Композиції, які містять ліпазу, протеазу і амілазу, призначені для лікування недостатності підшлункової залози

1. Композиція, яка включає ліпазу, протеазу і амілазу, причому співвідношення ліпази, протеази і амілази у вказаній композиції становить приблизно 1:1:0,15 одиниць USP. 2. Композиція за п. 1, де ліпаза присутня у формі кристалів зшитої ліпази. 3. Композиція за п. 2, де кристали ліпази піддані зшиванню мультифункціональним зшивальним агентом. 4. Композиція за п. 3, де мультифункціональний зшивальний агент являє собою біс(сульфосукцинімідил)суберат. 5. Композиція за п. 1, де протеаза присутня у формі кристалів протеази. 6. Композиція за п. 1, де амілаза присутня у формі аморфної амілази. 7. Композиція за п. 1, де ліпаза являє собою мікробну ліпазу, протеаза являє собою мікробну протеазу і амілаза являє собою мікробну амілазу. 2 (19) 1 3 91521 4 (а) інкубують ліпазу з п-нітрофенілацетатом в 0, 2 надходження в організм вказаного ссавця приблим Tris; зно 100000 одиниць USP ліпази, приблизно (b) видаляють ліпазу центрифугуванням; 100000 одиниць USP протеази і приблизно 15000 (с) вимірюють поглинання при 400 нм. одиниць USP амілази. 22. Застосування композиції за п. 1 для виготов31. Застосування за п. 28, де терапевтично ефеклення лікарського засобу для тивна кількість вказаної композиції забезпечує лікування порушення всмоктування у ссавця, що надходження в організм вказаного ссавця прибливключає стадію введення вказаному ссавцю теразно від 25000 до 100000 одиниць USP ліпази, певтично ефективної кількості композиції за п. 1. приблизно від 25000 до 100000 одиниць USP про23. Застосування за п. 22, де терапевтично ефектеази і приблизно від 3750 до 15000 одиниць USP тивна кількість вказаної композиції забезпечує амілази. надходження в організм вказаного ссавця прибли32. Застосування за п. 28, де композицію вводять зно 25000 одиниць USP ліпази, приблизно 25000 вказаному ссавцеві з кожним прийомом їжі або одиниць USP протеази і приблизно 3750 одиниць закускою. USP амілази. 33. Застосування композиції за п. 1 для виготов24. Застосування за п. 22, де терапевтично ефеклення лікарського засобу для збільшення коефіцітивна кількість вказаної композиції забезпечує єнта поглинання жиру та коефіцієнта поглинання надходження в організм вказаного ссавця приблиазоту у ссавця, що включає стадію введення вказно 100000 одиниць USP ліпази, приблизно заному ссавцеві терапевтично ефективної кількос100000 одиниць USP протеази і приблизно 15000 ті композиції за п. 1. одиниць USP амілази. 34. Застосування за п. 33, де терапевтично ефек25. Застосування за п. 22, де терапевтично ефективна кількість вказаної композиції забезпечує тивна кількість вказаної композиції забезпечує надходження в організм вказаного ссавця приблинадходження в організм вказаного ссавця приблизно 25000 одиниць USP ліпази, приблизно 25000 зно від 25000 до 100000 одиниць USP ліпази, одиниць USP протеази і приблизно 3750 одиниць приблизно від 25000 до 100000 одиниць USP проUSP амілази. теази і приблизно від 3750 до 15000 одиниць USP 35. Застосування за п. 33, де терапевтично ефекамілази. тивна кількість вказаної композиції забезпечує 26. Застосування за п. 22, де ссавець страждає надходження в організм вказаного ссавця прибликістозним фіброзом. зно 100000 одиниць USP ліпази, приблизно 27. Застосування за п. 22, де композицію вводять 100000 одиниць USP протеази і приблизно 15000 вказаному ссавцеві з кожним прийомом їжі або одиниць USP амілази. закускою. 36. Застосування за п. 33, де терапевтично ефек28. Застосування композиції за п. 1 для виготовтивна кількість вказаної композиції забезпечує лення лікарського засобу для надходження в організм ссавця приблизно від лікування недостатності підшлункової залози у 25000 до 100000 одиниць USP ліпази, приблизно ссавця, що включає стадію введення вказаному від 25000 до 100000 одиниць USP протеази і приссавцеві терапевтично ефективної кількості комблизно від 3750 до 15000 одиниць USP амілази. позиції за п. 1. 37. Застосування за п. 33, де композицію вводять 29. Застосування за п. 28, де терапевтично ефеквказаному ссавцеві з кожним прийомом їжі або тивна кількість вказаної композиції забезпечує закускою. надходження в організм вказаного ссавця прибли38. Застосування за п. 33, де коефіцієнт поглинанзно 25000 одиниць USP ліпази, приблизно 25000 ня жиру та коефіцієнт поглинання азоту збільшуодиниць USP протеази і приблизно 3750 одиниць ється у вказаних ссавців на одну і ту саму величиUSP амілази. ну. 30. Застосування за п. 28, де терапевтично ефективна кількість вказаної композиції забезпечує Перехресні посилання на родинні заявки Дана заявка згідно з 35 U.S.C. § 119(е) претендує на пріоритет попередньої заявки на патент Сполучених Штатів № 60/618764, поданої 14 жовтня 2004, зміст якої включений в дану заявку за допомогою посилання. Галузь техніки, до якої належить винахід Даний винахід належить до композицій, які призначені для лікування станів, що включають недостатність підшлункової залози. Композиції за даним винаходом містять ліпазу, протеазу і амілазу у визначених співвідношеннях, що забезпечує сприятливі результати у пацієнтів, як, наприклад, у пацієнтів, які страждають недостатністю підшлункової залози. Крім того, даний винахід належить до способів застосування таких композицій для лікування недостатності підшлункової залози. Рівень техніки Травлення являє собою фізіологічний процес, за допомогою якого їжа, що поступила в організм, розщеплюється на поживні компоненти, які легко всмоктуються. Після проковтування їжа проходить через різні сегменти шлунково-кишкового тракту, і при цьому здійснюється травлення, насамперед, під дією травних ферментів. Три групи травних ферментів, які важливі для цього процесу, включають ліпази (для перетравлювання жиру), протеази (для перетравлювання білків) і амілази (для перетравлювання вуглеводів). 5 91521 6 Перетравлювання їжі і поглинання поживних травлення і всмоктування у пацієнтів з кістозним компонентів здійснюється в тонкому кишечнику. фіброзом веде до недостатності живлення, нездаТам проковтнута їжа розщеплюється під дією тратності набирати або зберігати масу тіла і зменвних ферментів для легкого всмоктування. Більша шення росту, а також до погіршення перебігу хрочастина травних ферментів секретується підшлуннічних гнійних легеневих захворювань. [K. Gaskin ковою залозою і попадає в тонку кишку через проet al., "Improved Respiratory Prognosis in CF Patients току підшлункової залози. with Normal Fat Absorption", J. Pediatr., 100, pp. 857Підшлункова залоза виробляє велику кількість 862 (1982); J.M. Littlewood et al., "Control of екзокринних і ендокринних діючих речовин, необMalabsorption in Cystic Fibrosis", Paediatr. Drugs, 2, хідних для належного травлення, живлення і меpp. 205-222 (2000)]. таболізму. Екзокринна діяльність підшлункової У цей час стандартна терапія недостатності залози включає секрецію білків, які діють як ферпідшлункової залози заснована, передусім, на пементи в тонкій кишці, каталізуючи гідроліз жиру до роральному введенні свинячої панкреліпази, що гліцерину і жирних кислот, білків до пептидів і амімістить суміш ліпаз, трипсину, хімотрипсину, еласнокислот, і вуглеводів до декстринів, дисахаридів і тази і амілаз. Хоч добавки свинячих панкреатичмоносахаридів, таких як глюкоза. Екзокринна нених ферментів містять значні кількості амілази, достатність підшлункової залози (звана далі по повідомлялося, що пацієнти з кістозним фіброзом тексту «недостатністю підшлункової залози») є мають нормальні рівні амілази [P.L. Townes et al., результатом зниження функції підшлункової зало"Amylase Polymorphism: Studies of Sera and зи і може бути викликана цілим рядом клінічних Duodenal Aspirates in Normal Individuals and in розладів. Наприклад, недостатність підшлункової Cystic Fibrosis", Am. J. Hum. Genet., 28, pp. 378-389 залози пов'язана з кістозним фіброзом, хронічним (1976)]. Відповідно, вважається, що амілаза не панкреатитом, гострим панкреатитом, раком підшграє ролі в збільшенні перетравлювання полісахалункової залози і синдромом Швахмана-Даймонда ридів [Е. Lebenthal et al., "Enzyme Therapy for [E.P.DiMagno et al., in The Pancreas: Biology, Pancreatic Insufficiency: Present Status and Future Pathobiology and Disease, 2d Ed., V.Liang et al., Needs", Pancreas, 9, pp. 1-12 (1994)]. Ліпазний, eds., pp. 665-701 (1993)]. протеазний і амілазний компоненти добавок свиУ пацієнтів, які страждають недостатністю пінячої підшлункової залози, як правило, присутні у дшлункової залози, підшлунковій залозі не вдаєтьспіввідношенні 1:3,5:3,5. ся виробити і/або секретувати достатні кількості Добавки ферментів підшлункової залози, як травних ферментів для підтримки нормального правило, вводять перорально з їжею. Оскільки ці процесу травлення, включаючи перетравлювання добавки проходять через середовище шлунка з жирів, білків і вуглеводів. У результаті ці пацієнти низьким значенням рН, їх ферментна активність страждають від порушення поглинання поживних швидко зменшується. У результаті потрібні значні речовин. Клінічні прояви недостатності підшлункокількості концентрату ферментів (іноді не менше вої залози включають спастичні болі в животі, 15 капсул або таблеток за один прийом їжі), щоб здуття живота, діарею, стеаторею, нудоту і втрату гарантувати наявність в проксимальній частині ваги. кишечнику досить активних ферментів для допоНедостатність підшлункової залози є у 89% моги при недостатності підшлункової залози. пацієнтів, які страждають на кістозний фіброз Оскільки протеаза і ліпаза можуть оборотно [D.Borowitz et al., "Use of Fecal Elastase-1 to Identify інактивуватися в кислому середовищі шлунка, до Misclassification of Functional Pancreatic Status in продуктів панкреліпази були застосовані технології Patients with Cystic Fibrosis", J.Pediatr., 145, pp. розчинних в кишечнику покриттів, з метою вмісти322-326 (2004)]. Кістозний фіброз є аутосомним ти ферменти в мікрокапсули або іншим способом рецесивним генетичним розладом, який насампеобробити їх захисним кишковим покриттям. Хоч ред уражає шлунково-кишкову і дихальну системи такі кишкові покриття поліпшували комплекс влас[S.M. Rowe et al., "Mechanisms of Disease: Cystic тивостей продукту, для досягнення сприятливого Fibrosis", N. Engl. J. Med., 352, pp. 1992-2001 терапевтичного результату як і раніше були потрі(1995)]. Аномальні кількості і в'язкість слизу, що бні великі кількості добавок [J.H. Meyer, in виробляється у пацієнтів з кістозним фіброзом, Pancreatic Enzymes in Health and Disease, P.G. перешкоджають секреції достатніх кількостей феLankisch, ed., pp. 71-88 (1991)]. Була впроваджена рментів підшлункової залози. Зменшений об'єм лінія продуктів з високим вмістом панкреліпази секреції підшлункової залози веде до загущення в (Ultrase ) з метою зменшення кількості таблеток протоці підшлункової залози, перешкоджаючи виабо капсул, необхідних для лікування недостатноходу ферментів і бікарбонату в дванадцятипалу сті підшлункової залози. Однак в 1991 році Cystic кишку. У результаті пацієнти з кістозним фіброзом, Fibrosis Foundation Сполучених Штатів спільно з у яких є недостатність підшлункової залози, страFDA повідомили про численні випадки фіброзуюждають від погіршення травлення і стикаються зі чої колонопатії у дітей з кістозним фіброзом, що значним порушенням всмоктування жирів і білків. приймали такі продукти з високим вмістом діючих Наприклад, у таких пацієнтів, як правило, всмоктуречовин [S.C. Fitzsimmons et al., "High-Dose ється менше 60% жиру, що поступає з їжею [М. Pancreatic-Enzyme Supplements and Fibrosing Kraisinger et al., "Clinical Pharmacology of Pancreatic Colonopathy in Children with Cystic Fibrosis", N. Enzymes in Patients with Cystic Fibrosis and in vitro Engl. J. Med.. 336, pp. 1283-1289 (1997)]. У цих паPerformance of Microencapsulated Formulations", J. цієнтів структури, викликані фіброзом ободової Clin. Pharmacol., 34, pp. 158-166 (1994)]. Якщо не кишки, часто вимагали хірургічного втручання і, в здійснювати лікування захворювання, порушення деяких випадках, колектомії. 7 91521 8 Як засіб проти зменшення денних доз ферменка ферментних добавок і м'ясної їжі, а також зантів підшлункової залози, FDA видалила з ринку тримка вивільнення ферментів з препаратів з кишпродукти з високим вмістом діючої речовини (виковим покриттям [P.G. Lankish, Digestion, 54 див. значені, як більш ніж 2500 USP одиниць на кг маси вище; P. Regan et al., N. Eng. J. Med., 297, див. тіла) [D.S. Borowitz et al., "Use of Pancreatic Enzyme вище]. Supplements for Patients with Cystic Fibrosis in the Через проблеми з ефективністю, стабільністю Context of Fibrosing Colonopathy", J. Pediatr., 127, і біодоступністю, якими характеризуються стандаpp. 681-684 (1995)]. Крім того, Cystic Fibrosis ртні добавки, що містять панкреатичні ферменти, Foundation Сполучених Штатів спільно з FDA реяк альтернативи ферментам, одержаним зі свикомендували докладне дослідження комплексної ней, було запропоноване застосування ферментів, природи екстрактів свинячих ферментів [див. там що виробляються мікроорганізмами. Наприклад, в же]. Група експертів за узгодженням також рекопатенті США № 6051220 описані композиції, які мендувала дослідження альтернативних, стійких включають одну або декілька стійких до кислот до дії кислот ліпаз. ліпаз і одну або декілька стійких до кислот амілаз, Незалежно від того, чи покрита дана добавка, причому обидва типи ферментів переважно грибщо містить ферменти підшлункової залози, кишкокового походження. У заявці на патент США вим покриттям, чи ні, біодоступність таких добавок 2004/0057944 описані композиції, які включають міняється в широких межах через відмінності в ліпазу Rhizopus delemar, протеазу Aspergillus кислотності кишечнику пацієнтів. У результаті для melleus і амілазу Aspergillus oryzae. У заявці на поліпшення клінічної ефективності ферментних патент США 2001/0046493 описані композиції, які добавок багато які пацієнти вживають лікарські включають зшиті кристалічні бактеріальні ліпази, засоби, що змінюють рН, такі як блокатори гістаміспільно з грибковими або рослинними протеазами нового-2 рецептора (Н2) і інгібітори протонного і грибковими або бактеріальними амілазами. насоса (РРІ) [P.G. Lankish, "Enzyme Treatment of Незважаючи на такі розробки, як і раніше збеExocrine Pancreatic Insufficiency in Chronic рігається потреба в оптимізації лікарських складів Pancreatitis", Digestion, 54 (Supp. 2), pp. 21-29; для подальшого поліпшення як ефективності до(1993); D.Y. Graham, "Pancreatic Enzyme бавок з ферментами підшлункової залози, так і Replacement: the Effect of Antacids or Cimetidine", відповідності препаратів різним пацієнтам. Мета Dig. Dis. Sci., 27, pp. 485-490 (1982); J.H. Saunders одержання добавок з ферментами підшлункової et al., "Inhibition of Gastric Secretion in Treatment of залози, що виявляють максимальну ефективність Pancreatic Insufficiency", Br. Med. J., 1, pp. 418-419 при найменшому дозуванні, і відмінних добре ві(1977); H.G. Heijerman et al., "Omeprazole Enhances домим профілем безпеки, залишається дуже важthe Efficacy of Pancreatin (Pancrease) in Cystic ливою для всіх пацієнтів, які страждають на недоFibrosis", Ann. Inter. Med., 114, pp. 200-201 (1991); статність підшлункової залози, включаючи M.J. Bruno et al., "Comparative Effects of Adjuvant пацієнтів, які входять в співтовариство людей з Cimetidine and Omprazole during Pancreatic Enzyme кістозним фіброзом. Replacement Therapy", Dig. Dis. Sci., 39, pp. 988Суть винаходу 992 (1994)]. Даний винахід направлений на композиції і Нестабільність з точки зору ефективності і фаспособи, призначені для лікування станів, які рмацевтичних властивостей, а також недостатня включають недостатність підшлункової залози. стійкість були виявлені як важливі фактори, що Відповідно до переважного варіанта здійснення, додають внесок в слабу реакцію деяких пацієнтів композиції за даним винаходом характеризуються на традиційні добавки, що містять ферменти підкристалами зшитої мікробної ліпази, мікробною шлункової залози [C.L. Chase et al., "Enzyme протеазою і мікробною амілазою у співвідношенні Content and Acid Stability of Enteric-Coated приблизно 1,0:1,0:0,15 одиниць ферментної активPancreatic Enzyme Products in vitro", Pancreas, 30, ності USP. Переважно ці композиції характеризуpp. 180-183 (2005); D.S. Borowitz et al., J. Pediatr., ються стабільними ферментними компонентами, 127, supra; C.J. Powell et al., "Colonic Toxicity from що, в свою чергу, гарантує in vivo вивільнення діюPancreatins: a Contemporary Safety Issue", Lancet, чого ферменту в шлунково-кишковий тракт і, тим 353, pp. 911-915 (1999); E. Lebenthal et al., "Enzyme самим, допускає ефективні режими лікування неTherapy for Pancreatic Insufficiency: Present Status достатності підшлункової залози з низьким дозуand Future Needs", Pancreas, 9, pp. 1-12 (1994); P. ванням. Regan et al., "Comparative Effects of Antacids, Короткий опис ілюстративного матеріалу Cimetidine and Enteric Coating on the Therapeutic На Фіг. 1 показана зміна середнього коефіцієнResponse to Oral Enzymes in Severe Pancreatic та поглинання жиру ("CFA") в порівнянні з вихідInsufficiency", N. Eng. J. Med., 297, pp. 854-858 ним рівнем у пацієнтів, яким вводять композиції за (1977)]. Ці фактори включають зміни активності даним винаходом під час фази 2 дослідження. ферментів від партії до партії, чутливість до втраНа Фіг. 2 показана зміна середнього коефіцієнти активності через деякий час при дії сонячного та поглинання азоту ("CNA") в порівнянні з вихідсвітла, тепла або вологи, а також недостатньо ним рівнем у пацієнтів, яким вводять різні комповизначений профіль небажаних реакцій [D.S. зиції за даним винаходом під час фази 2 Borowitz et al., J.Pediatr., 127, вище]. Інші фактори, дослідження. які посилюють неефективність терапії підшлункоНа Фіг. 3 показана кореляція між коефіцієнтом вої залози, включають руйнування замінних ферпоглинання жиру ("CFA") і коефіцієнтом поглинанментів шлунковим соком і/або протеазами, що є в ня азоту ("CNA") у початковий період у пацієнтів, просвіті кишечнику, асинхронне видалення з шлу 9 91521 10 яким вводять композиції за даним винаходом під Термін «напівкристалічний» належить до речас фази 2 дослідження. човини в твердому стані, яка має як кристалічні, На Фіг. 4 показана кореляція між коефіцієнтом так і аморфні області. поглинання жирів ("CFA") і коефіцієнтом поглинанТермін «суб'єкт», «пацієнт» або «індивідуум» ня азоту ("CNA") в період введення препаратів у належить до будь-якого ссавця, включаючи будьпацієнтів, яким вводять композиції за даним винаяку класифіковану тварину саму по собі, в т. ч. ходом під час фази 2 дослідження. людей і інших приматів. На Фіг. 5 показана кореляція між різницями коТермін «порушення травлення» належить до ефіцієнта поглинання жирів ("CFA") і коефіцієнта погіршення розщеплення компонентів їжі (таких як поглинання азоту ("CNA") під час введення препажири, білки і вуглеводи) до їх складових частин, які ратів і під час початкового періоду у пацієнтів, можуть всмоктуватися в травному тракті (моно-, яким вводять композиції за даним винаходом під ди- або олігосахаридів, амінокислот, олігопептидів, час фази 2 дослідження. жирних кислот і моногліцеридів). Порушення травНа Фіг. 6 показана зміна середнього коефіцієнлення може бути наслідком декількох станів, та поглинання жирів ("CFA") в порівнянні з вихідвключаючи недостатність підшлункової залози. ним рівнем у пацієнтів з кістозним фіброзом, яким Термін «порушення всмоктування» належить вводять різні дози композицій за даним винаходом до погіршення всмоктування перетравлених компід час фази 1 дослідження. понентів їжі, в тому числі вітамінів і мікроелементів На Фіг. 7 показана зміна середнього коефіцієнз тонкого кишечнику або товстої кишки. Порушента поглинання азоту ("CNA") в порівнянні з вихідня всмоктування може бути наслідком порушення ним рівнем у пацієнтів, яким вводять різні дози поглинання в слизових оболонках тканин, що викомпозицій за даним винаходом під час фази 1 стилають кишечник, або окремих аномалій травдослідження. лення. Порушення всмоктування в кишечнику моДокладний опис винаходу же спостерігатися для багатьох компонентів їжі Даний винахід належить до відкриття, згідно з або для конкретних макрокомпонентів, а саме, яким композиції, що включають ліпазу, протеазу і жирів, білків або вуглеводів, а також для мікрокомамілазу у співвідношенні приблизно 1,0:1,0:0,15 понентів, таких як кальцій, магній, залізо і вітаміни. одиниць ферментної активності USP, є ефективПорушення всмоктування може бути наслідком ними для лікування станів, які включають недостадекількох станів, включаючи недостатність підштність підшлункової залози. Це унікальне співвідлункової залози. Порушення всмоктування білків ношення між ліпазою, протеазою і амілазою називають «азотореєю». Порушення всмоктування робить можливим лікування таких станів при теражирів називають «стеатореєю». певтичних режимах з низьким дозуванням, яке Термін «ліпаза» належить до ферменту, який неможливе при застосуванні стандартних добавок каталізує гідроліз (тобто розділення гідроксильних зі свинячими панкреатичними ферментами. Крім груп і атомів водню сполук на фрагменти за рахутого, дане співвідношення між ліпазою, протеазою нок приєднання води) ліпідів до гліцерину і просі амілазою дозволяє уникнути високої концентрації тих жирних кислот. Каталізована ферментом реапротеази, яка, як вважають, несе відповідальність кція, як правило, вимагає присутності іонів кальцію за фіброзуючу колонопатію при застосуванні стан(Са2+). Секретовані підшлунковою залозою ліпази дартних ферментних добавок [D.S. Borowitz et al., виключно важливі для перетравлювання жирів J. Pediatr., 127, див. вище]. (тригліцеридів) у верхній петлі тонкого кишечнику. Згідно з переважним варіантом здійснення, Згідно з переважним варіантом здійснення, ліпази, композиції за даним винаходом включають крисзастосовні в композиціях і способах за даним витали зшитої мікробної ліпази, мікробну протеазу і находом, не є ліпазами, що виробляються підшлумікробну амілазу у співвідношенні приблизно нковою залозою, тобто вони не виділені з тканини 1,0:1,0:0,15 одиниць ферментної активності USP. підшлункової залози людини або тварин. Згідно з Визначення більш переважним варіантом здійснення даного Потрібно розуміти, що визначені нижче термівинаходу, застосовувані ліпази є мікробними ліпани мають наступні значення, якщо не вказане інзами. Згідно з ще більш переважним варіантом ше: здійснення даного винаходу, застосовувані ліпази Термін «аморфний» належить до будь-якого є бактеріальними ліпазами. Бактеріальні ліпази стану, відмінного від кристалічного або напівкрисвключають, наприклад, ліпазу Pseudomonas і/або талічного стану. Аморфні речовини включають ліпазу Burkholderia. аморфні тверді речовини і рідини. Мікробні ліпази можуть бути виділені з прироТермін «кристал» або «кристалічний» наледних мікробіологічних джерел, або вони можуть жить до однієї з форм речовини в твердому стані, являти собою рекомбінантні мікробні ліпази, що яка містить атоми, розташовані у вигляді структуодержуються за технологією рекомбінантної ДНК ри, що періодично повторюється в трьох вимірюіз застосуванням придатної клітини-хазяїна, вибваннях [див., наприклад, Barrett, Structure of раної з клітин-хазяїнів будь-яких бактерій, дріжnd Methals. 2 ed., (1952)]. Кристали або кристалічна джів, грибків, рослин, комах або ссавців, переважформа ферменту відрізняється від його аморфних но бактерій, в культурі. Рекомбінантні ліпази або напівкристалічних форм. Кристали демонохоплюють або закодовані нуклеїновими кислотаструють характерні риси, включаючи структуру ми з природної послідовності ліпаз. Далі, рекомбіпросторових решіток, характерні форми і оптичні нантні ліпази включають амінокислотну послідоввластивості, такі як, наприклад, показник заломність, яка гомологічна або в основному ідентична лення. природній послідовності, а також ліпази, закодо 11 91521 12 вані нуклеїновими кислотами, які гомологічні або в титу. Термін «амілази, які не виробляються підшосновному ідентичні природним нуклеїновим кислунковою залозою» належить до амілаз, які не лотам, що кодують ліпази. З іншого боку, ліпази, виділені з тканини підшлункової залози людини застосовні в композиціях і способах за даним виабо тварин. Згідно з більш переважним варіантом находом, можуть бути синтезовані за стандартниздійснення даного винаходу, амілази є мікробними ми методиками синтезу пептидів. амілазами. Згідно з ще більш переважним варіанТермін «протеаза» належить до протеїнази, том здійснення даного винаходу, амілаза являє протеолітичного ферменту або пептидази, яка собою грибкову амілазу. Згідно з ще одним варіанявляє собою фермент, який каталізує розщеплентом здійснення даного винаходу, амілаза являє ня внутрішніх амідних пептидних зв'язків в білці. собою амілазу Aspergillus і переважно амілазу Конкретно, протеази каталізують перетворення Aspergillus oryzae. білків на амінокислоти, що їх складають, шляхом Мікробні амілази можуть бути виділені з прирозщеплення амідних зв'язків між карбоксильною родних мікробіологічних джерел, або вони можуть групою однієї амінокислоти і аміногрупою іншої. являти собою рекомбінантні мікробні амілази, що Протеази, як правило, ідентифікують за їх каталіодержуються за технологією рекомбінантної ДНК тичним типом, наприклад, пептидази аспарагінової із застосуванням придатної клітини-хазяїна, вибкислоти, цистеїн (тіол) пептидази, металопептидараної з будь-яких клітин-хазяїнів бактерій, дріжзи, серин пептидази, треонін пептидази, лужні або джів, грибків, рослин, комах або ссавців, переважнапівлужні протеази, нейтральні, а також пептидано грибків, в культурі. Рекомбінантні амілази зи з невідомим механізмом каталізу (див. охоплюють або закодовані нуклеїновими кислотаhttp://merops.sanger.ac.uk). Згідно з переважним ми з природної послідовності амілаз. Далі, рекомваріантом здійснення, протеази, що застосовуютьбінантні амілази включають амінокислотну посліся в композиціях і способах за даним винаходом, довність, яка гомологічна або в основному не є протеазами, що виробляються підшлунковою ідентична природній послідовності, а також амілазалозою, тобто їх не виділяють з тканини підшлунзи, закодовані нуклеїновими кислотами, які гомокової залози людини або ссавців. Згідно з більш логічні або в основному ідентичні природним нукпереважним варіантом здійснення даного винахолеїновим кислотам, що кодують амілази. З іншого ду, протеази являють собою мікробні протеази. боку, амілази, застосовні в композиціях і способах Згідно з ще більш переважним варіантом здійсза даним винаходом, можуть бути синтезовані за нення даного винаходу, протеази являють собою стандартними методиками синтезу пептидів. грибкові протеази. Згідно з ще одним варіантом Терміни «терапевтично ефективна доза» або здійснення даного винаходу, протеаза являє со«терапевтично ефективна кількість» належать до бою протеазу Aspergillus melleus. такої кількості композиції, яка приводить до запобіМікробні протеази можуть бути виділені з пригання, відстрочки появи симптомів або полегшення родних мікробіологічних джерел, або вони можуть тяжкості симптомів стану, який буде піддаватися являти собою рекомбінантні мікробні протеази, що лікуванню. Терапевтично ефективна кількість є одержуються за технологією рекомбінантної ДНК такою кількістю, якої досить для лікування, профііз застосуванням придатної клітини-хазяїна, виблактики, зменшення тяжкості, відстрочки настання раної з будь-яких клітин-хазяїнів бактерій, дріжабо зменшення частоти прояву одного ;або декільджів, грибків, рослин, комах або ссавців, переважкох симптомів стану, який буде піддаватися лікуно грибків, в культурі. Рекомбінантні протеази ванню. Стани, які можуть піддаватися лікуванню із охоплюють або закодовані нуклеїновими кислотазастосуванням композицій за даним винаходом, ми з природної послідовності протеаз. Далі, рековключають, наприклад, недостатність підшлункомбінантні протеази включають амінокислотну посвої залози, порушення всмоктування і порушення лідовність, яка гомологічна або в основному травлення. ідентична природній послідовності, а також протеТермін «одиниця USP» належить до одиниці ази, закодовані нуклеїновими кислотами, які гомоферментної активності фармакопеї Сполучених логічні або в основному ідентичні природним нукШтатів, що є в засобі або композиції. Одна одинилеїновим кислотам, що кодують протеази. З ця USP ліпази, протеази або амілази визначена в іншого боку, протеази, застосовні в композиціях і Pancrelipase, USP, U.S. Pharmacopeia National способах за даним винаходом, можуть бути синтеFormulary, USP 24, pp. 1254-1255 (2000). В цьому зовані за стандартними методиками синтезу пепджерелі розкриті способи аналізу ліпази, протеази тидів. і амілази, причому вони включені в дану заявку за Термін «амілаза» належить до ферменту, який допомогою посилання. виробляється в підшлунковій залозі, а також в Характеристики композицій даного винаходу слинних залозах у людей, але не у всіх ссавців. Переважно, композиції згідно з даним винахоАмілаза людської слини відома як птіалін. Амілаза дом поліпшують всмоктування жиру, білка і крохє основним травним ферментом, який відповідає малю у пацієнтів, які страждають на такі стани, як, за перетравлювання вуглеводів, наприклад, полінаприклад, недостатність підшлункової залози, що сахаридів, в тонкому кишечнику, шляхом перетвоведе до поліпшення постачання поживними речорення двох компонентів крохмалю (амілози і амівинами і росту. Композиції зберігають високі рівні лопектину) на прості цукри. Більш конкретно, специфічної активності в кислотно-пепсиновому амілаза гідролізує крохмаль, глікоген і декстрин з середовищі. Це відбувається тому, що їх ферменутворенням глюкози, мальтози і граничних дектні компоненти протистоять кислому середовищу стринів. Клінічно рівні амілази в крові часто підвиверхньої частини шлунково-кишкового тракту, в т. щені при стані гострого і іноді хронічного панкреач. низьким значенням рН шлунка і високим рівням 13 91521 14 протеази в шлунково-кишковому тракті, що дає визначені експериментально. Для способу в проферментам можливість досягнути кишечнику в мисловому масштабі регульоване осадження, що активній формі. У результаті, композиції можна приводить до кристалізації, може бути найкращим вводити в менших кількостях за одне дозування і чином проведене при застосуванні простої комбіза допомогою меншої кількості прийомів, в порівнації білка, осаджувача, додаткових розчинених нянні з добавками, що містять свинячі панкреатичречовин, і, необов'язково, буферів в періодичному ні ферменти. Це, в свою чергу, забезпечує краще процесі. З іншого боку, також можуть застосовувапогодження пацієнтів з умовами лікування. тися лабораторні способи кристалізації, такі як Крім того, композиції за даним винаходом модіаліз або дифузія парів. McPherson et al., Methods жна вводити суб'єктам без необхідності застосуEnzymoL 114, pp. 112-120 (1985) і Gilliland, J. вання кишкового покриття або додавання засобів, Crystal Growth, 90, pp; 51-59 (1988) включають веякі пригнічують дію кислоти. Це відбувається тому, ликий перелік відповідних умов, описаних в літещо одержані з мікроорганізмів ферментні компоратурі по кристалізації. Іноді несумісність між сененти, що застосовуються в різних варіантах здійредовищем кристалізації і засобом для зшивання снення композицій за даним винаходом, більш може потребувати заміни буфера або розчинника стійкі до дії кислоти в шлунку, ніж свинячі панкреаперед початком зшивання. тичні ферменти. Ліпаза кристалізується при дотриманні ряду Ліпазний компонент умов, включаючи рН в діапазоні приблизно 4-9. Ліпазний компонент композицій за даним виОсаджувачі, застосовні для одержання ліпазного находом переважно являє собою мікробну ліпазу. компонента композицій за даним винаходом, Більш переважно, застосовується бактеріальна включають ізопропанол, трет-бутанол, 2-метилліпаза, а не ліпаза грибкового або рослинного по2,4-пентандіол (MPD), сульфат амонію, хлорид ходження. натрію, хлорид магнію і інші сполуки, відомі фахівПереважно ліпаза є такою ліпазою, яка стабіцям в даній галузі техніки. Застосовні солі вклюльна в середовищі з кислотним значенням рН і/або чають двовалентні і одновалентні катіони і їх солі. яка стійка до протеолітичного руйнування. Крім Кристали ліпази, застосовні в композиціях за того, ліпаза може застосовуватися в формі, яка даним винаходом, можуть мати найбільший розмір збільшує стійкість до кислотного рН і/або стійкість від приблизно 0,01 мкм до приблизно 500 мкм, або до протеолітичного руйнування. У цьому випадку від приблизно 0,1 мкм до приблизно 50 мкм, або ліпаза переважно застосовується в формі зшитих від приблизно 0,1 мкм до приблизно 10 мкм. Вони кристалів. Будь-яка з описаних вище ліпаз може можуть мати форму, вибрану з групи, що складазастосовуватися для утворення зшитого кристаліється зі сфер, голок, стержнів, пластин, як, напричного ліпазного компонента композицій за даним клад, шестикутних і квадратних, ромбоїдів, кубів, винаходом. біпірамід і призм. Кристалізація ліпази Зшивання кристалів ліпази Кристали ліпази, застосовні в композиціях за Якщо кристали ліпази були вирощені у придаданим винаходом, можуть бути вирощені із застотному середовищі, їх можна піддати зшиванню. суванням стандартних способів, таких як кристаліЗшивання приводить до стабілізації кристалічних зація в замкненому об'ємі. Див., наприклад, патент решіток за рахунок введення ковалентних зв'язків США 6541606. З іншого боку, кристали ліпази моміж молекулами білка, з яких складається кристал. жуть бути вирощені регульованим осаджуванням Це робить можливим перенесення ферменту в білка з водного розчину або водного розчину, що невластиве йому середовище, що, в іншому випамістить органічні розчинники. Див., наприклад, дку, для даного ферменту могло б бути несумісне патент США 5618710 і заявку на патент США з існуванням кристалічних решіток або інтактного 2003/0017144. Фахівець в даній галузі техніки зроферменту. зуміє, що умови, якими необхідно керувати під час Внаслідок зшивання кристалів ліпази можуть кристалізації, включають, наприклад, швидкість бути змінені стійкість ферменту (наприклад, у відвипаровування розчинника, присутність придатних ношенні рН, температури, механічна і/або хімічна додаткових розчинників і буферних розчинів, рН і стійкість), профіль активності ліпази в залежності температуру. від рН, розчинність, однорідність розміру і об'єму Кристали ліпази можуть бути одержані за ракристалів, швидкість вивільнення ліпази з кристахунок вибору поєднання ліпазного ферменту, що ла і/або розмір і форма проміжків між окремими підлягає кристалізації, з придатним розчинником молекулами ферменту, з яких складаються крисабо водним розчинником, що містить придатні талічні решітки. осаджувальні засоби, такі як солі або органічні Зшивання переважно здійснюють таким чиреагенти. Розчинник змішують з ліпазою і необоном, щоб зшиті кристали, що утворюються, містив'язково піддають перемішуванню при температули ліпазу, яка проявляє не менше приблизно 10%, рі, яка, як визначено експериментально, придатна 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, для стимулювання кристалізації і ι прийнятна для 96%, 97%, 98%, 99%, 99,5%, 99,7% або 99,9% або збереження стабільності і активності білка. Розбільше ферментної активності в порівнянні з нечинник може необов'язково включати додаткові модифікованою ліпазою. Стійкість може бути збірозчинені речовини, такі як двовалентні катіони, льшена не менш ніж на, приблизно, 20%, 30%, кофактори або хаотропи, а також буферні компо40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 150%, ненти для регулювання рН. Необхідність в додат200%, 250%, 300% або більше в порівнянні з некових розчинених речовинах для сприяння кристамодифікованою ліпазою. Стійкість може бути вимілізації, а також їх концентрації можуть бути ряна в умовах зберігання, як, наприклад, стійкість 15 91521 16 до рН, стійкість до дії температур, стійкість до дії Company, видання 2003-2004 pp. Інші приклади протеаз, в т. ч. шлунково-кишкових протеаз і реагентів для зшивання включають: диметил-3,3'дитіобіспропіонімідат·НСІ (DTBP); дитіоPronase , стійкість до розчинення, або ж, наприбіс(сукцинімідилпропіонат) (DSP); бісмалеімідогекклад, біологічна стійкість in vivo. сан (ВМН); 1,5-дифтор-2,4-динітробензол У деяких випадках зшивання кристалів ліпази (DFDNB); диметилсуберімідат·2НСl (DMS); дисуксповільнює перехід ліпази в розчин, ефективно цинімідилглутарат (DSG); дисульфосукцинімідиліммобілізуючи молекули ферменту в мікрокристатартрат (сульфо-DST); 1-етил-3-[3лічних частинках. При дії пускового механізму в диметиламінопропіл]карбодіімідгідрохлорид середовищі, яке оточує зшиті кристали ліпази, на(EDC); етиленглікольприклад, при умовах застосування, а не зберіганбіс[сульфосукцинімідилсукцинат] (сульфо-EGS); ня, кристали ліпази розчиняються, вивільняючи поліпептиди ліпази і/або збільшуючи активність складний ефір Ν-[ ліпази. Швидкість розчинення може керуватися, малеімідобутирилокси]сукциніміду (GMB S); Nнаприклад, одним або декількома з наступних фагідроксисульфосукцинімідил-4-азидобензоат (сукторів: ступінь зшивання, тривалість часу дії реальфо-HSAB); сульфосукцинімідил-6-[ -метил- -(2генту для зшивання на кристали ліпази, швидкість піридилдитіо)толуамідо]гексаноат (сульфо-LCдодавання реагенту для зшивання до кристалів SMPT); біс-[ -(4ліпази, природа зшивального агента, довжина азидосаліциламідо)етил]дисульфід (BASED) і зшивального агента, рН, температура, присутність NHS-PEG-вінілсульфон (NHS-PEG-VS). сульфгідрильних реагентів, таких як цистеїн або Крім цього, можуть застосовуватися реагенти, глутатіон, площа поверхні кристалів зшитої ліпази, що здійснюють оборотне зшивання. Деякі оборотрозмір кристалів зшитої ліпази або форма кристано зшивальні реагенти є поліфункціональними лів зшитої ліпази. зшивальними реагентами, які включають пусковий Зшивання кристалів ліпази може бути здійснемеханізм у вигляді окремої групи. Реакційноздатна не із застосуванням одного реагенту для зшиванфункціональна група залучена до зв'язування реаня або їх комбінації, включаючи поліфункціональні кційноздатних амінокислот бічних ланцюгів в білці, реагенти, в т. ч. біфункціональні реагенти, одночаі пусковий механізм складається із зв'язку, який сно (паралельно) або послідовно. У різних варіанможе бути розірваний при зміні однієї або декільтах здійснення під дією пускового механізму отокох умов в оточуючому середовищі (наприклад, чуючого середовища або через визначений рН, наявності відновного реагенту, температури проміжок часу відбувається зменшення кількості або термодинамічної активності води). або ослаблення зшивальних агентів між молекуЗшивальний агент може бути гомофункціоналами в кристалах ліпази, що веде до розчинення льним або гетерофункціональним. Реакційноздатліпази або вивільнення активної речовини. З іншона функціональна група (або фрагмент) може, наго боку, зшивальні агенти можуть розриватися в приклад, бути вибрана з одного з наступних видів місці прикріплення до молекул, що веде до розчифункціональних груп (де R, R', R" і R''' можуть явнення білка або вивільнення активної речовини. ляти собою алкіл, арил або водень): Див., наприклад, патенти США №№ 5976529 і І. Реакційноздатні донори ацильної групи, як, 6140475. Зшивання може бути проведене відповінаприклад: складні ефіри карбонових кислот дно до будь-якої стандартної методики зшивання. RCOOR', аміди RCONHR', ацилазиди RCON3, карПідсумкова концентрація зшивальних агентів в бодііміди R-N=C=N-R', складні ефіри Nзшитих кристалах ліпази повинна знаходитися в гідроксіімідів RCO-O-NR', імідоефіри Rмежах від приблизно 0,001 нМ до приблизно 300 C=NH2+(OR'), ангідриди RCO-C-COR', карбонати нМ, переважно від приблизно 1,0 нМ до приблизно RO-CO-O-R', уретани RNHCONHR', галогенангід50 нМ, найбільш переважно від приблизно 2,0 нМ риди кислот RCOHal (де Наl=галоген), ацилгідрадо приблизно 5,0 нМ. зиди RCONNR'R", a також О-ацилізоуреази RCOЗгідно з переважним варіантом здійснення даO-C=NR' (-NR'R'''). ного винаходу, зшивальний реагент являє собою II. Реакційноздатні карбонільні групи, як, набіс(сульфосукцинімідил)суберат ("BS3"). Інші заприклад: альдегіди RCHO і кетони RCOR', ацеталі стосовні зшивальні реагенти включають глутароRCO(H2)R' і кеталі RR'CO2R'R" (реакційноздатні вий альдегід, янтарний альдегід, октандіальдегід і карбонілвмісні функціональні групи, відомі фахівгліоксаль. Додаткові поліфункціональні зшивальні цям в галузі іммобілізації і зшивання білків (Pierce реагенти включають галогентриазини, наприклад, Catalog and Handbook, Pierce Chemical Company ціанурхлорид; галогенпіримідини, наприклад, 2003-2004; S.S.Wong, Chemistry of Protein 2,4,6-трихлор/бромпіримідини; ангідриди або галоConjugation and Cross-linking, (1991)). генангідриди аліфатичних або ароматичних моноIII. Донори алкілів і арилів, як, наприклад, алабо дикарбонових кислот, наприклад, малеїновий кіл- або арилгалогеніди R-Hal, азиди R-N3, ефіри ангідрид, (мет)акрилоїлхлорид, хлорацетилхлосірчаної кислоти RSO3R', ефіри фосфорної кислорид; N-метилольні сполуки, наприклад, Nти RPO(OR')3, алкілоксонієві солі R3O+, солі суль+ метилолхлорацетамід; діізоціанати або діізотіоціафонію R3S , ефіри азотної кислоти RONO2, акцепнати, наприклад, фенілен-1,4-діізоціанат і азиритори Міхаеля RCR'=CR'''COR", арилфториди ArF, дини. Інші зшивальні реагенти включають епоксиізонітрили RN+ C-, галогенаміни R2N-Hal, алкени і ди, як, наприклад, діепоксиди, триепоксиди і алкіни. тетраепоксиди. Для ознайомлення з представниIV. Сірковмісні групи, як, наприклад, дисульфіцьким переліком інших доступних зшивальних реади RSSR', сульфгідрили RSH і епоксиди R2COCR'2. гентів див., наприклад, каталог Pierce Chemical 17 91521 18 V. Солі, як наприклад, аклільні або арильні ві виведення кожного ізотопу (наприклад, процент утримання в шлунку в залежності від часу) і визнаамонієві солі R4N+, карбоксилати RCOO , сульфачають кількості ізотопів, що поступають в проксити ROSO3 , фосфати ROPO3", а також аміни R3N. мальну, середню і дистальну, частини тонкого киОборотні зшивальні реагенти включають, нашечнику з відповідних цікавлячих ділянок. приклад, пусковий фрагмент. Пусковий фрагмент Переважно, зшитий ліпазний компонент комвключає алкільний, арильний або інший ланцюг з позицій за даним винаходом має високу специфічактивуючою групою, яка може реагувати з білком,: ну активність. Висока специфічна активність ліпащо піддається зшиванню. Ці реакційноздатні групи зи, як правило, така, що фермент демонструє можуть бути різними групами, як, наприклад, груспецифічну активність у відношенні триолеїнів пами, що допускають нуклеофільне, вільноради(оливкова олія), що перевищує 500, 1000, 4000, кальне або електрофільне заміщення, включаючи, 5000, 6000, 7000, 8000, 9000 або більше одив числі інших, галогеніди, альдегіди, карбонати, ниць/мг білка. уретани, ксантани і епоксиди. Наприклад, реакційПереважно, зшитий ліпазний компонент комноздатні групи можуть проявляти лабільність при позицій за даним винаходом також стабільний дії кислот, основ, фторидів, ферментів, відновленпротягом тривалого періоду часу в умовах агресиня, окислення, тіолів, металів, фотолізу, вільних вного середовища, що є в різних ділянках шлункорадикалів або нагрівання. во-кишкового тракту, тобто шлунку, дванадцятиКристали зшитої ліпази можуть бути одержані палій кишці і кишечнику. Наприклад, ліпаза в формі порошку, за допомогою, наприклад, ліофіпереважно стійка, принаймні, протягом години, в лізації або розпилювального сушіння. Ліофілізація, середовищі з кислотним рН, наприклад, середоабо сушіння в замороженому стані, дає можливищі, в якому значення рН менше ніж 7, 6, 5, 4,5, 4, вість видаляти воду з композиції, з одержанням 3,5, 3, 2,5, 2, 1,5 або нижче. У даному описі термін кристалів, які можна зберігати без заморожування «стабільний» або «стійкий» означає, що кристали (при кімнатній температурі) протягом тривалого ліпази більш активні, ніж розчинна форма ліпази в періоду часу і потім легко відновлювати у вигляді даних умовах і протягом даного часу. Таким чирозчину у водному, органічному або змішаному ном, стабільні кристали ліпази зберігають більш водно-органічному розчиннику за вибором, без високий процент своєї вихідної активності в порівутворення аморфних суспензій і з мінімальним нянні з відповідною розчинною формою ліпази. У ризиком денатурації. Carpenter et al., Pharm. Res., деяких варіантах здійснення кристали ліпази збе14, pp. 969-975 (1997). Ліофілізацію можна здійсрігають не менше 10% вихідної активності після нювати, як описано в патенті США 5618710 або перебування у вказаних умовах протягом вказанобудь-яким іншим способом, відомим в техніці. Наго часу. У інших варіантах здійснення ліпаза зберіприклад, кристали зшитої ліпази, по-перше, замогає не менше 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, рожують, і потім помішують в глибокий вакуум, де 80%, 90% або більше своєї активності. кристалічна вода сублімується, дозволяючи одерЗ іншого боку або як доповнення, компонент жати кристали ліпази, що містять тільки міцно зв'якомпозицій за даним винаходом, що являє собою зані молекули води. кристали зшитої ліпази, є стійким до тепла. НаприХарактеристики кристалів зшитої ліпази клад, в різних варіантах здійснення він стабільний Ферментна активність кристалів зшитої ліпази протягом, принаймні, однієї години при 30°С, 37°С може бути виміряна за допомогою будь-якої станабо 40°С. дартної методики. Наприклад, активність ліпази Протеазний компонент може бути визначена спектрофотометрично, як Протеазний компонент композицій за даним описано в прикладі 6 патенту США 5618710. Активинаходом являє собою мікробну протеазу. Перевність ліпази можна оцінити, спостерігаючи за гідважно, застосовується протеаза грибкового, а не ролізом п-нітрофенілацетату, який є субстратом. бактеріального або рослинного походження. Більш За розщепленням субстрату стежать по збільшенпереважно, протеаза являє собою протеазу ню поглинання на 400 нм при вихідній концентрації Aspergillus. Найбільш переважно протеаза являє субстрату 0,005% і вихідній концентрації ферменту собою протеазу Aspergillus melleus. Згідно з пере1,5x10-8 Μ. Ліпазу додають в реакційну суміш об'єважним варіантом здійснення, протеазний компомом 5 мл, що містить субстрат в 0,2 Μ Tris з рН 7,0 нент композицій за даним винаходом знаходиться при кімнатній температурі. Перед вимірюванням в кристалізованій, не зшитій формі. Кристали пропоглинання кристалічну ліпазу видаляють з реактеази можуть бути одержані за методиками одерційної суміші центрифугуванням. жання кристалів, описаними вище для ліпази, із З іншого боку, активність ліпази можна вимірязастосуванням, наприклад, етанолу як осаджувати in vitro за допомогою гідролізу оливкової олії, як ча. З іншого боку, протеазний компонент композиописано в прикладах 2-4 патенту США 5614189. цій за даним винаходом може знаходитися в неКрім цього, активність ліпази можна виміряти кристалічних формах, в зшитих кристалічних in vivo. Наприклад, невеликий об'єм (близько 3 мл) формах або може бути покритий, або інкапсульооливкової або кукурудзяної олії можна помітити 99 ваний, або включений в склад яким-небудь іншим тіоціанатом Tc-(V) і кристалічну ліпазу можна чином, так щоб він не сприяв розпаду інших білкопомітити 111Іn. Мічений жир змішують з їжею для вих компонентів композиції. тварин, яка посипана міченою кристалічною ліпаАмілазний компонент зою. Одержують сцинтиграфічне зображення проАмілазний компонент композицій за даним виксимальної і дистальної частин шлунка і тонкого находом являє собою мікробну амілазу. Переважкишечнику доти, поки в шлунку не залишиться но застосовується амілаза грибкового, а не бакте