SPAH кішки фоцитів Th-1, і активувати ріст інших типів клітин. Виділена і очищена кДНК CD80 (В7-1) кішки Коекспресія CD86 з костимуляторною молекулою довжиною приблизно 941 нуклеотидів складає CTLA-4 зумовлює здатність пригнічувати активавідкриту рамку, що кодує котячий поліпептид цію Т-лімфоцитів, більш конкретно лімфоцитів CD80, що складається приблизно з 292 амінокисTh-1. лот, у вигляді нативної зв'язаної з мембраною або 31 77382 Рівень ідентичності нуклеотидних і амінокислотних послідовностей 1 Гомолог людини (% ідентичності нуклеотидної послідовності) Гомолог людини (% ідентичності амінокислотно їпослідовності) Гомолог миші (% ідентичності нуклеотидної послідовності) Гомолог кролика (% ідентичності нуклеотидної послідовності) Гомолог кролика (% ідентичності нуклеотидної послідовності) Гомолог курки (% ідентичності нуклеотидної/аміно кислотно їпослідовності) Приклад 3 Використання котячих CD80 (В7-1), CD86 (В72), CD28 і CTLA-4 у вакцинах Наступні експерименти були проведені з метою оцінки, що підсилює імунітет активності котячих CD80, CD86, CD28 і CTLA-4 в складі вакцин для кішок. У одній з процедур кішкам у віці 8 тижнів внутрішньом'язово ін'єкували по 100мкг плазміди, що включає кДНК, що кодує котячі молекули CD80, CD86, CD28 і CTLA-4, в суміші з плазмідою, що включає кДНК вірусних генів env і gag вірусу FIV або env і gag вірусу FeLV, або, з іншого боку, внутрішньом'язово ін'єкували по 100мкг плазміди, що включає кДНК, експрессируючої попарні комбінації CD80/CD28 або CD80/CTLA-4, або CD86/CD28, або CD86/CTLA-4, в суміші з плазмідою, що включає кДНК вірусних генів env і gag (FIV) або env і gag (FeLV). Контрольні особини ін'єкцій CD80, CD86, CD28 і CTLA-4 не отримували. Кішок заздалегідь заражали вірулентними штамами FeLV або FIV і аналізували симптоми захворювання відповідно до описаного вище. Внаслідок початкового інфікування було встановлено, що кішки, яким вводили вектор з кДНК котячих CD80, CD86, CD28 і CTLA-4 і вектор з кДНК генів FIV або генів FeLV, виявили 100%-ву захищеність від захворювання в порівнянні з тваринами, яким вводили тільки вектор, що включає кДНК генів FIV або генів FeLV: в цій групі стійкість до захворювання становила 75%. У іншій процедурі кішкам у віці 8 тижнів внутрішньом'язово ін'єкували від 0,1 до 100мг очищеного білка котячих молекул CD80, CD86, CD28 і CTLA-4 або, в іншому варіанті, - попарні комбінації CD80 або CD86 в поєднанні з CD28 або CTLA-4, з використанням рекомбінантних векторів, що включають кДНК, описаних вище, а також внутрішньом'язово ін'єкували від 0,1 до 100мкг вакцини, що містить білки env і gag вірусу FIV або білки env і gag вірусу FeLV. Контрольним особинам ін'єкцій CD80, CD86, CD28 і CTLA-4 не проводили. Кішок заздалегідь заражали вірулентними штамами FeLV або FIV і регулярно аналізували розвиток захворювання у них. Отримані результати показали істотно знижену захворюваність у кішок, яким вводили очищений білок CD80, CD86, CD28 і CTLA-4 разом з вірусною вакциною FIV або FeLV, в порівнянні з кішками, що отримували вакцину, що містить тільки білки FIV або FeLV. Приклад 4 Використання котячих CD80 (В7-1), CD86 (В72), CD28 і CTLA-4 для пригнічення і запобігання росту пухлинних клітин Пухлинні клітини кішки трансфікували вектором, експресуючим CD80 або CD86 кішки в поєд 32 CD80 кішки 2 77 59 62 46 CD86 кішки 3 72 68 67/64 CD28 кішки 4 85 82 77 74 84/84 59/50 CTLA-4 кішки 5 88 88 79 78 нанні або з CD28, або з CTLA-4. Трансфіковані пухлинні клітини знову вводили тій же кішці, і присутність CD80, CD86, CD28 і CTLA-4 на поверхні пухлинної клітини посилювала неспецифічну імунну відповідь у відношенні і трансфікованих, і нетрансфікованих пухлинних клітин, що приводило до знищення локалізованих і метастазуючих пухлинних клітин . У іншій процедурі вектори, експресуючі CD80 або CD86 кішки в поєднанні або з CD28, або з CTLA-4, безпосередньо ін'єкували кішці в пухлину, внаслідок чого спостерігалася неспецифічна імунна відповідь відносно пухлинних клітин, що приводила до знищення як локалізованих, так і метастазуючих пухлинних клітин. Приклад 5 Клоновані і секвеновані кДНК CD80 кішки Вступ У доповнення до цитокінів деякі поверхневоклітинні молекули, як було показано, можуть посилювати або пригнічувати певну імунну відповідь. CD80 (В7-1) є допоміжною молекулою, яка зв'язується на відповідному їй рецепторі на поверхні Тлімфоцитів (Freeman et al., 1989). Така взаємодія забезпечує доставку повторних стимулів, що в поєднанні з первинним сигналом, опосередкованим розпізнаванням Т-клітинним рецептором антигену, презентованого з участю молекул МНС, зумовлює активацію і проліферацію Т-клітин (Allison & Lanier, 1994). Хоча білок CD80 уперше був описаний як антиген В-лімфоцитів, потім було встановлено, що він експресується рядом клітинних типів, в основному, що мають властивість презентування антигену (Freeman et al., 1989). У приматів і гризунів молекула CD80 - поліпептид з молекулярною .масою 60кДа, що складається приблизно з 290 амінокислот (Freedman et al., 1987; Freeman et al., 1989). Підтвердження передбачуваної амінокислотної послідовності вказує на характеристики, у відповідності з якими вона є членом імуноглобулінового суперсімейства (IgSF) (Peach et al., 1995). Вона складена двома позаклітинними імуноглобуліно-подібними (IgSF) доменами, гідрофобним трансмембранним доменом і коротким цитоплазматичним «хвостом» (Freeman et al., 1989). Позаклітинний домен зрілого білка складається з 124 N-кінцевих залишків варіабельного (V) IgSF-домену і потім з 100 амінокислот константного (С-подібного) IgSF-домену (Freeman et al., 1989). У складі гомолога CD80 людини є 8 потенційних сайтів М-глікозилування, і, хоч зрілий білок характеризується істотним рівнем глікозилування, ці вуглеводні залишки, як вважається, не пов'язані з процесами зв'язування з рецепторами CD28 або CTLA-4, тому що вони орієнтовані в протилежну від передбачуваного домену зв'язування сторону (Bajorath et al., 1994). Більш того видален 33 77382 34 ня вуглеводних залишків, мабуть, не впливає на (Schwartz, 1992). TCR-стимуляція при відсутності здібність до зв'язування, в зв'язку з чим передбадопоміжних сигналів може приводити до анергії чається, що їх функції пов'язані з підвищенням або зниження реактивності Т-клітинних популяцій розчинності позаклітинної частини даної молекули (Jenkins et al., 1987). Зв'язування молекули CD28 (Linsley et al., 1994a). на Т-клітині з молекулою CD80 на антигенCD80 зв'язується на двох різних рецепторах, презентуючій клітині розглядається як передаванекспресованих в різний час процесу Т-клітинної ня другого сигналу, необхідного для Т-клітинної активації. Рецептор CD28 виявляється у різних активації (Schwartz, 1992). Коли рецептори TCR тімоцитів, «наївних» і активованих Т-клітин, і для завантажені, у відсутність такого другого сигналу нього була продемонстрована участь в активації і «наївні» клітини не активуються і можуть стати проліферації Т-клітин (Aruffo, 1987). Другий рецепанергічними (Lanier et al., 1995). Така принципова тор для CD80 - CTLA-4 - звичайно виявляється роль взаємодії CD28-CD80 була виразно виявлена пізніше на повністю активованих Т-клітинах не тільки для процесу активації «наївних» клітин (Linsley et al., 1991b). Хоча роль CTLA-4 поки точно CD4+, але також і в клонах CD4+ Th1 і Th2 і для не визначена, передбачається, що ця молекула «наївних» Т-клітин CD8+ похідних від малих лімможе діяти як чинник супресії активної, що вже є фоцитів периферичної крові, що знаходяться в Т-клітинної відповіді (Hutchcroft & Bierer, 1996). стані спокою (Linsley et al., 1993a). Сама молекула CD80, мабуть, не здібна до Як і у випадку з сімейством рецепторів CTLAпередавання сигналу. її цитоплазматичний сег4/CD28, також є принаймні ще один додатковий мент відносно малий і не включає амінокислот, рецептор, що має відношення до CD80. Дослідля яких була б підтверджена сигнальна і каталідження, в яких намагалися виявити значення тична функція (Hathcock et al., 1994). Відсутність CD80 для первинної імунної відповіді, поставили консерватизму в структурі цитоплазматичних діляряд питань через те, що, хоч внесення CTLA-4Ig нок у пептидів людини і миші також узгодиться з пригнічувало імунні відповіді, навпаки, додання вірогідною відсутністю сигнальних функцій у білка моноклонального антитіла (mAb) до CD80, як здаCD80, який активний лише при зв'язувані з рецепвалося, не зумовлювало схожого ефекту торами CD28 або CTLA-4 (Linsley et al., 1994a). (Lenschow et al., 1993). При отриманні лінії мишей, Взаємодія між CD80 і CD28, як було показано, «вимкнених» за геном CD80, несподівано була є необхідною для переходу «наївних» Т-клітин в встановлена наявність другого рецептора CTLAактивований стан, що ініціює первинну Т-клітинну 4/CD28 (Freeman et al., 1993). Передбачили, що відповідь (Damie et al., 1988). Хоча CD80 був упетакі миші повинні мати схожий фенотип з раніше рше знайдений на активованих В-клітинах отриманими мишами, «вимкненими» за CD28, у (Freedman et al., 1987), після цього він був виявлеяких була неадекватна Т-клітинна відповідь ний у більшості груп специфічних антиген(Freeman et al., 1993). Однак було встановлено, презентуючих клітин, включаючи макрофаги і мощо «вимкнені» за CD80 миші формують нормальноцити (Freedman et al., 1987), клітини Лангерганну відповідь, а їх клітини АРС здатні формувати са (Symington et al., 1993), дендритні клітини (Liu et повторний сигнал, необхідний для дозрівання Тal., 1992), активовані Т-клітини (Razi-Wolf et al., клітин (Freeman et al., 1993). На основі цих даних 1992) і різні пухлинні клітини (Chen et al., 1992). було передбачено існування другого рецептора, Присутність молекули CD80 на клітинах АРС, як який зрештою і був виділений. Подальше виявбуло підтверджено, є важливою для активації і лення родинного рецептора CD86 (В7-2 або В7-0), СО4-позитивних, і CD8-позитивних Т-клітин (Allison як представляється, знімає ту суперечність, яка & Lanier, 1994; Bellone et al., 1994). Хоч-ця молекувиникла в аналізі «вимкнених» за CD80 мишей, а в ла в нормі в значній кількості присутня тільки на поєднанні зі схожістю структури і параметрів зв'яспецифічних-АРС, в лініях клітин деяких пухлин зування воно вказує на можливість того, що ці мобуло встановлене посилення вироблення сигналекули характеризуються спільністю функцій»! льної молекули (Chen et al., 1992). походження (Hathcock et al., 1994). Передбачається, що внаслідок трансформації CD86 (В7-2) виявляє певний рівень схожості з в деяких пухлиннородних лініях має місце посиCD80, зокрема, за структурою позаклітинних долення експресії CD80. У цих пухлинних лініях, поменів IgSF-V і IgSF-C (Freeman et al., 1993). Сумахідних не від антиген-презентуючих клітин, рівно рний рівень гомології цих молекул, однак, менший як і в деяких іморталізованних клітинних лініях за 25%, при тому, що консервативні залишки зосеCD80 є поверхневим білком, експресрованим на реджені на протилежних кінцях обох позаклітинних такому рівні, який достатній для зумовлення повдоменів (Bajorath et al., 1994). Хоч зв'язуючий сегної активації Т-клітин (Chen et al., 1992). Хоча кінемент не був встановлений ні для однієї з цих мотика експресії не чітка, можливо, похідна від пухлекул, гомологія послідовностей дозволила виділинних клітин CD80 може бути відповіддю на лити ділянку, перспективну з точки зору «онкогенний шок» і відображати еволюційний мевстановлення потенційної сайту взаємодії (Linsley ханізм, за допомогою якого імунна система здатна et al., 1994a). Незважаючи на відсутність консервидаляти трансформовані або пухлиннорідні кліватизму, CD80 і CD86 характеризуються схожими тини (Antonia et al., 1995). параметрами зв'язування на обох рецепторах, хоч Роль взаємодії CD28-B7 вважається ключовою CD86 характеризується більш швидким вивільненв процесі первинної активації Т-клітин. Розпізнаням з рецептора CTLA-4 (Linsley et al., 1995a). вання антигену з участю молекул МНС ТCD86, мабуть, характеризується схожими паклітинними рецепторами недостатнє для ініціації раметрами експресії в порівнянні з CD80, будучи оптимальної проліферації і активації Т-клітин експресрованим на активованих В-клітинах, Т 35 77382 36 клітинах, макрофагах і моноцитах (Azuma et al., експресію CD80 клітинами АРС, хоч, мабуть, це не 1993a). Однак, динаміка експресії цих двох молеіндукує експресію в інших типах клітин, експресуюкул в невеликій мірі розрізнюється (Hathcock et чих даний рецептор, включаючи ендотеліальні al.,1994). Загалом, CD86 з'являється раніше в клітини (Page et al., 1994). процесі активної імунної відповіді в порівнянні з Молекули CD80 і CD86, хоч і виявляють лише CD80 і можливо експресується моноцитами за 25%-вий рівень амінокислотної схожості одна з конститутивним типом (Freeman et al., 1991). Хоча одною, мають структурну схожість і розглядаються CD80 може з'являтися через 24 години після почаяк «віддалено-родинні» (Freeman et al., 1993). Готкової стимуляції, CD86 з'являється на ранньому мологічні залишки сконцентровані в складі імуногетапі відповіді або взагалі експресується мієлоїдлобуліно-подібних доменів при невеликій кількості ними клітинами постійно на невисокому рівні консервативних залишків в складі трансмембран(Hathcock et al., 1994). Ці два поверхневих білки ного і цитоплазматичного доменів (June et al., зумовлюють схожі внутрішньоклітинні реакції, бу1995). Передбачається, що сімейство, що включає дучи зв'язані на відповідних ним рецепторах на продукти генів В7, також, в доповнення до CD80 і поверхні Т-клітин як CD4+, так і CD8+ (Lanier et CD86, охоплює бутирофілін (ВТ), глікопротеїн мієal.,1995). Мабуть, відсутні будь-які відмінності в лін/олігодендроцитів (MOG), МНС-аналог курки здатності кожної з цих молекул ініціювати активаB-G (Linsley et al., 1994b). ВТ, MOG і B-G кодуютьцію і проліферацію Т-клітин або індукувати актився генами, що входять в геномний комплекс МНС, ність CTL (Hathcock et al., 1994). Таким чином, дащо вказує на вірогідний еволюційний зв'язок між ні, що є підтверджують, що обидві молекули головним комплексом гістосумісності і необхідниініціюють схожий сигнальний каскад після їх зв'ями костимуляторними молекулами (Linsley et al., зування рецепторами CD28 або CTLA-4, відповід1994b). но (Hathcock et al., 1994). Хоч, як представляється, Т-лімфоцити миші, що знаходяться в стані кінетика зв'язування обох цих молекул зі своїми спокою і людини на низькому рівні експресують рецепторами однакова і при цьому відсутні будьCD86, в той час як Т-клітини миші і людини (і Тякі прояви, що розрізнюються, поки не зрозуміле клітинні клони), активовані дією антитіл до CD3, еволюційне значення існування такої системи експресують CD80 і CD86 на істотному рівні «пара лігандів/пара рецепторів» (Lanier et al., (Hathcock et al., 1994). Експресія і CD80, і CD86 на 1995). активованих Т-клітинах може відображати здатCD80 спочатку був описаний як маркер Вність цих Т-клітин проліферувати за механізмом клітин, і високі рівні і CD80, і CD86 виявляються на аутокринної костимуляції (Azuma et al., 1993b). В-клітинах, стимульованих ліпополісахаридом Цікаво, що, як було показано, CD80 позитивно (ЛПС), анти-Ig, анти-СО40, конканаваліном-А (Конрегулюється на ВІЛ-інфікованих СD4-позитивних А), цАМФ, IL-2 і IL-4 (Hathcock et al., 1994). Як було Т-клітинах при одночасній негативній регуляції CD28. Передбачається, що це є вірогідним механіпоказано, в В-клітинах мишей -інтерферон і IL-5 змом вірусного передавання у випадку, коли неінпосилюють вироблення CD86, хоч поки немає фіковані Т-клітини CD4+ ініціюють опосередковааналогічних даних для людини або для CD80 в ний взаємодією CD28/CD80 контакт з зв'язку з вказаними імунорегуляторами (Azuma et інфікованими лімфоцитами (Haffar et al., 1993). al., 1993a). Динаміка експресії в В-клітинах у цих Моноцити периферичної крові людини на нидвох молекулах декілька різна. CD86 експресуєтьзькому рівні експресують CD80 і на високому рівні ся майже відразу після стимуляції (6 годин), в той - CD86, в той час як обробка чинником GM-CSF час як CD80 відсутній майже 24 години і аж до 48-ї години не досягає піку своєї експресії (Lenschow et або -інтерфероном приводить до інтенсифікації al., 1993). Вважається, що позитивна регуляція поверхневої експресії і CD80, і CD86 (Вагсу et al., CD80 на В-клітинах знаходиться під контролем 1995). ЛПС є могутнім індуктором експресії CD80 в сигнальних механізмів, опосередкованими молемоноцитах периферичній крові людини (Schmittel кулами класу IIMHC (Nabavi et al., 1992). Два інших et al., 1994). Поки немає даних про очеревинні маповерхнево-клітинних рецепторів також, мабуть, крофаги людини, в той час як відомо, що макрофаважливі в зв'язку з експресією CD80. Перехресне ги миші, що перебувають в стані спокою експрезв'язування CD40, експресованого на В-клітинах, з сують CD80 і CD86 на низьких рівнях (Freeman et Ig або Т-клітинами, експресуючими відповідний al., 1991; Hathcock et al., 1994). Стимуляція ЛПС і рецептор, зумовлює посилення експресії CD80 -інтерфероном макрофагів мишей збільшує рі(Azuma et al., 1993b), в той час як перехресне зв'явень поверхневої експресії, хоч -інтерферон в зування Fc-рецептора зумовлює зниження експрепоєднанні з інтерлейкіном-10 знижує рівень синтесії обох молекул (Вагсу et al., 1995). зу обох цих рецепторів (Ding et al., 1993). CD40 і ліганд цього рецептора CD40L, як пеДендритні клітини селезінки на низькому рівні редбачалося, є елементами механізму, що бере експресують обидві молекули, а клітини Лангергаучасть в регуляції експресії CD80 на клітинах АРС нса на низькому рівні експресують CD86, хоч при (Page et al., 1994). CD40 експресований в різних культивуванні є тенденція до посилення експресії типах клітин, включаючи В-лімфоцити, моноцити, в обох типах клітин (Larsen et al., 1994). При кульдендритні клітини, фібробласти і ендотеліальні тивуванні дендритних клітин CD86, мабуть, підляклітини людини, і може позитивно регулюватися на гає впливу більш могутньої, а також більш ранньої цих клітинах з присутністю -інтерферону (de Boer позитивної регуляції, що може грати важливу роль et al., 1993). Ліганд CD40 (CD40L) експресується в опосередкуванні сигнальних шляхів в цих клітиактивованими CD4-позитивними Т-клітинами. Зв'янах (Hathcock et al., 1994). Цікаво, що, хоч IL-10 не зування CD40 і CD40L, як було показано, посилює впливає на експресію CD80 дендритними клітина 37 77382 38 ми, він активний за негативною регуляцією ексразі зараження вірусом імунодефіциту (ВІЛ) довгопресії CD86 (Buelens et al., 1995). Повідомлялося тривала відсутність симптомів захворювання зв'я(O'Doherty et al., 1993), що, хоча початкові рівні зується з високими рівнями CTL пам'яті CD8+, спеCD80 в дендритних клітинах дуже низькі, після їх цифічними відносно вірусних білків Gag, Pol і Env, і дозрівання рівень, що є CD80 підвищується. Ексдуже низьким числом копій ВІЛ-ДНК і РНК в монопресія CD80 клітинами Лангерганса пригнічується і ядерних клітинах периферичної крові (Rinaldo, 1995). Навпаки, у хворих на пізніх стадіях СНІД IL-10, і -інтерфероном, хоча обробка колонієчисло CTL пам'яті (mCTL) різко знижене (Zanussi стимулюючим чинником гранулоцитів/макрофагів et al., 1996). Узгодженість цих даних вказує на те, ревертує пригнічення, викликане -інтерфероном, що CTL пам'яті можуть бути основним чинником але не пригнічення, викликане IL-10 (Ozawa et al., контролю інфекції в організмі-реципієнті і можуть 1996). грати ключову роль в формуванні імунітету у неіЯк було показано, у людини і миші специфічні нфікованих осіб (Zanussi et al., 1996). Крім того, цитокіни здійснюють контроль експресії і CD80, і патогенетичні зв'язки з ВІЛ-інфекцією відображаCD86. Інтерлейкін-4 є могутнім індуктором CD86 іють вірогідну роль CD80 і CD28 в розвитку СНІДу. в меншій мірі індуктором CD80 в В-клітинах (Stack Також було висловлене припущення, що CD80 et al., 1994), в той час як -інтерферон посилює бере участь в патогенезі ВІЛ-інфекції (Haffar et al., експресію CD86 в різних типах клітин, включаючи 1993). У нормі Т-клітини експресують CD80, але на В-клітини, моноцити і макрофаги (Hathcock et al., невисокому рівні і тільки після активації (Schwartz, 1994). Хоч, як видно, -інтерферон зумовлює по1992). У модельному аналізі ВІЛ-інфекції in vitro в силення експресії CD80 в моноцитах, він може алостимульованих лініях первинних Т-клітин було приводити до ослаблення експресії а макрофагах. показано, що CD28 регулюється негативно, а ексIL-10, навіть в присутності -інтерферону, ослабпресія CD80, очевидно, посилюється нарівні з ляє експресію CD80 і CD86 (Ding et al., 1993). Така МНС СИ (Haffar et al., 1993). Хоч точні механізми взаємодія може відображати вірогідний механізм цих процесів поки не визначені, можна передбачиперемикання ТЫ-відповіді (DTH) на Th2-відповідь ти існування двох механізмів можливої ушкоджую(гуморальна). Однак, IL-10 не впливає на експречої дії. Присутність CD80 на поверхні разом з мосію CD80 в дендритних клітинах (Buelens et al., лекулами класу II може зумовлювати 1995). Це, крім того, може відображати роль цих інтенсифікацію контактів між інфікованими Тмолекул в регуляції груп Т-хелперів, оскільки вваклітинами і неінфікованими СD4-позитивними кліжається, що дендритні клітини грають важливу тинами (Haffar et al., 1993). Хоча така взаємодія роль в ініціації імунної відповіді 2-го типу. Інтерможе приводити до підвищення інтенсивності облейкін-7 посилює експресію CD80 в Т-клітинах, міну між цими Т-клітинами, іншою функцією може хоча його вплив в інших типах клітин поки не вибути підвищення CTL-опосередкованого розпізназначений (Yssel et al., 1993), в той час як було вання і знищення клітин за рахунок генерування встановлено, що експресія CD80 В-клітинами опоповторного сигналу внаслідок взаємодії CD80 на середковується за рахунок перехресного зв'язуповерхні інфікованої клітини з рецептором CD28, вання з TNF-рецептором р75, а експресія може що експресується CD8-позитивною Т-клітиною бути збільшена в присутності IL-4 (Ranheim & (Haffar et al., 1993). Це може прискорювати скороKipps, 1995). Цікаво, що TNF належить до того ж чення популяції лімфоцитів CD4+, що корелює з сімейства молекул, що і CD40 - інший потенційний маніфестацією захворювань, пов'язаних з СНІДом ініціатор експресії CD80. Мабуть, GM-CSF поси(Haffar et al., 1993). лює поверхневу експресію CD80 дендритними І у миші, і у людини експресія білків сімейства клітинами і клітинами Лангерганса, в той час як В7 розглядається як важливий чинник імунного інтерферон зумовлює посилення вироблення тільрозпізнавання трансформованих клітин (Chen et ки CD86 в цих клітинах (Larson et al., 1994). al., 1992). Хоча експресія була встановлена в деДовгий час вважалось, що розпізнавання, зв'яяких типах трансформованих клітин, більшість зування і лізис трансформованих і інфікованих пухлин в нормі не експресують CD80 або CD86, вірусом клітин-мішеней СD8-позитивними цитотокщо тим самим робить неймовірним те, що у разі сичними Т-лімфоцитами (CTL) опосередковуються експресії потенційно імуногенного пухлинного антільки за рахунок TCR-розпізнавання чужорідних тигену буде мати місце повноцінне його розпізнапептидів, експресованих в зв'язку з молекулами вання Т-клітинами (Chen et al., 1993). Однак екскласу І МНС (Berke, 1993). Недавно було встановперименти з трансфекції з використанням лено, що ряд поверхово-клітинних молекул, ексмолекули CD80 з метою посилення цитолізу пухпресованих і CTL, і клітинами-мішенями, необхідлинних клітин виявилися успішними (Hodge et al., ний для того, щоб відбулася повна взаємодія 1994). (Mescher, 1992). Ключовим учасником даної взаєРетровірусні і засновані на вірусі коров'ячої вімодії є CD80 і відповідний йому рецептор CD28. спи вектори, експресуючі функціональну молекулу Допоміжний сигнал, що генерується взаємодією CD80, були використані для трансфекції злоякісB7-CD28, необхідний для того, щоб малі СО8них клітин (Li et al., 1994; Hodge et al., 1994). Ці позитивні лімфоцити, що перебувають в стані споклітини, експресуючі CD80 в доповнення до погано кою диференціювалися в літичний стан (Mescher, (в нормі) розпізнаваних пухлинних антигенів, після 1992). Цікаво, що після диференціювання CTL цей цього зворотно вносили донору, що, як передбаповторний сигнал перестає бути необхідним для чалося, приведе до виникнення клітинної імунної вияву літичних властивостей (Hodge et al.,1994). відповіді у відношенні пухлинних антигенів, ексДовгий час був відомий, що CTL є ключовими пресованих на клітинах злоякісних пухлин медіаторамипротивірусного імунітету. У людини в 39 77382 40 (Townsend & Allison, 1993). Результати цих експепрямий праймер В7-2: GGC CCG AGT А (СТ) A риментів з різними формами пухлин виявилися на AGA ACC GGA С диво високоефективними. У багатьох випадках зворотний праймер В7-3: CAG (AT)TT CAG організм-реципієнт формував могутню клітинну GAT С (СТ)Т GGG ААА (CT)TG (SEQ ID NO: 56). відповідь проти злоякісної пухлини, контролюючи Для ампліфікації даного продукту використали або знищуючи її (Hodge et al., 1994). Подальша протокол полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР) з реінтродукція в організм донора пухлинних клітин, «гарячим стартом» з Taq-полімеразою. Спочатку що мають поверхневу молекулу CD80 або позбавреакційну суміш без Taq-полімерази нагрівали до лених її, зумовлює схожі рівні протипухлинного 95°С протягом 5 хвилин (етап «гарячого старту») з імунітету (Hodge et al., 1994). Таким чином, вважаметою запобігання утворення димерів між прайється, що після встановлення імунної пам'яті момерами. Полімеразу додавали перед початком лекула CD80 не є необхідною для підтримки відтемпературного циклу. Потім ПЛР-реакцію нагріповіді або для ініціації її у випадку реінтродукції вали до 95°С на 30 секунд з метою дисоціації дво(Hodge et al., 1994). Ці експерименти показали, що ланцюгової ДНК. Потім реакцію охолоджували до молекула CD80 є ефективним медіатором клітин42°С на 30 секунд для забезпечення відпалення ного імунітету і що в конкретних типах пухлин клівироджених праймерів. Відносно низька температинні відповіді можуть бути індуковані за вірогідтура відпалювання полегшувала зв'язування ним контролем злоякісних новоутворень і праймерів у разі їх не 100% гомологічності з мізапобіганням рецидивам (Hodge et al., 1994). шенню. Потім реакцію нагрівали до 72°С на 45 Посилення експресії CD80 може мати негатисекунд, що є оптимальною температурою для аквні наслідки, що виявляється в розвитку деяких тивності Taq-полімерази, що забезпечує добудуформ аутоімунітету. Вважається, що CD80 у взаєвання (подовження ланцюга) праймеру і копії промодії з IL-12 є важливим на ранніх стадіях розвиттилежного ланцюга ДНК. Даний температурний ку розсіяного склерозу і зумовлює стимуляцію Тцикл повторювали 30 разів. Після цих 30 циклів клітин і розвиток DTH (Windhagen et al., 1995). Екзаключний етап проводили при 72°С на протязі 7 спериментально викликаний аутоімунний енцефахвилин з метою полегшення добудування будьломієліт (ЕАЕ) може бути частково пригнічений яких неповних продуктів. Після візуалізації в 1%введенням немембранного CTLA-4Ig експерименвому агарозному гелі отриманий продукт лігували тальному об'єкту. Пригнічення демієлінізації при протягом ночі при 16°С до складу клонуючого векблокуванні взаємодії CD28/CD80 відображає віротора ТА (InVitrogen, San Diego, CA) для подальшогідну роль цієї взаємодії в загостренні захворюго секвенування. За 2мкл лігаційної реакції виковання (Arima et al., 1996). ристали для трансформації компетентних клітин Важливість молекули CD80 в розвитку ефекInvaF'. Трансформовані бактерії наносили смугами тивної імунної відповіді очевидна. Хоча кДНК, що на пластини LB (50мкг/мл ампіціліну), покриті кодує цей білок, була виділена у гризунів і прима40мкл розчином 50мкг/мл X-Gal. На наступний тів, вона не була раніше виявлена в інших таксодень відбирали колонії білого кольору і інокулуваномічних групах ссавців. Кішка є поширеною доли їх в 5мл культурального середовища LB, що машньою твариною і потенційною моделлю містить 100мкг/мл ампіціліну, і культивували проретровірусних захворювань. Клонування імунолотягом ночі при 37°С при обертанні з швидкістю гічних чинників у кішок надають важливий інстру225об./хв. мент ветеринарних досліджень, зокрема, в зв'язку Міні-препарування проводили на матеріалі ніз дослідженнями розвитку і профілактики захвочних культур з метою виявлення клонів, які несуть рювань у інших видів організмів. плазміду з вставкою при правильній орієнтації. Матеріали і методи Плазміду екстрагували з культур з використанням Виділення початкового фрагмента стандартної процедури лужного лізису з подальмРНК була екстрагована з моноядерних клітин шим очищенням ДНК шляхом екстракції сумішшю периферичної крові (РВМС), простимульованих фенолу і хлороформу (Maniatis et al., 1982). ДНК протягом 16 годин Кон-А з використанням реагеносаджали 2 об'ємами етанолу і потім розщеплюту для РНК-екстракції RNAzolB (Biotexc, Houston, вали рестриктазою EcoRI. Результати цього розТХ). Початково кДНК була синтезована на матриці щеплення візуалізовали в 1%-вому агарозному цієї РНК за допомогою зворотної транскриптази гелі з метою ідентифікації колоній, несучих плаз(ОН), де як зворотний праймер використали олігоміду, що включає вставку в правильній орієнтації. тимідин. РНК і оліго-dT нагрівали до 75°C протяПотім таку плазміду очищали від позитивних клогом 3 хвилин з метою видалення повторних струкнів і секвеиували з використанням реактивів для тур. Потім додавали ОН, dNTP, буфер і секвенування методом терминації ланцюга з 35Sдистильовану воду і отриману суміш інкубували міткою за Сейнджером (Sequenaseo, US протягом 1 години при 42°С. Після цієї інкубації Biochemicals, Cleveland, ВІН) або методом циклічзразок нагрівали до 95°С протягом 5 хвилин з меного секвенування з кінцевою флуоресцентною тою інактивації ОН. Вироджені праймери, похідні міткою (Perkin Elmer, Norwalk, СТ). За даними нуквід консенсусних ділянок в складі опублікованих леотидноі послідовності кДНК специфічні зворотні нуклеотидних послідовностей CD80 людини і миші і прямі праймери були сконструйовані для викори(GeneBank, Gaithersburg, MA), використовували стання в методі «швидкої ампліфикації кінців потім для початкової ампліфікації з складу даного кДНК» (5'-RACE) і для виділення 3'-послідовності в гену 344-нуклеотидного фрагмента, що кодує поєднанні з виродженими прайм ерами з складу 3'центральний сегмент в складі константного донетрансльованого сегмента (UTR). мену: 41 77382 42 Виділення 5'-сегмента B7-620: TAT GAC AAA CAA CCA TAG CTT С Ампліфікаційний протокол кДНК Marathon (SEQ ID NO: 66). (Clontech, Palo Alto, CA) використовували для одеПотім виродженні зворотні праймери підбираржання 5'-послідовності даного гену мРНК була ли за консенсусними ділянками 3'-UTR гени CD80 виділена з РВМС, простимульованих протягом 12 людини і миші: годин Кон-А і одночасно протягом 4 годин - ліпоВ7-1281: G(A/G)A AGA (A/T)TG CCT CAT полісахаридом. мРНК екстрагували з використанGA(G/T) CC (SEQ ID NO: 67) ням реагенту для екстракції РНК ULTRASPEC B7-1260: CA(C/T) (A/G)AT CCA АСА TAG GG (Biotexc, Houston, ТХ). кДНК отримали з викорис(SEQ ID NО:68). танням «якірного праймера» оліго-dT з вироджекДНК били отримані на матеріалі РНК, екстраними нуклеотидами за 5'-кінцем для полегшення гованих за допомогою ULTRASPEC (Biotexc, зв'язування цього праймера з далеким 5'-кінцем Houston, ТХ), виділених із РВМС, простимульоваполіаденілового «хвоста». Потім кДНК транскриних Кон-А і ЛПС відповідно до описаного вище. бували відповідно до описаного вище. Специфічні Якірний праймер оліго-dT використовували як вилінкери лігували на цю кДНК з використанням хідний зворотний праймер для транскрипції РНК у ДНК-лігази фагу Т4. ПЛР «вниз від точки лігуванкДНК. ПЛР із полімеразою Taq проводили на матня» здійснювали на матриці кДНК з використанням риці отриманої кДНК із використанням специфічвнутрішнього зворотного праймера, специфічного них прямих праймерів вироджених зворотних у відношенні початково ампліфікованої ділянки: праймерів (5 хвилин при 95°С 1 цикл; 30 секунд В7-284: ТТА ТАС TAG GGA CAG GGA AG при 95°С, 30 секунд при 42°С і 45 секунд при 72°С (SEQ ID NO: 58) - 30 циклів; 72°С на протязі 7 хвилин). Два раунди В7-190: AGG CTT TGG AAA ACC TCC AG «гніздових» ПЛР-реакцій були необхідні для того, (SEQ ID NO: 59), щоб одержати єдиний фрагмент правильного розi якірного праймера, комплементарного лігоміру. Одержаний продукт вирізали з 1,5%-го агаваної лінкерної послідовності. Параметри ПЛР розного гелю, очищали відповідно до описаного «вниз від точки» з химерною полімеразою KlenTaq вище і секвенували методом секвенування з кін(Clontech, Palo Alto, CA) були такими: 5 хвилин при цевою флуоресцентною міткою (Perkin Elmer, 95°С - 1 цикл; 30 секунд при 95°С, 30 секунд при Norwalk, CN). 72°С і 45 секунд при 68°С - 5 циклів; 30 секунд при За даними секвенування 5'- і 3'-сегментів конс95°С, 30 секунд при 65°С і 45 секунд при 68°С - 5 труювали праймери, які б дозволили ампліфікувациклів; 30 секунд при 95°С, 30 секунд при 60°С і 45 ти ділянку, що кодує повнорозмірну відкриту рамку секунд при 68°С - 25 циклів. 1мкл даної реакції гену CD80 кішки: розчиняли в 50мкл води і 5мкл отриманих розвеB7-START: ATG GGT CAC GCA GCA AAG TGG день потім використали для «гніздової» ПЛР (5 (SEQ ID NO: 69) хвилин при 95°С - 1 цикл; 30 секунд при 95°С, 30 В7-960: CCT AGT AGA GAA GAG СТА AAG секунд при 65°С і 45 секунд при 68°С - 30 циклів, з AGG С (SEQ ID NO: 12). полімеразою KlenTaq) з лінкер-специфічним якірБула використана раніше отримана на матеріним праймером і ген-специфічним зворотним алі РВМС кДНК, для якої відома наявність у ній праймером, розташованим з 5'-сторони за відноДНК, що кодує шуканий ген. У цій реакції ПЛР (5 шенням до початкового праймеру. хвилин при 95°С - 1 цикл; 30 секунд при 95°С, 30 В7-20: TTG ТТА TCG GTG ACG TCA GTG секунд при 42°С і 45 секунд при 72°С - 30 циклів; (SEQ ID NO: 60) 72°С на протязі 7 хвилин) використовували химерВ7-135: САА ТАА CAT CAC CGA AGT CAG G ну полімеразу KlenTaq - цей «збірний» фермент (SEQ ID NO: 61). зберігає деяку 5'-екзонуклеазну активність, що По 20мкл кожної реакції візуалізовали в 1,5%дозволяє знизити частоту випадкових помилок, що вому агарозному гелі і точний за розміром фрагчасто відбуваються при проведенні ПЛР із полімемент вирізали з гелю. кДНК екстрагували і очищаразою Taq. У реакції ампліфікували 960ли з агарози шляхом центрифугування зрізу гелю нуклеотидний фрагмент, що клонували до складу через розпилювач гелю і фільтр Micropure з пораклонуючого вектора ТА (InVitrogen, San Diego, CA) ми 0,22мкм (Amicon, Beverly, MA). Потім очищену і секвенували відповідно з раніше описаним. В ДНК прямо секвенували з використанням секвенуостаточній послідовності шуканого гену були вравання з кінцевою флуоресцентною міткою (Perkin ховані кДНК від двох різних тварин. Кожен нуклеоElmer, Norwalk, CN). тид у послідовності цього гену незалежно перевіВиділення 3'-сегменту ряли принаймні за трьома різними 3'-Сегмент даного гену виділяли шляхом підпослідовностями, отриманими в окремих ПЛРбору п'яти ген-специфічних праймерів за послідореакціях, з. метою зниження імовірності неточносвністю 344-нуклеотидного фрагмента раніше і сектей, що походять від помилок, індукованих самою венованої 5'-ділянки: ПЛР. B7-S220: GTC ATG ТСТ GGC ААА СТА САА G Результати (SEQ ID NO: 62) РНК, екстраговану з тканин експериментальВ7-50: CAC TGA CGT CAC CGA TAA CCA С ної кішки НК5, використовували для вихідних (SEQ ID NO: 63) спроб апліфікувати ген CD80, однак ця кішка після B7-140: CTG ACT TCG GTG ATG TTA TTG G цього була умертвлена і наступні продукти брали (SEQ ID NO: 64) від інших тварин. У вихідній ампліфікації РНК кліB7-550: GCC АТС AAC АСА АСА GTT ТСС тин РВМС кішки НК5, простимульованих Кон-А, (SEQ ID NO: 65) одержали 344-нуклеотидний продукт, що виявляв 43 77382 44 70%-вий рівень ідентичності з геном CD80 людини. продукту необхідно було провести серію «гніздоПраймери були специфічні у відношенні до ділянвих» реакцій. У первинних реакціях ПЛР, у яких ки в центрі послідовності, що кодує, відповіднийо використовувалися ці вироджені праймери і якірні константний імуноглобуліноподібний домен. Хоча праймери з меж 344-нуклеотидної послідовності і в цих вихідних експериментах використовували 5'-сегмента, не вдалося в результаті одержати додаткові виродженні праймери з метою ампліфівиразні ідентифіковані бенди. Однак, «гніздові» кації ділянок, які б кодували більш значний сегреакції при використанні розведеного первинного мент пептиду, тільки при сполученні праймерів В7продукту і додаткових специфічних 5'-праймерів 2 (прямий) і В7-3 (зворотний) одержали продукт дозволили одержати продукт, що кодує 3'-ділянку, придатного розміру. Наступні експерименти, у яких що залишилася. ці додаткові вироджені праймери використовували Після секвенування 3'-продукту було встановпоряд з ген-специфічними праймерами, виявилися лено, що за межами константного Ig-подібного безуспішними. Отже, і 5'-, і 3'-ділянки повинні бути домену рівень ідентичності знову знижувався. Дивиділені з застосуванням інших методів. стальний кінець послідовності, що кодує, вказав на Групу із шести нових ген-специфічних праймедуже низький рівень ідентичності, що ще більш рів сформували на матеріалі даних секвенування, знижувався після стоп-кодону. проведеного на вихідному продукті (прямі: В7-20, На матеріалі 3'-послідовності сконструювали В7-135, В7-284, В7-190; зворотні: В7-140, В7-50). В зворотний праймер, що виходив за межі послідовнаслідку зворотні праймери використовували в ності, що кодує, починаючи з 960-го нуклеотиду. З ПЛР-методі 5'-RACE, що деякою мірою подібний з цією конструкцією в сполученні з праймером, .що методом, що застосовувався для успішної ампліпокриває старт-кодон, ампліфікували продукт очіфікації 5'-сегмента молекули CD28. Однак при куваного розміру. Секвенування кінцевого продуквикористанні цього методу продукти не були ту показало, що усі раніше встановлені ділянки отримані. дійсно перекриваються, і отриманий фрагмент В ампліфікаційній системі для кДНК Marathon являє собою неприривну і повну нуклеотидну посRACE (Clontech, Palo Alto, CA) успішно ампліфікулідовність гену CD80 кішки. вали ділянку, що відповідає 5'- послідовності, що Для ампліфікації кінцевого продукту зразки кодує. РНК, похідна від клітин ЕК6, простимульоампліфікували на матеріалі РНК, виділеної з ваних Кон-А, була успішно ампліфікована за доРВМС, простимульованих Кон-А, узятих у тварин помогою даного протоколу. Вихідну ампліфікацію ED3 і ЕК6. Принаймні два продукти від кожної тваздійснили з праймерами В7-284 і В7-3 і якірним рини секвенували повністю, а кожний з нуклеотидпраймером АРІ. У цій реакції не було отримано них сайтів був перевірений і підтверджений привиразного єдиного бенда, тому з використанням наймні за трьома правильно ліченими цього продукту як матриці провели «гніздові» реапослідовностями. Продукт, отриманий від тварини кції з використанням праймерів В7-20 і В7-135 як ЕК6, потім клонували до складу клонуючого векто«гніздових» (тобто внутрішніх стосовно попередніх ра ТА для наступного маніпулювання і як еталон. праймерів) зворотних праймерів і якірного прайПовнорозмірна нуклеотидна послідовність предмера АРІ як прямого праймера. Продукт придатної ставлена на Фіг.8. довжини одержали в кожній з цих реакцій. Фрагмент довжиною 960 нуклеотидів включає Дані, отримані при прямому секвенованії простарт-кодон за 1-им положенням, стоп-кодон за дуктів реакції RACE, дозволили домогтися повної положенням 888 і додатково 72 нуклеотиди 3'ідентичності на ділянках довжиною 20 і 135 п.н., нетрансльованої ділянки. Серед продуктів, що відповідно, які перекривалися з вихідним секвеноодержали і секвенували в ході встановлення повваним продуктом довжиною 344 п.н. Продукти понорозмірного фрагмента, були секвеновані додатдовжували від відомої 5'-ділянки через старткові 5'- і 3'-ділянки (дані не показані). кодон ATG гену кішки в сторону 5'Секвенування ділянки, розташованної вище нетрансльованого сегмента. Ідентичність 5 істарт-кодону, на матеріалі продуктів 5'-RACE, попослідовності, що кодує, похідної від цих продукказало, що кодон ATG, визначений у положеннях тів, і 5'-ділянки гену CD80 людини була меншою, 1-3, є першим сайтом, що кодує (метіонін) у рамці чим ідентичність, обумовлена між 344зчитування і займає аналогічне положення в поснуклеотидним сегментом гену кішки і аналогічною лідовностях миші і людини. Стоп-кодон, що знаходілянкою гену людини. Було встановлено, що подиться в положенні 888, також, як підтверджуєтьдібна втрата гомології виявляється між послідовся, знаходиться в подібному положенні в раніше ностями людини і миші за тими ж самими сегменсеквенованих генах. Порівняння послідовностей тами. Порівняння даних за послідовностями продемонструвало рівні ідентичності 77% і 62% з ділянок за межами сегмента, що кодує, показало опублікованими нуклеотидними послідовностями подальше виразне зниження рівня консерватизму генів CD80 людини, і миші, відповідно Рівень го(дані не включені). мології з послідовностями інших приматів і гризуНову групу вироджених праймерів, що кодують нів порівняємо з рівнями, встановленими для лю3'-нетрансльовану ділянку, синтезували за парадини і миші, відповідно. У кожного з видів рівень метрами консенсусних ділянок у межах 3'-UTR ідентичності з геном CD86 був меншим за 25%. послідовностей людини і миші. За допомогою цих З використанням комп'ютерного пакету пропраймерів успішно ампліфікували кДНК, що трансграм для аналізу ДНК MacVector (IBI, Rochester, крибується з РНК, виділеної з РВМС, простимуNY) нуклеотидну послідовність «транслювали» в льованих Кон-А, узятих від кішки ED3. На відміну амінокислотну послідовність. У результаті такого від вихідної ампліфікації, для одержання кінцевого розшифрування визначили 292-амінокислотний 45 77382 46 пептид, подібний за розміром, з білками і миші, і послідовностями в істотному ступені не змінюють людини, хоча і не ідентичний їм. Сигнальний сегпептид, у випадку ж CD80 консерватизм амінокисмент, як передбачається охоплює перші 25 амінолотної послідовності в цілому не настільки критичкислот. Позаклітинний домен даної молекули ний, а, отже, зміни за довжиною цієї молекули в складений 115 амінокислотами домену, подібного ході еволюції «більш припустимі». з варіабельним імуноглобуліновим доменом (до Хоча в цілому нуклеотидні послідовності вияв139-го залишку), і 110 амінокислотами домену, ляють середній рівень ідентичності, існують виподібного до константного імуноглобулінового дозначені труднощі у виділенні повнорозмірної посмену (приблизно до 240-го залишку). Трансмемблідовності. Вихідний продукт CD80 був отриманий ранний домен, що складений залишками 241-271, за константним доменом цієї молекули - тобто за переходить у короткий цитоплазматичний «хвіст», тією ділянкою, що виявляє найвищий рівень конщо складається з 21 амінокислот. Як і в молекулі серватизму в послідовності кДНК даного виду. людини, поліпептид кішки включає 8 потенційних Праймери, що маркирують цю ділянку і дозволясайтів N-глікозилування, хоча їхнє розташування ють ефективно апліфікувати продукт, одержали не ідентичне Рівень гомології між білками кішки, простим чином, у результаті чого 344людини і миші істотно менший, за рівень ідентичнуклеотидний фрагмент охопив найбільш консерності відповідних нуклеотидних послідовностей вативну ділянку IgC-подібності. На жаль, через (таблиця 1). відсутність гомології в послідовностях сигнального сегмента, цитоплазматичного домену і 3'-UTR для Таблиця 1 виділення послідовностей цих ділянок потрібно прикласти більше зусиль. Наявність даних за секПорівняння рівнів гомології венуванням центральної ділянки білка, однак, допослідовностей CD80 кішки, миші і людини зволяє визначити відправну точку, від якої можуть бути визначені інші ділянки цієї молекули. CD80 Відсоток гомології з послідовністю кішки Вид кішки являє відмінний приклад того, як шляхом Нуклеотидна Амінокислотна одержання короткого фрагмента шуканої молекуЛюдина 77% 59% ли і застосовуючи методи RACE і виродженні Миша 62% 46% праймери в сполученні з якірними праймерами, що відповідають встановленому сегменту, може бути Порівняння передбачуваної амінокислотної досить легко отримана повнорозмірна послідовпослідовності CD80 кішки з передбачуваною посність цієї молекули. лідовністю людини вказує на те, що велика частиПорівняння передбачуваної амінокислотної на гомологічності цих двох молекул зосереджена в послідовності цих клонованих молекул CD80 покаконстантному домені (амінокислоти 140-240). Існує зує відсутність загальної гомології. Поліпептиди незначна гомологія між цими пептидами за сигнамиші і людини виявляли менш чим 50%-вий рівень льним сегментом і вона відсутня за межами IgVгомології за амінокислотними послідовностями. Це подібного домену. Як уже зазначалося, консервапорівняне з 59%-вим рівнем ідентичності при порітизм істотний у послідовності константного домевнянні білків кішки і людини і 46%-вий рівень іденну, однак ця ідентичність майже не виходить за тичності поліпептидів кішки і миші, що, можливо, його межі, і дуже низький рівень гомології виявлявідображає еволюційне споріднення цих видів. ється за трансмембранним доменом і цитоплазмаПорівняння профілів, що пророкуються, гідрофільтичним «хвостом» пептиду кішки і аналогічних діності амінокислот кішки і людини, що дозволяють лянок у молекулі людини. визначити ті залишки, що були порушені або пеПорівняння генів CD80 кішки, людини і миші з реміщені через їх відносну гідрофільность, покагенами CD86 миші і людини показує, що, хоча ісзало, що, хоча на рівні амінокислотної послідовнонує дуже обмежений рівень гомології між цими сті конкретні амінокислоти могли і не зберегтися, двома членами сімейства В7, амінокислоти, що ці зміни, очевидно, носили відносно консервативрозглядаються як діагностичні для генів сімейства ний характер. Це вказує на ймовірне збереження В7, зберігаються і у складі білка кішки. Ці молекули ознаки гідрофільності/гідрофобності даної молекувключають залишки, що приблизно беруть участь ли, що, виходить, може відповідати подібному за у просторовому укладанні («фолдингу») і складаструктурою в цілому поліпептиду. Для поверхневоють сайт зв'язування. клітинного білка, мабуть, характерна наявність Хоча рівень гомології між послідовностями конкретних амінокислот, що безпосередньо залуCD80 людини і кішки не настільки великий, як річені в процес зв'язування, а також інших амінокисвень ідентичності між молекулами CD28, порівлот, що потрібні тільки для того, щоб підтримувати няння отриманих графіків гідрофобності показує, структуру, необхідну для забезпечення взаємодії із що, хоча і існує ряд замін амінокислот у конкретній сайтом зв'язування. амінокислотній послідовності, ці зміни часто є гоХоча існують розбіжності амінокислотних замологічніми і, очевидно, не змінюють поверхневих лишків у молекулах CD80 у примата, гризуна і кішхарактеристик даного пептиду. ки, проте зберігаються ознаки IgSF. Молекула Обміркування CD80 кішки включає кінцеві IgC-подібний домен і Рівні ідентичності нуклеотидних послідовносIgV-подібний домен, розташовані проксимально тей кішки і людини, а також кішки і миші CD80 сестосовно ділянки, асоційованої з мембраною. Як і редні, хоча рівень такої гомології не переноситься у випадку з рівнем консерватизму при порівнянні на пептид. Передбачається, що, хоча генетичний CD80 миші і кішки, рівень ідентичності константних код і є виродженим, у деяких молекулах (наприділянок вищий, ніж при порівнянні варіабельних клад, у CD28) розходження між нуклеотидними 47 77382 48 ділянок (Freeman et al., 1989). У цілому, консерватемою кішки, що є одним з найбільш розповсютизм варіабельного домену перевищує 50%, у той джених видів домашніх тварин, додасть ветериначас як цей показник для константного сегмента рії нові імпульси. перевищує 70%, при тому, що коротка ділянка аміВажливим перспективним застосуванням, пенокислот 164-198 (та сама ділянка, за яким був редбачуваним для молекули CD80 в інших видах, виділений вихідний 344-нуклеотидний фрагмент) є індукція пухлин-специфічного імунітету шляхом характеризується найбільшим рівнем ідентичності. внесення гену CD80 у трансформовані клітини з Ця центральна 56-амінокислотна ділянка (залишки наступною реінтродукцією донору з метою індукції 165-221) у складі константного домену виявляє протипухлинного імунітету, опосередкованого лі87%-вий рівень гомології між послідовностями мфоцитами CTL (Townsend & Allison, 1993). Як людини і кішки, при тому, що на 28-нуклеотидній зазначалося вище, вважається, що результатом ділянці (залишки 171-198) існує тільки одне розхоповерхневої експресії CD80 пухлинними клітинами дження. Також ця ділянка котячої послідовності є специфічна CTL-відповідь, спрямована на злоявиявляє істотний рівень гомології в порівнянні з кісну пухлину (Hodge et al., 1994). Крім того, в орвідповідними залишками поліпептиду миші. Гідроганізмі-господарі утвориться популяція клітин пафільна природа амінокислот на цій ділянці вказує м'яті, що походить від СО8-позитивних Т-клітин на високий ступінь імовірності експресії на поверх(Hodge et al., 1994). Хоча даний підхід у цілому ні клітин, а з урахуванням визначеного рівня конспрямований на протипухлинний імунітет, за анасерватизму між видами - на ймовірну участь у взалогією його також можна поширити на розвиток ємодіях «ліганд-рецептор». Було припущено, що противірусного імунітету. IgC-частина даної молекули прямо залучена в Як обговорювалося вище, довгостроковий лапрезентування єднального домену до зв'язування тентний стан синдрому придбаного імунодефіциту на рецепторі (Peach et al., 1995). Однак експерирозглядається як наслідок вихідного формування ментальним чином встановили, що для здійснення могутньої CTL-опосередкованої імунної відповіді ефективного зв'язування необхідні і константний, і на ВІЛ-інфекцію (Landay et al., 1994). Передбачаваріабельний домени (Peach et al., 1995). Конценється, що ті хворі, які протягом довгого часу не трація гомологічних залишків у IgC-ділянці позаквиявляють симптомів СНІДу після зараження ним, літинних доменів, поряд з високим рівнем диверздатні формувати і підтримувати сильний CTLгенції трансмембранного і цитоплазматичного клітинний імунітет, спрямований проти ВІЛ. доменів, розглядається як додатковий доказ ролі Хоча більшість сучасних вакцин спрямовані на CD80 як ліганду в більшому ступені, ніж фактора, формування гуморальної імунної відповіді, однак здатного виробляти сигнал. якщо вакцина здатна індукувати розвиток популяЯк і в людини, і в миші, CD80 кішки характериції mCTL, спрямованої на віруси ВІЛ і FIV, те ця зується високим рівнем глікозилування. Вуглеводпопуляція повинна забезпечувати захист, подібний неві залишки, як вважається, не беруть участь такому, який характерний для довгострокового прямо в зв'язуванні, однак можуть сприяти підвибезсимптомного СНІДу. Введення новим індивідущенню розчинності позаклітинного сегмента цієї умам «генної» вакцини, у складі якої білки FIV молекули (Peach et al., 1995). З восьми потенційоб'єднані з білком CD80, повинне приводити до них сайтів глікозилування, що виявляються в посповерхневої експресії костимуляторної молекули в лідовності пептиду людини, сім розташовані в посполученні з презентацією вірусних епітопів FIV, ложеннях, ідентичних таким у білку кішки. Сайт, забезпечуваної молекулами МНС СІ. У випадку розташований у 39-м положенні амінокислотної успіху це повинно привести до проліферації попупослідовності кішки, не відтворений у молекулі ляції FIV-специфічних лімфоцитів mCTL. Після CD80 людини, у той час як існує сайт у 232-м понаступного впливу вірулентного вірусу у вакциноложенні, відсутній у послідовності кішки (Freedman ваних індивідуумів буде відбуватися індукція відet al., 1987). У молекулі миші існує сім сайтів глікоповіді на клітини, які були інфіковані даним вірузилування, тільки два з яких знаходяться в ідентисом, знищуючи їх до того, як цей вірус буде чних положеннях, хоча в принципі вони розташоздатний розмножуватися і почне руйнувати комповані в тих же ділянках молекули, що і у молекулах ненти імунної системи. кішки і людини (Freeman et al., 1989). Подібність у Приклад 6 числі і положенні сайтів глікозилування, як можна Клоновані і секвеновані КДНК CD28 кішки вважати, відображає важливість відповідних мотиВведення вів для функціонування даної молекули. CD28 є поверхнево-клітинним глікопротеїном, Існує широке коло можливих способів застосущо у нормі експресований у виді гомодимеру, вання молекули CD80 кішки. Відповідно до обмірскладеного ідентичними субодиницями з молекукованого вище, ця молекула є ключевим елеменлярною масою 44 кда, з'єднаними дисульфідними том забезпечення точності в розвитку відповіді зв'язками. Він входить в імуноглобулінове суперсізрілих Т-клітин. Контроль експресії даного гену і на мейство і характеризується наявністю єдиної порівні РНК, і на рівні білка повинний допомогти заклітинної варіабельної (V) ділянки, трансмембвстановити шлях, за яким імунна система кішки ранного домену і короткого цитоплазматичного взаємодіє з інфекцією. З'ясування того, як ця сис«хвоста» (Aruffo & Seed, 1987). Хоча ця молекула тема впливає на конкретні патогени, з урахуванглікозильована, вуглеводневі складові, очевидно, ням даних, одержуваних при дослідженнях інших не беруть участь у зв'язуванні і приблизно забезмодельних систем, дасть новий погляд на парамепечують підвищення розчинності позаклітинного три імунної системи людини. Крім того, внесок у домену (Peach et al., 1994). кДНК, що кодує пептививчення можливостей маніпуляції імунною сисди людини, пацюка, миші і кролика і аналогічна 49 77382 50 молекула курки були раніше клоновані і секвено(Ellis et al., 1996). Таким чином, хоча в активованих вані (Linsley et al., 1995а). Т-клітинах in vitro CTLA-4 експресований на рівні CD28 виявляється в більшості тимоцитів лише 2-3% від такого в CD28, він зв'язує ліганди з CD4+/CD8+ і периферичних Т-клітин CD4+/CD8+ і більшою в 20 разів авідністю (Linsley et al., 1995). характеризується посиленням експресії у відповідь Хоча молекули CTLA-4 і CD28 еволюційно родинні і мають загальні ліганди, проте їхні функції і на стимуляцію -ΦΔ3, ФГА і ФМА і пригніченням сигнальні здібності, очевидно, диференційовані її в результаті зв'язування з антитілом до CD28 (Balazano et al., 1992). Порівняння сигнальних ді(Linsley et al., 1993b). Незабаром після відкриття лянок у складі кожної з цих молекул не відображає цього білка з'ясувалося, що CD28 відображає ваістотний рівень ідентичності: отже, ці молекули жливу роль у регуляції активації Т-клітин ініціюють різні сигнальні механізми (Hutchcroft & CD4+/CD8+ (June et al., 1990). На додаток до стиBierer, 1996). мулювання активації і проліферації Т-клітин також У той час як CD28 експресований Т-клітинах, було встановлено, що формування такого вторинщо знаходяться в стані спокою і позитивно регуного сигналу індукує цитолітичну активність CTL люється на початку відповіді на активацію, експре(Azuma et al., 1993c). сія CTLA-4 досягає піку через 48 годин після актиCD28 експресується на ранніх етапах дозрівації і повертається на вихідний рівень через 96 вання Т-клітин. У той час як незрілі CD3-негативні годин після активації (Linsley et al., 1992а). Експреклітини негативні і за CD28, проміжні клітини сія CTLA-4, як передбачається, погоджується з CD4+/CD8+ експресують цей білок на низькому негативною регуляцією CD28 (Lindsten et al., рівні, а зрілі СD3-позитивні тимоцити CD4+/CD8+ 1993). Крім того, сигнальні механізми, опосередкоекспресують CD28 на високому рівні (Turka et al., вані зв'язуванням лігандів рецептором CD28, оче1991). У людини після дозрівання даний рецептор видно, відіграють важливу роль в інтенсифікації виявляється майже у всіх Т-клітинах CD4+ і більш експресії CTLA-4 (Linsley et al., 1993а). Т-клітини, чим у половини Т-клітин CD8+ (Turka et al., 1991), а що негативні за CD28, не експресують CTLA-4 у також майже у всіх Т-лімфоцитів мишей (June et відповідь на стимуляцію ФМА або джерелом іонів al., 1990). Після активації Т-клітин поверхнева екскальцію (Lindsten et al., 1993). пресія підсилюється, у той час як зв'язування даПовна послідовність подій в опосередкованоної молекули з відповідним їй лігандом або спему CD28 сигнальному шляху поки не визначена, цифічними моноклональними антитілами хоча існує гіпотеза про склад цього каскаду процеобумовлює в активованих клітинах негативну ресів (Hutchcroft & Bierer, 1996). гуляцію даного гену і на транскрипційному, і на Було висловлене припущення про те, що сигтрансляційному рівнях (Linsley et al., 1993a). Хоча нальний механізм CD28 залучає мобілізацію внутCD28 виявляється в основному на лімфоцитах Трішньоклітинного кальцію, метаболізм фосфатиклітинних популяцій, цей білок, як повідомлялося, дилінозитолу і індукцію фосфорилування білків за виявляється в плазмацитомах кісткомозкових біозалишками тирозину (Hutchcroft & Bierer, 1996). псійних пробах (Kozber et al., 1987) і експресується Цитоплазматичний «хвіст» молекули CD28 в культурах лінії лейкозних клітин, подібних до включає визначені мотиви, для яких передбачанатуральних клітин-кілерів (Azuma et al., 1992). ється участь у внутрішньоклітинних сигнальних CD28 виявляє визначений ступінь структурної процесах після зв'язування лігандів CD80 або гомології з іншим 87-рецептором - CTLA-4: вони CD86 (June et al., 1994). Внутрішньоцитоплазматиобоє стосуються підродини в групі білків IgSF чна ділянка, яка складається з 41 амінокислот не (Linsley et al., 1995a). Ці дві молекули включають має виявленої каталітичної активності, тому що не позаклітинний IgV-домен, єдиний трансмембранвключає внутрішньоклітинних мотивів «тирозиноний домен і короткий цитоплазматичний сигнальвої активації» (як у послідовності TCR) або залишний домен (Araffo et al., 1987). Хоча сумарний ріків цистеїну, необхідних для зв'язування цитоплавень гомології між цими двома молекулами зматичних тирозинкіназ сімейства Src (June et al., складає тільки 31%, існують дві короткі ділянки і 1994). Однак деякі із сайтів потенційного глікозиспецифічні залишки, що цілком інваріантні в цих лування в складі виділених послідовностей конседвох молекулах: це відображає ймовірну важливу рвативні (Hutchcroft & Bierer, 1996). Внутрішньокліроль даних мотивів у розпізнаванні лігандів В7 і тинна каталітична, активність і міжбілкові взаємодії підтримці структурної цілісності (Leung & Linsley, часто регулюються за шляхом диференційованого 1994). Гексапептидний мотив MYPPPY зберігаєтьфосфорилування білків, хоча ферменти, які б зася у всіх виділених членів сімейства рецепторів безпечували таку активність рецептора CD28, поки CD28/CTLA-4 (Peach et al., 1994). Він картирується не визначені (Lu et al., 1992). Консенсусний мотив в CD3-подібній випетленій ділянці даних молекул; YMXM, наявний у складі цитоплазматичного домеу випадку його мутирування відбувається зниженну, є передбачуваним сайтом Src-гомології фосня авідності за зв'язуванням і у CD28, і в CTLA-4 фотизованого зв'язування (домен SH2), що визна(Peach et al., 1994). Ця ділянка, як передбачалося, чає, в свою чергу, зв'язування служить потенційним сайтом зв'язування лігандів у фосфатидилінозитол-3-кінази (кінази РІ3) (Prasad складі обох білків - CD28 і CTLA-4, однак невідомо, et al., 1995). Хоча це є лише одним з можливих або є ця ділянка прямим сайтом зв'язування лігансигнальних механізмів для участі CD28, було поду В7 або ж він представляє структурні мотиви, що казано, що активність кінази РІ3 не корелює з акнепрямим чином залучені в зв'язування (Peach et тивністю IL-2; але тому що збільшення вироблення al., 1994). Незважаючи на консерватизм залишків у IL-2 є первинним наслідком сигнальної активності послідовностях CD28 і CTLA-4, CTLA-4 зв'язує CD28, то представляється, що інші механізми CD80 і CD86 з більш високою авідністю, чим CD28 51 77382 52 впливають на активність, що обумовлюється внутXt, з яким транслюється білок, що запобігає апопрішньоклітинними сигнальними процесами (June et тозу (Radvanyi et al., 1996). al., 1994). Зв'язування на CD28, як було показано, сприХоча значення цих процесів поки цілком не рояє посиленню вироблення різних цитокінів Тзшифроване, костимуляція CD28 приводить до хелперами у відповідях і 1-го, і 2-го типів посилення вироблення цитокінів Т-клітинами. У (Lenschow et al., 1996). Також передбачається, що CD28-позитивних Т-клітинах, активованих дією ця взаємодія бере участь у формуванні конкретних антитіл до CD3 або ФГА, ати-CD28 обумовлює типів Т-хелперов. «Наївні» СD4-позитивні Тперевищення вихідного рівня РНК ряду цитокінів, лімфоцити повинні в нормі формувати фенотип включаючи IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, фактор некрозу Тh1, якщо вони активувалися під час відсутності сигнального шляху, опосередкованого зв'язуванпухлин (TNFoc), лімфотоксин, -інтерферон і факням CD28/CD80 (Lenschow et al., 1996). Це може тор гранулоцитів-моноцитів, що колоніє-стимулює, мати непряме значення у виробленні IL-4, індуко(GM-CSF), так само як і рецептор інтерлейкіну-2 ваної додаванням екзогенного IL-2, у той час як (Lenschow et al., 1996). Підвищення вихідного вміроль сигналів CD28 у виробленні IL-2 раніше вже сту мРНК обумовлюється і підвищенням рівня була підтверджена (Seder et al., 1994). Проведені транскриптів, і інтенсифікацією самої транскрипції дослідження на мишах, «виключених» за геном (Hutchcroft & Bierer, 1996). Хоча костимуляція CD28, додатково підтвердили роль цього рецептоCD28 уперше була описана в клонах СD4ра в диференціюванні клітин Th2. позитивних Т-клітин (Martin et al., 1986), зараз віМиші, що є гомозиготними нульовими мутантдомо, що CD28 бере участь в активації багатьох ними за CD28, були отримані Шахиняном зі співтипів клітин. Костимуляція цього механізму, як буавторами з метою встановлення того, як тварина ло показано, регулює в субпопуляціях «наївних» Тадаптується до інфекції під час відсутності втоклітин CD4+ вироблення -інтерферону, цитокінів ринного сигналу, генерованого CD28 (Shahinian et Th1-відповіді і вироблення IL-4, що є цитокіном al., 1993). Цей ген був зруйнований в ембріональTh2-відповіді (Seder et al., 1994). Костимуляторний них стовбурних клітинах шляхом часткового замімеханізм за участю CD28 також важливий для щення другого екзону геном резистентності до активації CTL CD8+, хоча, очевидно, він не є необнеоміцину (Shahinian et al., 1993). Було показано, хідним для ефекторної фази знищення клітин за що миші, гомозиготні за «виключеним» геном, не участю CTL (Hodge et al., 1994). Цікаво, що CD28 експресують CD28 на своїх Т-клітинах, у той час як також приблизно відівідображає роль у процесах гетерозиготні особини CD28 (-/+), як було встановВІЛ-інфекції. У культивованих лімфоцитах, що полено, характеризуються зниженою поверхневою ходять від деяких пацієнтів з позитивною реакцією експресією цього рецептора (Shahinian et al., на СНІД, зв'язування CD28 з моноклональним ан1993). Стимуляція мітогеном Т-клітин, похідних від титілом може підсилювати розмноження вірусу ВІЛ гомозиготних «виключених» за CD28 мишей, пос(Asjo et al., 1993). лабляє проліферацію Т-клітин і вироблення цитоУ приматів і гризунів вторинний сигнал, утвокінів, що може бути лише частково відновлено рений у результаті зв'язування CD80 з CD28, чітко дією екзогенного IL-2 (Shahinian et al., 1993). Було вказує на його роль у вихідній активації Т-клітин показано, що високоочищені Т-клітини не активу(Aruffo & Seed, 1987). Недавно отримані дані, одються пектинами під час відсутності клітин АРС нак, дозволяють припустити, що основний наслі(Unanue, 1984). На матеріалі названому «виклюдок такої взаємодії може бути спрямований на ченою» лінією було показано, що взаємодія забезпечення проліферації за рахунок пригнічення CD28/CD80 необхідна для прояву мітогенної актиапоптозу (Lenschow et al., 1996). Т-клітини, які знавності Т-клітинних лектинів (Shahinian et al., 1993). ходяться в стані спокою і в Go-фазі росту, можуть Також було виявлено, що дана взаємодія є важлиактивуватися шляхом утворення комплексу TCR, вим для опосередкування переключення ізотипів однак вони не здатні проліферувати або секретуВ-клітин у відповідь надію антигену (Shahinian et вати IL-2 під час відсутності, зв'язування CD28: al., 1993). На відміну від «виключених» за CD80 такий ефект називають анергією (Linsley et al., мишей, функціональна роль CD28 може бути 1991а). Зрілі Т-клітини можуть активуватися винявстановлена із застосуванням генноінженерної тково за зв'язуванням TCR з молекулами МНС на технології «вимикання генів». Про мишей, «виклюповерхні клітин АРС, однак це в кінцевому рахунку чених» за геном CTLA-4, поки не повідомлялося, приводить до активації індукованої клітинної загиоднак миші, понадекспресуючі CTLA-4 Ig, уже були белі, тобто до апоптозу (Radvanyi et al., 1996). Ходосліджені (Lane et al., 1994). Як і передбачалося, ча інші вторинні взаємодії (наприклад, костимуляфенотипічні характеристики цієї лінії мишей подібція ІСАМ-1) можуть формувати допоміжні сигнали них до ознак ліній, дефіцитних за CD28 (Lane et al., до проліферації, передбачається, що CD281994). Хоча ізольовані Т-клітини виробляють норопосередкована костимуляція є унікальним мехамальну кількість γ-інтерферону, після стимуляції нізмом, що запобігає наступному виникненню кловиявляється істотно менша кількість IL-4 нільної анергії і апоптозу (Linsley et al., 1993a). (Ronchese et al., 1994). Це приводить до нездатноБуло показано, що CD28 може брати участь у ресті В-клітин ініціювати або підтримувати точну гугуляції генів, для яких відома залученість у захисті моральну імунну відповідь (Ronschese et al., 1994). Т-лімфоцитів від апоптозу (Boise et al., 1995). ПосХоча відомі різні передбачувані шляхи диферентійне посилення експресії bcl-Xt було виявлене в ціювання Тh1 і Th2, взаємодія CD28/B7 чітко вплиТ-клітинах, костимульованих зв'язуванням на реває на диференціювання підгруп Т-лімфоцитів. цепторі CD28 (Boise et al., 1995). Вважається, що Стабілізація мРНК інтерлейкіну-2 може відігкостимуляція CD28 може стабілізувати мРНК bcl 53 77382 54 равати ключову роль у зв'язуванні на CD28, однак ристовуючи як 3'-праймери оліго-dT. РНК і оліго-dT деякі інші цитокіни, як було показано, прямо або нагрівали до 75°C на 3 хвилини для видалення опосредковано впливають на цю взаємодію вторинних структур. Потім додавали ОТ, dNTP, (Linsley et al., 1991а). Медіатори запалення IL-Itt, буфер і дистильовану воду і отриману суміш інкубували протягом 1 години при 42°С. Після інкубації IL-6 і TNF виробляються популяціями Т-клітин зразок нагрівали до 95°С на 5 хвилин з метою інпам'яті у відповідь на сигнал молекул CD28, у той активації ОН. Вироджені праймери, похідні від час як у популяціях «наївних» клітин виробляється консенсусних сегментів, знайдених в опубліковатільки IL-la (Cerdan et al., 1991; van Kooten et al., них нуклеотидних послідовностях CD28 людини, 1991). Експресія IL-4 також регулюється за участю миші і кролика (GenBank, Bethesda, MD), потім сигнального механізму CD28 (Seder et al., 1994). використовували для вихідної ампліфікації 673Також зазначена взаємодія забезпечує позитивну нуклеотидного фрагмента кодуючого велику часрегуляцію IL-5, IL-10 і IL-13, що є важливими медітину відкритої рамки: аторами гуморальної відповіді (de Waal Malefyt et CD28-113: САА ССТ TAG CTG CAA GTA CAC al., 1993; Minty et al., 1993). Крім того, фактори, що (SEQ ID NO: 70) колоніє-стимулюють, і фактори росту, включаючи CD28-768: GGC TTC TGG ATA GGG ATA GG GM-CSF, CSF-1 і IL-3, і хемотаксичні фактори, (SEQ ID NO: 71). включаючи IL-8, позитивно регулюються за участю Метод ПЛР «з гарячим стартом» на основі висигналу, генерованного рецептором CD28 (Harlan користання Taq-полімерази застосовували для et al., 1995). ампліфікації продукту (5 хвилин при 95°С - 1 цикл; З врахуванням того, що вище зазначалося 30 секунд при 95°С, 30 секунд при 48°С і 45 секунд ймовірне використання CD80 в індукції протипухпри 72°С - 30 циклів; 7 хвилин при 72°С - 1 цикл). линного імунітету, існує ряд інших потенційних Потім отриманий фрагмент візуалізували в 1%способів клінічного застосування CD28 і CD80. вому агарозному гелі і лігували до складу клонуюЗапобігання взаємодії між CD28 і CD80, як було чого вектора ТА (InVitrogen, San Diego, СА) і секпоказано в модельній системі гризунів, сприяє венували відповідно до описаного вище. На основі профілактиці або лікуванню ряду аутоімунних запослідовності кДНК були отримані специфічні 3'хворювань, профілактиці відторгнення органів або праймери, що синтезували для використання в прояву реакції «трансплантат проти господаря», а методі 5'-RACE: також профілактиці секреції цитокінів, асоційоваCD28-190: CGG AGG TAG ААТ TGC ACT GTC ної із сепсисом (Harlan et al., 1995; Nickoloff et al., С (SEQ ID NO: 72) 1993; Thomas et al., 1994; Zhou et al., 1994). ДодаCD28-239: ATT TTG CAG AAG TAA ATA TCC вання CTLA-4 Ig з метою блокування взаємодії (SEQ ID NO: 73). CD28/CD80 у мишей може запобігати симптомам Виділення 5'-сегмента вовчаночного типу в мишей лінії NZB/NZW і частМодифікований за GIBCO протокол методу 5'ково захищати від летального ЕАЕ і від летальноRACE (Gibco BRL, Gaithersburg, MD) використовуго нефриту в пацюків (Harlan et al., 1995). Хоча вали для одержання 57-послідовності молекули, даний імунотерапевтичний підхід у відношенні що залишилася, CD28 кішки. РНК екстрагували з аутоімунних захворювань для людини поки не заРВМС, простимульованих протягом 16 годин Констосовувався, було встановлено, що в медичній А. Зворотний ген-специфічний праймер викориспрактиці при біопсіях у пацієнтів із псоріазом і ретовували для синтезу першого ланцюга кДНК. РНК вматоїдним артритом виявляється експресія і цей праймер нагрівали до 75°С на 5 хвилин з CD80, у той час як у нормальних біопсійних пробах наступним додаванням інших ОТ-реагентів. Після така експресія відсутня (Nickoloff et al., 1993; денатурації отриману суміш охолоджували до 4°C Thomas et al., 1994). При пересадженнях кістковоі додавали реакційний буфер, хлорид магнію, го мозку і органів у мишей і в модельних експериdNTP, дитіотреїтол і зворотну транскриптазу ментах на людині in vitro додавання CTLA-4 Ig і Superscript (Gibco BRL, Gaithersburg, MD). Суміш з запобігання взаємодії CD28/B7 може обумовлюваОТ інкубували при 42°С на протязі 30 хвилин і поти принаймні частковий захист від відторгнення тім нагрівали до 70°С на протязі 15 хвилин з меоргану, прояву реакції «ТПХ» або індукцію антитою денатурації ОТ. Потім додавали РНКазну суген-специфічної стійкості (Harlan et al., 1995). Наміш і реакцію інкубували при 55°С на протязі 10 решті, секреція цитокінів і прояв сепсису, що може хвилин, з метою видалення залишків РНК і запобіприводити до зараження крові і септичного шоку, гання неправильного добудування за участю терможуть бути відвернені в мишей шляхом прижитмінальної трансферази (Td). Потім кДНК очищали тєвого введення CTLA-4 Ig (Zhou et al., 1994). Маз використанням центрифужної колонки GlassMax ніпуляції взаємодією CD28/CD80 дозволяють гли(Gibco BRL, Gaithersburg, MD) з метою видалення бше зрозуміти процеси Т-клітинної костимуляції і не включавшихся нуклеотидів і праймера. Потім дозволяють наблизитися до вирішення різних проочищену кДНК, елуйовану з даної колонки, замиблем. кали за допомогою Td. Td використовували для Матеріали і методи додавання 20-30-нуклеотидного дезоксицитидиноВиділення вихідного фрагмента CD28 вого «хвоста» до кДНК. Цей фермент додавали до мРНК екстрагували з лімфоцитів периферичсуміші очищеної кДНК, хлориду магнію, реакційноної крові тварини НК5, простимульованих протяго буфера і dCTP після 3-хвилинної денатурації гом 16 годин Кон-А, з використанням реагенту для кДНК при 95°С. Реакцію інкубували при 37°С на РНК-екстракції RNAzol (Biotexc, Houston, ТХ). В протязі 10 хвилин і фермент потім інактивували завершення кДНК синтезували на матриці виділенагріванням до 70°С на протязі ще 10 хвилин. ної РНК з зворотною транскриптазою (ОТ), вико 55 77382 56 кДНК із приєднаним«хвостом» ампліфікували з нуклеотидів. Цей вихідний фрагмент послідовності використанням Taq-полімерази в реакції ПЛР із виявляв 86%-вий рівень гомології з аналогічною «гарячим стартом» (5 хвилин при 95°С; 30 секунд ділянкою послідовності людини, 86%-вий рівень при 95°С, 30 секунд при 55°С і 45 секунд при 72°С гомології з кДНК кролика і 79%-вий рівень гомоло- 35 циклів; 72°С на протязі 7 хвилин). Праймерагії з кодуючою послідовністю миші. ми для цієї реакції були зворотний праймер, відпоСтарт-кодон ATG і додаткові 110 нуклеотидів, відний 5'- ділянці праймера для синтезу кДНК, і а також деякі 5'-фланкуючі послідовності були виякірний праймер, специфічний для dC-лінкера і ділені з застосуванням методу 5'-RACE (Gibco, який складається, в основному, з залишків dG і Gaithersburg, MA). У реакції «приєднання хвоста» невеликого числа dl. 1мкл цієї реакції розбавляли використовували кДНК, отриману на матеріалі додаванням 50мкл води і 5мкл отриманої суміші РНК клітин РВМС кішки ЕК6, простимульованих потім використовували для «гніздової» ПЛР (5 Кон-А. На цьому матеріалі в результаті ампліфікахвилин при 95°С - 1 цикл; 30 секунд при 95°С, 30 ції з праймером CD28-786 і якірним праймером dG секунд при 55°С і 45 секунд при 72°С - 30 циклів; з одержали невеликий розрізняльний матеріал. химерною полімеразою KlenTaq) з якірним прямим Хоча не було виявлено помітних бендів при праймером dG/dl і додатковим верхнім «гніздоампліфікації з комбінацією праймерів dG/CD28вим» ген-специфічним зворотнім праймером. 786, розведену кДНК із цієї реакції ампліфікували з 30мкл «гніздової» реакції потім візуалізовали в використанням «гніздових» праймерів для CD28 1,5%-вому агарозному гелі і точний фрагмент виріCD28-182 і CD28-239. Виразний бенд був присутзавали з гелю. кДНК очищали відповідно до опиній в області приблизно 600 пар нуклеотидів. Цей саного вище з використанням гель-розпилювача продукт виділили з агарозного гелю і секвенували Amicon і фільтра Micropure (Amicon, Beverly, MA) . з підтвердженням наявності в ньому 5'-фрагмента, Очищений зразок кДНК секвенували методом секвключаючи старт-кодон і фланкуючу послідовність венування з кінцевою флуоресцентною міткою за його межами. (Perkin Elmer, Norwalk, CN) . На матеріалі заверНа основі нуклеотидної послідовності цих прошених фрагментів визначили консенсусну послідуктів був сформований прямий праймер, що довність. На основі цієї послідовності була синтевключав старт-кодон. Цей праймер у сполученні з зована пара праймерів, що відповідали 3'-конструкцією використовували для ампліфікації повнорозмірній кодуючій рамці гену CD28 кішки: кДНК з екстрактів РНК клітин РВМС, взятих у тваПрямий feCD28: CGC GGA ТСС АСС GGT рин ЕК6 і ED3 і простимульованих Кон-А, і одерAGC АСА ATG АТС СТС AGG (SEQ ID NO: 13) жали 754-нуклеотидний фрагмент. Зворотний feCD28: CGC GGA ТСС TCT GGA Принаймні два продукти від кожної тварини TAG GGG ТСС ATG TCA G (SEQ ID NO: 14). секвенували повністю і кожен нуклеотид перевіряЗ використанням цих праймерів молекулу ли і підтверджували принаймні за трьома незалекДНК, що включає повнорозмірну кодуючу ділянку, жним точно ліченими послідовностями. Після цьоампліфікували на матеріалі кДНК, синтезованої на го повнорозмірний продукт секвенували зі складу РНК із РВМС, узятих у тварин ЕК6 і ED3 і простиклонуючого вектора ТА з метою підтвердження мульованих Кон-А. Ця похідна від РВМС кДНК буточності і відтворюваності отриманого продукту. ла отримана раніше і, як було встановлено, вклюВ остаточному 685-нуклеотидному фрагменті, чала РНК, що відповідає даному гену. У даної ПЛР що складає повну відкриту рамку, старт-кодон ATG (5 хвилин при 95°С - 1 цикл; 30 секунд при 95°С, знаходиться в положенні 1, стоп-кодон - у поло30 секунд при 42°С і 45 секунд при 72°С - 30 цикженні 664-666, а ще 19 нуклеотидів складають З'лів; 72°С на протязі 7 хвилин) використовували UTR. Як і у випадку з молекулою CD80 кішки, поДНК-полімеразу KlenTaq, що запобігає випадковим ложення старт-кодону ATG підтвердили за парапомилкам, що звичайно супроводжується при виметрами секвенування продуктів реакції 5'-RACE користанні Taq-полімерази, і в результаті одержа(дані не включені). ли 754-нуклеотидний фрагмент, що клонували до Ген CD28 кішки, будучи секвенованим, виявив складу клонуючого вектора ТА і секвенували віднайбільший рівень сумарної ідентичності з посліповідно до описаного раніше. Як і у випадку з модовностями кролика і людини. Гомологія з кДНК лекулою CD80, кожен нуклеотид підтверджували також була значна, хоча ідентичність з послідовніпринаймні за трьома незалежно отриманими посстю курки виражалася в меншому ступені і була лідовностями. порівняна з рівнями подібності ініиих генів, порівРезультати нюваних у курки і ссавців (таблиця 2). Вироджені праймери, обрані за параметрами консенсусних ділянок послідовностей кДНК CD28 Таблиця 2 мишей, людини і кролика, використовували в ПЛР з успішним одержанням продукту, що охоплює Порівняння послідовностей CD28 практично всю кодуючу послідовність кішки. Закішки і CD28 миші, людини, курки і кролика вдяки більш високому ступеню консерватизму, властивого молекулі CD28, у результаті вихідної Відсоток гомології з послідовністю кішки Вид ампліфікації з використанням даних вироджених Амінокислотна Нуклеотидна праймерів одержали віртуально повнорозмірну Людина 85% 82% молекулу. На відміну від молекули CD80 кішки, у Миша 77% 74% якій спочатку був отриманий тільки невеликий Кролик 84% 84% центральний фрагмент, у кодуючій рамці, кДНК Курка 59% 50% CD28 не «вистачало» лише 113 «крайніх» 5' 57 77382 58 Амінокислотна послідовність була розшифрокожної з цих молекул вказує на середній рівень вана за нуклеотидною послідовністю відповідно до гомології ділянок позаклітинного домену, що прибописаного вище. Величини ідентичності розшифлизно залучений у зв'язування ліганду, а також рованої амінокислотної послідовності з іншими внутрішньоклітинних ділянок, що приблизно беопублікованими послідовностями виявилися поріруть участь у формуванні внутрішньоклітинних внянні з ідентичністю на рівні нуклеотидних послісигналів. У цілому, найвищий рівень гомології видовностей. Сигнальний сегмент пептиду простиявляється в ділянці, що оточує передбачуваний рається від старт-залишку метіоніну до 19-ої сайт зв'язування ліганду - MYPPPY, - розташоваамінокислоти. Представляється, що, як і в інших ний у складі IgV-подібного домену поліпептиду клонованих поліпептидах CD28, у молекулі кішки кішки, амінокислоти 118-123. єдиний позаклітинний варіабельний імуноглобуліПередбачуваний сигнальний сегмент відповіноподібний домен приходиться на залишки 19-153. дає ділянці від початкового метіоніну до 19-го заГідрофобний трансмембранний домен займає налишку (Aruffo et al., 1987). Мономер CD28 складеступні 27 залишки, а ще 41 амінокислота складаний єдиним позаклітинним варіабельним ють цитоплазматичний «хвіст». Як і молекула імуноглобуліно-подібним доменом, займаючим CD28 людини, поліпептид кішки включає п'ять сайамінокислоти 19-153 (Aruffo et al., 1987). Гідрофотів потенційного N-глікозилування. бний трансмембранний домен приходиться на Порівняння розшифрованої амінокислотної наступні 27 залишки, після якого розташований 41послідовності білків CD28 кішки і людини показало амінокислотний цитоплазматичний домен (Aruffo наявність ділянок гомології при деяких розходженet al., 1987). Білок кішки включає 5 сайтів потеннях. Більшість змін приходяться на трансмембційного N-глікозилування в ідентичних положеннях ранний домен, сигнальний сегмент і N-кінцевий стосовно того, що було знайдено в поліпептиді домен. Найвищий рівень гомології характерний людини. Цікаво, що сайтом глікозилування, що для центрального IgV-подібного домену і для цизнаходиться в залишку 105 білка кішки, є мотив топлазматичного «хвоста». NQS, у той час як у послідовності людини він Порівняння молекули CD28 кішки з розшифNQT. Така амінокислотна дивергенція додатково рованими амінокислотними послідовностями члепідтверджує те, що, незважаючи на наявність змін нів сімейства CD28/CTLA-4 людини і миші показау послідовностях, їх загальні структурні характерило, що, хоча загальний рівень гомології членів цієї стики зберігаються. групи білків складає лише 25%, зберігаються спеЯк можна було очікувати виходячи з рівнів гоцифічні ділянки і амінокислоти Мотив MYPPPY мології, що виявляються цими білками, порівняння зберігається в всіх членів цієї групи. В послідовнографіків гідрофільності CD28 кішки і людини покасті кішки передбачається наявність додаткових зує, що ці молекули характеризуються в принципі залишків, важливих для забезпечення структурної подібними конформаційними параметрами. Однак цілісності, включаючи ряд консервативних залиштакож зрозуміло, що у випадку заміни амінокислоків цистеїну. ти результуючі зміни виявляються гомологічними. Цитоплазматичний домен у молекулі CD28 хаПри тому, що трансмембранний домен є областю рактеризується консерватизмом середнього студаної молекули, що характеризується найменшим пеня в порівнянні з іншими опублікованими послірівнем консерватизму при простому збереженні довностями, особливо послідовностями ссавців. ним властивості гідрофобності, цитоплазматичний Передбачається, що різні внутрішньоклітинні сигдомен молекули CD28 кішки в порівнянні з іншими нальні механізми опосередковуються перехресним опублікованими послідовностями консервативний зв'язуванням позаклітинного сегмента даного реу середньому ступені. Передбачається існування цептора (Hutchcroft & Bierer, 1995). ряду внутрішньоклітинних сигнальних механізмів, Графіки гідрофільності розшифрованої аміноопосередкованих зв'язуванням на даному рецепкислотної послідовності CD28 кішки при порівнянні торі, і, хоча внутрішньоклітинний сегмент поліпепз такими ж графіками поліпептиду людини додаттиду CD28 не має власної каталітичної активності, ково показують імовірність того, що кожен з цих проте зв'язування ним ліганду обумовлює активабілків характеризується подібною структурою. Одцію внутрішньоклітинних ефекторних молекул нак, при наявності замін амінокислот це, очевидно, (Aruffo et al., 1987). Існує чотири консервативних не приводить до істотних змін гідрофільності даної залишки тирозину (положення 173, 188, 191 і 200), молекули: це відображає в основному гомологічну для яких передбачалося їх фосфорилування (Lu et природу таких замін амінокислот. Потрібно відміal., 1992). З іншого боку, мотив MNM, що починатити, що дуже високий рівень подібності профілів ється з 193 амінокислоти молекули кішки, розглягідрофільності характеризує трансмембранні додається як сайт домену SH2 у білках людини і мимени пептидів кішки і людини, що характеризуютьші (Prasad et al., 1995). Потенційний сайт ся лише 75%-вим рівнем гомології. фосфорилування за участю протеїнкінази-С залиОбґрунтування шається в залишку серину-185, у той час як треоУсі послідовності клонованих молекул CD28 нін-202 може бути мішенню для атаки пролінвиявляють середній рівень еволюційного консерорієнтованої активності серин-треонінових протеїватизму. Можна припустити, що участь цієї моленкіназ Erk1 або Erk2 (Hutchcroft & Bierer, 1996). Як кули в активації і опосередкуванні Т-клітинного зазначалося вище, сигнальна функція рецептора імунітету має місце в різних вищих хребетних тваCD28 є різноманітною, тому зовсім не дивно те, рин - від курячих птахів «через» гризунів і хижих що його цитоплазматичний домен включає трохи ссавців до вищих приматів. потенційних сайтів атаки для сигнальних медіаПорівняння амінокислотних послідовностей торів. 59 77382 60 Майбутнє використання молекули CD28 кішки чними позаклітинними доменами, що дозволило повинне включати розробку способів виявлення визначити деякі принципи структури родинних моповерхневої експресії цього рецептора і контролю лекул сімейства IgSF (Linsley et al., 1995a). експресії CD28 після зараження вірусом, таким як Як зазначалося вище, CD80 і CD86 виявляють FIV. Якщо такий спосіб може бути об'єднаний із подібні активності за зв'язуванням на рецепторах вже існуючими способами виявлення мРНК, то CD28 і CTLA-4. Однак CD28 є менш афінним реможе бути отримана цінна інформація про рівень цептором для цих лігандів, у той час як CTLA-4 експресії в процесі інфікування. Наступний зв'язок більш афінний стосовно обох цих молекул (Linsley параметрів експресії CD28 у ході хронічної FIVet al., 1994a). Хоча ймовірний механізм відомий, інфекції дозволить розглядати організм кішки як поки не зрозуміло, як низькоафінний рецептор, що репрезентативну модель ВІЛ-інфекції людини, що характеризується високою швидкістю відщеплення дозволить дати більш точні дані про інфекційні ліганду, що характерно для CD28, здатний забезпроцеси в обох видах організмів. печувати необхідний костимуляторний сигнал у Приклад 7 диференціюванні Т-клітин (Linsley et al., 1995a). Експресія білків CD28/CD80 Передбачається, що зв'язування CD80 на CD28 на Введення поверхні Т-клітин може сприяти олігомеризації При тому, що зв'язки в імунній системі за біданого рецептора, що і забезпечує ефективність льшою частиною опосередковані «розчинними» зв'язування і вироблення сигналу (Linsley et al., (немембранними) факторами, ініціація первинної 1995a). Було показано, що CD28 рівномірно розТ-клітинної відповіді в приматів і гризунів, як було поділений на поверхні активованих Т-клітин: тобто встановлено, залежить від безпосереднього міжкприблизно ці молекули переміщаються на мемлітинного контакту (Mescher, 1992). Спочатку ввабрану після завантаження Т-клітини (Damie et al., жалося, що така взаємодія містить у собі лише 1994). Висока концентрація олігомеризованного взаємодію між TCR на поверхні Т-клітини і молеCD28 буде сприяти реасоціюванню вільних CD28 в кулою МНС на поверхні антиген-презентуючої кліобласті міжклітинного контакту і тим самим забезтини, однак потім стало зрозуміло, що зв'язування печувати генерування сигналу, незважаючи на між допоміжними молекулами також необхідне для швидке відщеплення ліганду (Linsley et al., 1995a). повної активації Т-клітини (Schwartz, 1992). Як обТакий процес, названий «взаємним кепіруванням», говорювалося вище, був отриманий доказ взаємохоча прямо і не встановлений при взаємодії дії між білками CD28 і CD80, як медіаторами такоCD28/CD80, був підтверджений для інших рецепго допоміжного сигналу (Linsley et al., 1991a). торів, для яких необхідний схожий ініціюючий міжБагато з важливих рецепторів і лігандів у хреклітинний контакт (Singer, 1992). бетних тварин стосуються суперсімейства імуногХоча, як було показано, взаємодія CD28/CD80 лобулінів (Springer, 1990). Ці молекули характериє ключовим у розвитку Т-клітинної імунної відповізуються присутністю імуноглобуліно-подібної ді, дотепер залишаються питання в з'ясуванні точділянки - звичайно в позаклітинній частині даної ного механізму даного сигнального механізму молекули (Buck, 1992). Хоча рівні консерватизму (Linsley et al., 1993a). Існування двох рецепторів і неоднакові, часто він обмежений саме тими залидвох лігандів у даній взаємодії піднімає питання шками, що забезпечують просторове укладання про роль кожного з них в активації Т-клітин (Linsley білка за імуноглобуліновим типом (Веаіе, 1985). et al., 1992b). Хоча рецептор CTLA-4 виявляє Характеристикою Ig-домену є наявність двох тісно більш сильне зв'язування, він експресується набавзаємодіючих антипаралельних β-ланцюгів, зв'ягато пізніше події активації, і хоча сигнальні мехазаних петлею, що забезпечує консервативну топонізми зв'язувалися з CD28, так і не було визначелогію (Williams & Barclay, 1988). Хоча існують загано, чи генерується сигнал після зв'язування льні ознаки структури членів даного сімейства, ліганду на рецепторі CTLA-4 (Linsley et al., 1995a). існує розмаїття у параметрах зв'язування і сигнаМатеріали і методи льних властивостях у окремих представників даноОдержання вставок го сімейства (Andersen et al., 1988). Наступні праймери використовували для ампБудучи членами сімейства IgSF, і CD28, і ліфікації повнорозмірної рамки генів, що кодує, CD80 деякою мірою подібні за структурою своїх CD28 і CD80 кішки для вбудовування його в експозаклітинних доменів. У CD28 існує єдиний Vпресуючі вектори: подібний домен, хоча він і експресований у виді Прямий feCD80: CGC GGA ТСС GCA CCA гетеродимеру, зв'язаного дисульфідними «місткаTGG GTC ACG CAG CAA AGT GGA ААА С (SEQ ID ми» (Aruffo et al., 1987). Позаклітинна ділянка моNO: 11) лекули CD80, однак, включає і V-, і С-подібні імуfeCDSO-960: CCT AGT AGA GAA GAG СТА ноглобулінові домени і експресується як мономер AAG AGG С (SEQ ID NO: 12) (Freedman et al., 1989). Оскільки члени сімейства Прямий feCD28: CGC GGA TCC ACC GGT IgSF характеризуються загальними структурними AGC АСА ATG АТС CTC AGG (SEQ ID NO: 13) параметрами, принаймні в обмеженому ступені Зворотний feCD28: CGC GGA TCC TCT GGA можна переносити деякі шаблони просторової TAG GGG TCC ATG TCA G (SEQ ID NO: 14). структури на родинні молекули, що кристалізувати Прямий праймер для CD80 і обидва праймери не вдається (Bajorath et al., 1993). Хоча кристалідля CD28 були сконструйовані з включенням зація ні CD28, ні CD80 не була здійснена, методаBamHI-сайтів і придатними лінкерами з метою поми рентгенографічної кристалографії були дослілегшення вбудовування за множинними сайтами джені молекули CD2 (Driscoll et al., 1991) і CD8 клонування. 3'-Розташований BamHI-сайт вносили (Leathy et al., 1992), що характеризуються аналогів послідовність CD80 шляхом розщеплення кло