Імуногенна композиція

1. Імуногенна композиція, що включає принаймні два відмінні капсулярні сахариди N. meningitidis, де один або більше є вибраним(и) з першої групи, яка складається з MenA, MenC, MenY та MenW, який(і) є кон'югований(і) з білком(ами) носія, де співвідношення сахарид:білок (ваг./ваг.) знаходиться в межах 1:2-1:5, та один або більше відмінних сахаридів є вибраним(и) з другої групи, яка складається з MenA, MenC, MenY та MenW, який(і) є кон'югованим(и) з білком(білками) носія, де співвідношення сахарид:білок (ваг./ваг.) знаходиться в межах 5:1-1:1,99, причому MenC є прису 2 (19) 1 3 MenC, MenY та MenW, який(і) є безпосередньо кон'югованим(и) з білком(ами) носія. 8. Імуногенна композиція згідно з пунктом 7, що включає принаймні два відмінні капсулярні сахариди N. meningitidis, де один або більше є вибраним(и) з першої групи, яка складається з MenA та MenC, який(і) є кон'югований(і) за допомогою лінкера з білком(ами) носія, та один або більше відмінних сахаридів є вибраним(и) з другої групи, яка складається з MenC, MenY та MenW, який(і) є безпосередньо кон„югованим(и) з білком(ами) носія. 9. Імуногенна композиція, що включає принаймні два відмінні сахариди, кон„юговані окремо до того самого типу білка носія, де один або більше сахарид(ів) є кон„югованим(и) з білком носія, при цьому співвідношення сахарид:білок (ваг./ваг.) знаходиться в межах 1:2-1:5, та один або більше відмінний(их) сахарид(ів) є кон„югованим(и) з білком носія, де співвідношення сахарид:білок (ваг./ваг.) знаходиться в межах 5:1-1:1,99, причому один або більше сахарид(ів) є кон„югованим(и) з білком носія за допомогою хімічної групи першого типу на білковому носії, а один або більше сахарид(ів) є кон„югованим(и) з білком носія за допомогою хімічної групи другого типу на білковому носії. 10. Імуногенна композиція згідно з пунктом 9, в якій один або більше сахарид(ів), кон„югований(і) з білком носія за допомогою хімічної групи першого типу на білковому носії, є відмінними від одного або більше сахариду(ів), кон'югованого(их) з білком носія за допомогою хімічної групи другого типу на білковому носії. 11. Імуногенна композиція згідно з пунктом 9 або 10, в якій один або більше сахарид(ів) є кон'югованим(и) з білком носія за допомогою карбоксильної групи на білковому носії, а один або більше сахарид(ів) є кон„югованим(и) з білком носія за допомогою аміногрупи на білковому носії. 12. Імуногенна композиція згідно з будь-яким з пунктів 9-11, в якій перший та другий тип хімічної групи на білковому носії є присутніми на різних B- та/або Tклітинних епітопах на білку носія. 13. Імуногенна композиція згідно з будь-яким з пунктів 9-12, в якій сахариди є вибраними з групи, яка складається з: капсулярного сахариду N. meningitidis серогрупи A (MenA), капсулярного сахариду N. meningitidis серогрупи C (MenC), капсулярного сахариду N. meningitidis серогрупи Y (MenY), капсулярного сахариду N. meningitidis серогрупи W (MenW), капсулярного сахариду групи I Streptococcus групи B, капсулярного сахариду групи ІI Streptococcus групи B, капсулярного сахариду групи ІIІ Streptococcus групи B, капсулярного сахариду групи ІV Streptococcus групи B, капсулярного сахариду групи V Streptococcus групи B, капсулярного сахариду типу 5 Staphylococcus aureus, капсулярного сахариду типу 8 Staphylococcus aureus, Vi сахариду з Salmonella typhi, LPS N. meningitidis (такий, як L3 та/або L2), LPS M. catarrhalis, LPS H. influenzae, та будь-якого з капсулярних пневмококових сахаридів, таких, як з серотипів: 1, 2, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 8, 9N, 9V, 10A, 11A, 12F, 14, 15B, 17F, 18C, 19A, 19F, 20, 22F, 23F або 33F. 14. Імуногенна композиція згідно з будь-яким з попередніх пунктів, в якій кожний капсулярний са 95238 4 харид N. meningitidis є кон'югованим з білком носія, незалежно вибраним з групи, яка складається з TT, DT, CRM197, фрагменту C TT та білка D. 15. Імуногенна композиція згідно з будь-яким з попередніх пунктів, в якій кожний капсулярний сахарид N. meningitidis є кон'югованим з тим самим білком носія, вибраним з групи, яка складається з TT, DT, CRM197, фрагменту C TT та білка D. 16. Імуногенна композиція згідно з будь-яким з попередніх пунктів, в якій кожний капсулярний сахарид N. meningitidis є окремо кон„югованим з окремим білком носія. 17. Імуногенна композиція згідно з будь-яким з попередніх пунктів, в якій принаймні один, два або три капсулярний(і) сахаридний(і) кон„югат(и) N. meningitidis є безпосередньо кон„югованим(и) з білком носія. 18. Імуногенна композиція згідно з пунктом 17, де Men W та/або MenY, MenW та/або MenC, MenY та/або MenC, або MenW та MenC та MenYє безпосередньо кон„югованими з білком носія. 19. Імуногенна композиція згідно з пунктом 17 або 18, в якій принаймні один, два або три сахаридні кон„югати N. meningitidis є безпосередньо кон„югованими при використанні CDAP. 20. Імуногенна композиція згідно з будь-яким з пунктів 1-19, в якій принаймні один, два або три капсулярні сахариди N. meningitidis є кон'югованими з білком носія через лінкер. 21. Імуногенна композиція згідно з будь-яким з попередніх пунктів, що включає капсулярні сахариди N. meningitidis принаймні з двох серогруп A, C, W135 та Y, кон„юговані з білком носія з одержанням капсулярного сахаридного кон„югату N. meningitidis, в якому середній розмір кожного сахариду N. meningitidis є більшим за 50 кДа, 75 кДа, 100 кДа, 110 кДа, 120 кДа або 130 кДа. 22. Імуногенна композиція згідно з будь-яким з попередніх пунктів, що додатково включає капсулярний сахарид H. influenzae b (Hib), кон'югованим з білком носія, де вказаний білок носія є необов„язково вибраним з групи, яка складається з TT, DT, CRM197, фрагменту C TT та білка D. 23. Імуногенна композиція згідно з пунктом 22, в якій Hib кон'югат є присутнім у більш низькій дозі, ніж доза кожного з принаймні двох додаткових бактеріальних сахаридних кон'югатів. 24. Імуногенна композиція згідно з будь-яким з пунктів 1-23, що включає препарат зовнішньої мембрани везикули або капсулярний сахарид N. meningitidis серогрупи B. 25. Вакцина, що включає імуногенну композицію згідно з будь-яким з пунктів 1-24 та фармацевтично-прийнятний наповнювач. 26. Вакцинний набір для одночасного або послідовного введення, що включає дві мультивалентні імуногенні композиції для забезпечення захисту хазяїна від захворювання, яке спричинене Bordetella pertussis, Clostridium tetani, Corynebacterium diphtheriae, Haemophilus influenzae та Neisseria meningitidis, при цьому вказаний набір включає перший контейнер, що містить: токсоїд правця (TT), токсоїд дифтерії (DT), та цільноклітинні або неклітинні компоненти коклюшу, 5 95238 6 та другий контейнер, що містить: імуногенну композицію згідно з будь-яким з пунктів 124. 27. Спосіб виробництва вакцини за п. 25, який включає стадію змішування імуногенної композиції за будь-яким з пп. 1-24 з фармацевтично-прийнятним наповнювачем. 28. Імуногенна композиція за будь-яким з пп. 1-24 для застосування в лікуванні або запобіганні захворювання, спричиненого інфекцією Neisseria meningitidis. 29. Застосування імуногенної композиції згідно з будь-яким з пунктів 1-24 у виробництві лікарського засобу для лікування або запобігання захворювань, спричинених інфекцією Neisseria meningitidis. Даний винахід відноситься до імуногенних композицій, що включають бактеріальні капсулярні сахариди, кон'юговані з білком носія, зокрема, до таких сахаридів N. meningitidis. Винахід додатково відноситься до вакцин та вакцинних наборів, що включають таю сахаридні кон'югати, способів одержання імуногенних композицій та вакцин та до застосування вакцинних та імуногенних композицій згідно з винаходом у терапії. Він також відноситься до способу імунізації проти інфекції при використанні сахаридних конюгатів та до застосування сахаридних кон'югатів у виробництві лікарського засобу. Neisseria meningitidis являє собою Грамнегативний патоген людини, який спричинює бактеріальні менінгіти. Було ідентифіковано 12 серогруп N. meningitidis (А. В, С, Н, І, K, L, 29E, W135, Φ, Υ та Z) на основі капсулярного сахариду організму Серогрупа А (МеnА) є найбільш загальною причиною епідемічного захворювання у частині Африки що розташована південніше Сахари Серогрупи В та С є відповідальними за більшість випадків у країнах, які розвиваються, в інших випадках захворювання викликається W135 та Υ. Імуногенні композиції, що включають сахариди N. meningitidis. кон'юговані з білками носія, ε відомими в області техніки; білок носія володіє відомим ефектом перетворення незалежного від Тклітин полісахаридного антигену на залежний від Т-каітин антиген, здатний до запуску відповіді імунної пам'яті. Наприклад, WO 02/58737 розкриває вакцину, що включає очищені капсулярні полісахариди з серогруп А, С. W135 та Υ N. meningitidis, кон'юговані з білком носія. Проте в цій заявці зазначається, що усі полісахариди будуть суттєво кон'югованими за допомогою одного й того самого шляху (за допомогою того самого лінкера до того самого білкового носія). Залишається необхідність у розробці удосконалених кон'югованих вакцин проти менінгітів, спричинених нейсерією. Даний винахід забезпечує менінгококові полicахаридні вакцини, в яких кон'югація кожного полісахариду є спеціалізованою (що є більш бажаним, ніж коли вона є однорідною) для досягнення одержання ефективної комбінаційної вакцини. Зокрема, є бажаним поєднувати певні менінгококові сахариди, кон'юговані з їх білковими носіями при високому значенні співвідношення сахаридбілок, з іншими при низькому співвідношенні. Таким чином, в одному аспекті даного винаходу забезпечується імуногенна композиція, що включає принаймні 2 відмінні капсулярні сахариди N. meningitidis, де один або більше є вибраним(ими) з першої групи, яка складається з МеnА, МеnС, MenY та MenW, який/які є кон'югований(і) з білком(білками) носія, де співвідношення сахарид:білок (ваг./ваг.) знаходиться в межах від 1:2 до 1:5, один або більше відмінних сахаридів є вибраним(и) з другої групи, яка складається з MenA, MenC, MenY та MenW, який/які є кон'югованим(и) з білковими носіями, де співвідношення сахарид:білок (ваг./ваг.) знаходиться в межах від 5:1 до 1:1,99. У MenW вакцині співвідношення MenW сахариду до білка носія може знаходитися в межах 5:11:1,99, 2:1-1:1,99, 1,5:1-1:1,8, 1:1-1:1,7, 1:1,2-1:1,6 або 1:1,4-1:1,5 (ваг/ваг.). У MenY вакцині співвідношення MenY сахариду до білка носія може бути в межах 5:1-1:1,99, 2:1-1:1,99, 1,5:1-1:1,9, 1:1-1:1,8, 1:1,1-1:1,6 або 1:1,3-1:1,4 (ваг./ваг). У МеnА вакцині співвідношення MenА сахариду до білка носія може знаходитися в межах 1:2-1:5, 1:2,4-1:4, 1:2,71:3,5 або 1:2,9-1:3,1 (ваг./ваг). У MenC вакцині співвідношення MenС сахариду до білка носія може знаходитися в межах 5:1-1:1,99, 2:1-1:1,99, 1,5:1-1:1,8, 1,3:1-1:1,6, 1,2:1-1:1,4 або 1,1:1-1:1,2 (ваг./ваг.) або 1:2-1:5, 1:2,5-1:4,5, 1:2,7-1:4,3, 1:31:4 або 1:3,3-1:3,5 (ваг/ваг). Співвідношення сахариду та білка носія (ваг./ваг.) у кон'югаті може бути визначене при використанні простерилізованого кон'югату. Кількість білка визначається при використанні реакції Лоурі (наприклад, Lowry та ін. (1951) J. Biol. Chem. 193, 265-275 або Peterson та ін. Analytical Biochemistry 100, 201-220 (1979)), а кількість сахариду визначається при використанні ICP-OES (спектроскопії на основі індукованого плазмооптичного випромінювання) для MenA, DMAP аналізу для МеnС та резорцинового аналізу для MenW та MenY (Monsigny та ін. (1988) Anal. Biochem. 175, 525-530). Часто сахариди, кон'юговані за допомогою лінкера, мають більш високий вміст білка носія, ніж тоді, коли вони є безпосередньо зв'язаними з білком носія. У МеnАС вакцині, наприклад, МеnА може бути кон'югованим за допомогою лінкера, а МеnС -безпосередньо. У MenCY вакцині МеnС може бути кон'югований за допомогою лінкера, a MenY - безпосередньо. У MenACWY вакцині Me А може бути кон'югований за допомогою лінкера, a MenCWY - безпосередньо, або МеnАС може бути кон'югований за допомогою лінкера, a MenWY безпосередньо. У додатковому аспекті винаходу забезпечується імуногенна композиція, що включає принаймні два відмінні сахариди, кон'юговані окремо до того самого типу білка носія (наприклад, DT, CRM197, білок D або ТТ), де один або більше сахарид(и) є кон'югованим(и) з білком носія, де спів 7 відношення сахарид:білок (ваг./ваг.) знаходиться в межах від 1:2 до 1:5, та один або більше відмінних сахаридів є кон'югованим(и) з білком носія, де співвідношення сахарид:білок (ваг./ваг.) знаходиться в межах від 5:1 до 1:1,99. Наприклад, в МеnАС вакцині, МеnА може бути кон'югованим з білком носія при співвідношенні сахарид: білок (ваг./ваг.) в межах 1:2-1:5, а МеnС є кон'югованим з білком носія при співвідношенні сахарид:білок (ваг./ваг.) в межах 5:1-1:1,99. У MenCY вакцині МеnС може бути кон'югованим з білком носія при співвідношенні сахарид:білок (ваг./ваг.) в межах 1:2-1:5, a MenY може бути кон'югованим з білком носія при співвідношенні сахарид:білок (ваг./ваг.) в межах 5:1-1:1,99. У MenACWY вакцині МеnАС може бути кон'югованим з білком носія при співвідношенні сахарид:білок (ваг./ваг.) в межах 1:2-1:5, a MenWY може бути кон'югованим з білком носія при співвідношенні сахарид:білок (ваг./ваг.) в межах 5:1-1:1,99, або МеnА може бути кон'югованим з білком носія при співвідношенні сахарид:білок (ваг./ваг.) в межах 1:2-1:5, a MenCWY може бути кон'югованим з білком носія при співвідношенні сахарид:білок (ваг./ваг.) в межах 5:1-1:1,99. Згідно з додатковим аспектом винаходу забезпечується спосіб імунізації хазяйського організму людини проти захворювання, спричиненого Neisseria meningitidis, що включає введення хазяїну імунопротективної дози імуногенної композиції або вакцини згідно з винаходом. Згідно з додатковим аспектом винаходу забезпечується імуногенна композиція згідно з винаходом для застосування у лікуванні або запобіганні захворювання, спричиненого Neisseria meningitidis. Згідно з додатковим аспектом винаходу забезпечується застосування імуногенної композиції або вакцини згідно з винаходом у виробництві лікарського засобу для лікування або запобігання захворювань, спричинених Neisseria meningitidis. Фігура 1-А - Гістограма, яка показує GMC відповіді в анти-MenY ELISA. ENYTT012 являє собою MenY-TT кон'югат, одержаний з нативного MenY полісахариду. ENYTT014 являє собою MenY-TT кон'югат, одержаний з мікропсевдозрідженого MenY полісахариду, який піддавали 40 циклам мікропсевдозрідження. ENYTT015bis являє собою MenY-TT кон'югат, одержаний з мікропсевдозрідженого MenY полісахариду, який піддавали 20 циклам мікропсевдозрідження. - В - Гістограма, яка показує GMC відповіді в анти-MenY SBA аналізі. ENYTT012 являє собою MenY-TT кон'югат, одержаний з мікропсевдозрідженого MenY полісахариду, який піддавали 40 циклам мікропсевдозрідження. ENYTT014 являє собою MenY-TT кон'югат, одержаний з мікропсевдозрідженого MenY полісахариду, який піддавали 40 циклам мікропсевдозрідження. ENYTT015bis являє собою MenY-TT кон'югат, одержаний з мікропсевдозрідженого MenY полісахариду, який піддавали 20 циклам мікропсевдозрідження. В одному аспекті даного винаходу забезпечується імуногенна композиція, що включає принаймні 2 відмінні капсулярні сахариди N. meningitidis, де один або більше є вибраним(и) з першої групи, 95238 8 яка складається з МеnА (капсулярний сахарид N. meningitidis серогрупи А), МеnС (капсулярний сахарид N. meningitidis серогрупи С), MenY (капсулярний сахарид N. meningitidis серогрупи Y), та MenW (капсулярний сахарид N. meningitidis серогрупи W), який/які є кон'югованим(и) з білком(ами) носія, де співвідношення сахарид:білок (ваг/ваг.) знаходиться в межах від 1:2 до 1:5, та один або більше відмінних сахаридів є вибраним(и) з другої групи, яка складається з МеnА, МеnС, MenY та MenW, який/які є безпосередньо кон'югованим(и) з білком(ами) носія, де співвідношення сахарид:білок (ваг./ваг.) знаходиться в межах від 5:11:1,99. Зокрема, композиція включає принаймні два відмінні капсулярні сахариди N. meningitidis, де один або більше є вибраним(и) з першої групи, яка складається з МеnА та МеnС який/які є кон'югованим(и) є кон'югованим(и) з білком(ами) носія, де співвідношення сахарид:білок (ваг./ваг.) знаходиться в межах від 1:2 до 1:5, та один або більше відмінних сахаридів є вибраним(и) з другої групи, яка складається з МеnС, MenY та MenW, який/які є безпосередньо кон'югованим(и) з білком(ами) носія, де співвідношення сахарид:білок (ваг./ваг.) знаходиться в межах від 5:1-1:1,99. В одному аспекті MenW сахаридна імуногенна композиція містить Men W сахарид, де співвідношення MenW сахариду до білка носія знаходиться в межах 5:1-1:1,99, 2:1-1:1,99, 1,5:1-1:1,8, 1:1-1:1,7, 1:1,2-1:1,6 або 1:1,4-1:1,5 (ваг./ваг). У додатковому аспекті імуногенна композиція містить MenY сахарид, де співвідношення MenY сахариду до білка носія знаходиться в межах 5:1-1:1,99, 2:1-1:1,99, 1,5:1-1:1,9, 1:1-1:1,8, 1:1,1-1:1,6 або 1:1,3-1:1,4 (ваг./ваг.). У додатковому аспекті імуногенна композиція включає МеnА сахарид, де співвідношення МеnА сахариду до білка носія знаходиться в межах 1:2-1:5, 1:2,4-1:4, 1:2,7-1:3,5 або 1:2,9-1:3,1 (ваг./ваг.) або у межах 5:1-1:1,99, 2:1-1:1,99, 1,5:11:1,8, 1,3:1-1:1,6, 1,2:1-1:1,4 або 1,1:1-1:1,2 (ваг./ваг.). У додатковому аспекті імуногенна композиція включає МеnС сахарид, де співвідношення МеnС сахариду до білка носія знаходиться в межах 5:1-1:1,99, 2:1-1:1,99, 1,5:1-1:1,8, 1,3:1-1:1,6, 1,2:1-1:1,4 або 1,1:1-1:1,2 (ваг./ваг.) або у межах 1:2-1:5, 1:2,5-1:4,5, 1:2,7-1:4,3, 1:3-1:4 або 1:3,31:3,5 (ваг./ваг.). Зокрема, перша група може складатися з МеnА та МеnС, а друга група складається з МеnС, MenY та MenW. Окремими втіленнями винаходу є імуногенні композиції, що включають: МеnА капсулярний сахарид, де співвідношення MenA сахариду до білка носія знаходиться в межах 1:2-1:5, 1:2,4-1:4, 1:2,7-1:3,5 або 1:2,9-1:3,1 (ваг/ваг.) [який може бути необов'язково кон'югованим за допомогою лінкера з білком носія], та МеnС капсулярний сахарид, де співвідношення MenС сахариду до білка носія знаходиться в межах 5:1-1:1,99, 2:11:1,99, 1,5:1-1:1,8, 1,3:1-1:1,6, 1,2:1-1:1,4 або 1,1:11:1,2 (ваг./ваг.) [який може бути необов'язково безпосередньо кон'югованим з білком носія]; МеnС капсулярний сахарид, де співвідношення MenС сахариду до білка носія знаходиться в межах 1:21:5, 1:2,4-1:4, 1:2,7-1:3,5 або 1:2,9-1:3,1 (ваг./ваг.) 9 [який може бути необов'язково кон'югованим за допомогою лінкера з білком носія], та MenY капсулярний сахарид, де співвідношення MenY сахариду до білка носія знаходиться в межах 5:1-1:1,99, 2:1-1:1,99, 1,5:1-1:1,8, 1,3:1-1:1,6, 1,2:1-1:1,4 або 1,1:1-1:1,2 (ваг./ваг.) [який може бути необов'язково безпосередньо кон'югованим з білком носія]; МеnА та МеnС капсулярні сахариди, де співвідношення MenА та С сахариду білка(ів) носія знаходиться в межах 1:2-1:5, 1:2,4-1:4, 1:2,7-1:3,5 або 1:2,9-1:3,1 (ваг./ваг.) [та який може бути необов'язково кон'югованим за допомогою лінкера з білком(ами) носія], та MenY та Men W капсулярні сахариди, де співвідношення Men Y та W сахариду до білка носія знаходиться в межах 5:1-1:1,99, 2:11:1,99, 1,5:1-1:1,8, 1,3:1-1:1,6, 1,2:1-1:1,4 або 1,1:11:1,2 (ваг./ваг.) [який може бути необов'язково безпосередньо кон'югованим з білком(ами) носія]; МеnА капсулярний сахарид, де співвідношення MenА сахариду до білка носія знаходиться в межах 1:2-1:5, 1:2,4-1:4, 1:2,7-1:3,5 або 1:2,9-1:3,1 (ваг./ваг.) [який може бути необов'язково кон'югованим за допомогою лінкера з білком носія], та МеnС, MenY та MenW капсулярні сахариди, де співвідношення MenΥ та W та С сахариду до білка носія знаходиться в межах 5:1-1:1,99, 2:1-1:1,99, 1,5:1-1:1,8, 1,3:1-1:1,6, 1,2:1-1:1,4 або 1,1:1-1:1,2 (ваг./ваг.) [та який може бути необов'язково кон'югованим за допомогою лінкера з білком(ами) носія]. У будь-якому з цих втілень може також включатися Hib кон'югат, який є зв'язаним з білкомносія (див. список носіїв вище та нижче, наприклад, ТТ, та для співвідношень сахарид:білок) безпосередньо або за допомогою лінкера. Термін «сахарид» у цьому описі може позначати полісахарид або олігосахарид та включає обидва. Полісахариди ізолюють з бактерій або ізолюють з бактерій та в деякій мірі класифікують їх за розміром за допомогою відомих способів (див., наприклад, ЕР497524 та ЕР497525) та, необов'язково, за допомогою мікропсевдозрідження. Полісахариди можуть бути зменшені за розмірами для того, щоб знизити в'язкість у зразках полісахариду та/або для підвищення здатності до фільтрації для кон'югованих продуктів. Олігосахариди мають низьку кількість повторюваних одиниць (типово 5-30 повторюваних одиниць) та є типово гідролізованими полісахаридами. Кожний капсулярний сахарид N. meningitidis (та/або Hib) може бути кон'югований з білком носія, незалежно вибраним з групи, яка складається з ТТ, DT, CRM197, фрагменту С ТТ та білка D. Більш повний список білкових носіїв, що можуть використовуватися у кон'югатах згідно з винаходом, представлений нижче. Хоча один або більше капсулярних сахаридів N. meningitidis (та/або Hib) можуть бути кон'юговані з різними білками носіїв, в одному втіленні винаходу їх кон'югують до того самого білка носія. Наприклад, вони усі можуть бути кон'юговані з тим самим білком носія, вибраним з групи, яка складається з ТТ, DT, CRM197, фрагменту С ТТ та білка D. У цьому контексті CRM197 та DT можуть вважатися тим самим білком носія, оскільки вони відрізняються тільки однією амінокислотою. У будь-якому втіленні усі наявні 95238 10 капсулярні полісахариди (та/або Hib) N. meningitidis є кон'югованими з ТТ. Якщо білок носія є таким самим для двох або більше сахаридів у композиції, то сахарид може бути кон'югованим до тієї самої молекули білка носія (молекули носія мають 2 або більше сахариди, кон'юговані до нього) [див., наприклад, WO 04/083251; наприклад, один білок носія може бути кон'югований до МеnА та МеnС; МеnА та MenW; MenA та MenY; МеnС та MenW; МеnС та MenY; MenW та MenY; МеnА, МеnС та MenW; МеnА, МеnС та MenY; МеnА, MenW та MenY; МеnС, MenW та MenY; МеnА, МеnС, MenW та MenY; Hib та МеnА; Hib та МеnС; Hib та MenW; або Hib та MenY]. Альтернативно, кожний із сахаридів може бути окремо кон'югований до різних молекул білка носія (кожна молекула білкового носія має тільки один тип сахариду, кон'югованого до неї). Імуногенні композиції згідно з першим аспектом винаходу можуть також мати будь-яку або усі додаткові характеристики другого аспекту винаходу та навпаки. У другому аспекті згідно з винаходом представлена імуногенна композиція, що включає принаймні два різні сахариди, кон'юговані окремо до того самого типу білка носія, де один або більше сахарид(ів) є кон'югованим(и) з білком носія, де співвідношення сахарид:білок (ваг/ваг.) знаходиться в межах від 1:2 до 1:5 [високе співвідношення], та один або більше відмінний(их) сахарид(ів) є кон'югованим(и) з білком(ами) носія, де співвідношення сахарид:білок (ваг/ваг.) знаходиться в межах від 5:1-1:1,99 [низьке співвідношення]. Під виразом «кон'юговані окремо до того самого типу білка носія» розуміють, що сахариди є кон'югованими до того самого носія індивідуально (наприклад, МеnА є кон'югованим до токсоїда правця через аміногрупу на токсоїді правця, а МеnС є кон'югованим до токсоїда правця через карбоксигрупу на іншій молекулі токсоїда правця). Капсулярний(і) сахарид(и) може(уть) бути кон'югований(і) до того самого білка носія, що є незалежно вибраним з групи, яка складається з ТТ, DT, CRM197, фрагменту С ТТ та білка D. Більш повний список білкових носіїв, які можуть використовуватися у кон'югатах згідно з винаходом, представлений нижче. У цьому контексті CRM197 та DT можуть вважатися тим самим білком носія, оскільки вони відрізняються тільки однією амінокислотою. У будь-якому втіленні усі наявні капсулярні сахариди є кон'югованими з ТТ. Сахариди для високого співвідношення (1:21:5) та низького співвідношення (5:1-1:1,99) Можуть бути вибрані з групи, яка складається з: капсулярного сахариду N. meningitidis серогрупи А (МеnА), капсулярного сахариду N. meningitidis серогрупи С (МеnС), капсулярного сахариду N. meningitidis серогрупи Υ (MenY), капсулярного сахариду N. meningitidis серогрупи W (MenW), капсулярного сахариду Н. influenzae типу b (Hib), капсулярного сахариду групи І Streptococcus групи В, капсулярного сахариду групи II Streptococcus групи В, капсулярного сахариду групи III Streptococcus групи В, капсулярного сахариду групи IV Streptococcus групи В, капсулярного сахариду гру 11 пи V Streptococcus групи В, капсулярного сахариду типу 5 Staphylococcus aureus, капсулярного сахариду типу 8 Staphylococcus aureus, Vi сахариду з Salmonella typhi, LPS N. meningitidis (такого, як L3 та/або L2), LPS Μ. catarrhalis, LPS Η. influenzae та будь-якогоз капсулярних пневмококових сахаридів, таких, як: 1, 2, 3, 4, 5, 6А, 6В, 7F, 8, 9N, 9V, 10А, 11А, 12F, 14, 15В, 17F, 18С, 19А, 19F, 20, 22F, 23F або 33F. В одному втіленні імуногенна композиція згідно з винаходом складається або включає два або більше різні сахариди з того самого роду бактерій (наприклад, Neisseria, Streptococcus, Staphylococcus або Haemophilus). В одному втіленні, МеnА являє собою сахарид високого співвідношення, в іншому - MenW є сахаридом низького співвідношення; в іншому втіленні MenY є сахаридом низького співвідношення; в іншому - МеnС є сахаридом високого співвідношення; в іншому - МеnС є сахаридом низького співвідношення; в іншому - Hib є сахаридом високого співвідношення. Вакцини, які включають MenA/С можуть бути такими високого/низького співвідношення, відповідно, вакцини, які включають MenC/Y можуть бути такими високого/низького співвідношення, відповідно, вакцини, які включають MenA/C/W/Y високого/високого/низького/низького співвідношення, відповідно, а вакцини, які включають MenA/C/W/Y, можуть бути такими високого/низького/низького/низького співвідношення, відповідно. Сахариди згідно з винаходом (зокрема, сахариди N. meningitidis та/або капсулярний сахарид Hib), що включені у фармацевтичні (імуногенні) композиції згідно з винаходом є кон'югованими з білком носія, таким, як токсоїд правця (ТТ), фрагмент С токсоїда правця, нетоксичні мутанти токсину правця [примітка: усі такі варіанти ТТ розглядаються як такі, що мають той самий тип білка носія для цілей даного винаходу], токсоїд дифтерії (DT), CRM197, інші нетоксичні мутанти дифтерійного токсину [такі, як CRM176, CRM197, CRM228, CRM45 (Uchida та ін. J. Biol. Chem. 218; 3838-3844, 1973); CRM9, CRM45, CRM102, CRM103 та CRM107 та інші мутації, описані Nicholls та Youle в Genetically Engineered Toxins, ред.: Frankel, Maecel Dekker Inc, 1992; делеція або мутація Glu-148 на Asp, Gln або Ser та/або Ala 158 на Gly та та інші мутації, розкриті в US 4709017 або US 4950740; мутації принаймні одного або більше залишків Lys 516, Lys 526, Phe 530 та/або Lys 534 та інші мутації, розкриті в US 5917017 або US 6455673; або фрагмент, розкритий в US 5843711] (примітка: усі такі варіанти DT розглядаються як такі, що мають той самий тип білка носія для цілей даного винаходу), пневмококовий пневмолізин (Kuо та ін. (1995) Infect Immun 63; 2706-13), ОМРС (білок зовнішньої мембрани менінгококу, який звичайно екстрагують з N. meningitidis серогрупи В ЕР0372501), синтетичні пептиди (ЕР0378881, ЕР0427347), білки теплового шоку (WO 93/17712, WO 94/03208), білки коклюшу (WO 98/58668, ЕР0471177), цитокіни, лімфокіни, ростові фактори або гормони (WO 91/01146), штучні білки, що включають множинні епітопи CD4+ Т-клітин, що мають походження від антигенів різноманітних 95238 12 патогенів (Falugi та ін. (2001) Eur J Immunol 31; 3816-3824) таких, як N19 білок (Baraldoi та ін. (2004) Infect Immun 72; 4884-7), пневмококовий поверхневий білок PspA (WO 02/091998), білків, які поглинають залізо (WO 01/72337), токсину А або В С. difficile (WO 00/61761) або білка D (EP594610 та WO 00/56360). В одному втіленні імуногенна композиція згідно з винаходом використовує той самий тип білка носія (незалежно) принаймні у двох, трьох, чотирьох або у кожному із сахаридів (наприклад, у капсулярних полісахаридах N. meningitidis та/або Hib), що містяться в них. У втіленні, де є присутніми Hib та капсулярні полісахариди N. meningitidis, Hib може бути кон'югованим до того самого типу білка носія, що й принаймні два, три, чотири або кожний із сахаридів N. meningitidis. Наприклад, 2, 3 або 4 сахариди N. meningitidis (MenA, C, Y, W) є незалежно кон'югованими до токсоїда правця для утворення 2, 3 або 4 кон'югатів, та необов'язково Hib є також кон'югованим до ТТ. В одному втіленні імуногенна композиція згідно з винаходом включає сахарид N. meningitidis, кон'югований з білком носія, вибраним з групи, яка складається з ТТ, DT, CRM197, фрагменту С ТТ та білка D. В одному втіленні імуногенна композиція згідно з винаходом включає Hib сахарид, кон'югований з білком носія, вибраним з групи, яка складається з ТТ, DT, CRM197, фрагменту С ТТ та білка D. Імуногенна композиція згідно з винаходом необов'язково включає принаймні один менінгококовий сахаридний кон'югат (наприклад, MenA; MenC; MenW; MenY; MenA та MenC; MenA та MenW; MenA та MenY; MenC та MenW; MenС та MenY; MenW та MenY; MenA, MenC та MenW; MenA, MenC та MenY; MenA, MenW та MenY; MenC, MenW та MenY або MenA, MenC, MenW та MenY), що має співвідношення Men сахариду до білка носія від 1:5 до 5:1, від 1:2 до 5:1, від 1:0,5 до 1:2,5 або від 1:1,25 до 1:2,5 (ваг/ваг). Імуногенна композиція згідно з винаходом необов'язково включає Hib сахаридний кон'югат, що має співвідношення Hib до білка носія від 1:5 до 5:1; від 1:2 до 2:1; від 1:1 до 1:4; від 1:2 до 1:3,5 або приблизно або точно 1:2,5 або 1:3 (ваг./ваг). В одному втіленні імуногенна композиція згідно з винаходом включає сахаридний(і) кон'югат(и) N. meningitidis та/або кон'югат на основі сахариду Hib, де сахарид(и) N. meningitidis та/або Hib сахарид є кон'югованим з білком носія через лінкер, наприклад, біфункціональний лінкер. Лінкер необов'язково є гетерофункціональним або гомофункціональним та має, наприклад, реактивну аміногрупу та реактивну групу карбонової кислоти, 2 реактивні аміногрупи або дві реактивні групи карбонової кислоти. Лінкер містить, наприклад, від 4 до 20, від 4 до 12, від 5 до 10 атомів вуглецю. Можливий лінкер являє собою ADH. Інші лінкери включають В-пропіонамідо (WO 00/10599), нітрофенілетиламін (Gever та ін. (1979) Med. Microbiol. Immunol. 165; 171-288), галоалкілгаліди (US4057685), глікозидні зв'язки (US4673574, US4808700), гександіамін та 6-амінокапронову кислоту (US4459286). 13 Сахаридні кон'югати, присутні в імуногенних композиціях згідно з винаходом, можуть бути одержані за допомогою відомих методик злиття. Спосіб кон'югації може базуватися на активації сахариду за допомогою тетрафторборату 1-ціано-4диметиламіно піридинію (CDAP) з утворенням ціанатного естеру. Активований сахарид може, таким чином, сполучатися безпосередньо або через спейсерну (лінкерну) групу з аміногрупою на білку носія. Наприклад, спейсер може являти собою цистамін або цистеамін, що забезпечує утворення тіолованого полісахариду, який може бути злитий з носієм через тіоефірний зв'язок, який одержують в результаті реакції з малеїмід-активованим білком носія (наприклад, при використанні GMBS) або з гомоацетилованим білком носія (наприклад, при використанні йодацетаміду або Nсукцинімідилбромацетатбромацетату). Необов'язково, ціанатний естер (необов'язково, одержаний за допомогою хімічної реакції при використанні CDAP) сполучають з гександіаміном або ADH, та амінодериватизований сахарид кон'югують з білком носія при використанні хімічного зв'язку карбодііміду (наприклад, EDAC або EDC) за допомогою карбоксильної групи на білковому носії. Такі кон'югати описуються в опублікованій заявці РСТ WO 93/15760 Uniformed Services University, WO 95/08348 та WO 96/29094. Інші прийнятні методики використовують карбіініди, гідразиди, активні естери, норборан, пнітробензойну кислоту, N-гідроксисукцинімід. Багато з них є описаними в WO 98/42721. Кон'югація може втягувати карбонільний лінкер, який може утворюватися шляхом реакції вільної гідроксильної групи сахариду з CDI (Bethell та ін. J. Biol. Chem. 1979, 254; 2572-4, Hearn та ін. J. Chromatogr. 1981. 218; 509-18), після чого проводять реакцію з білком для одержання карбаматного зв'язку. Це може передбачати відновлення аномерного кінця до первинної гідроксильної групи, необов'язкову реакцію захисту/зняття захисту з первинної гідроксильної групи за допомогою CDI з утворенням CDI карбаматної проміжної сполуки та злиттям CDI карбаматної проміжної сполуки з аміногрупою на білку. Кон'югати можуть також бути одержані при використанні методик безпосереднього відновного амінування, як описано в US 4365170 (Jennings) та US 4673574 (Anderson). Інші способи є описаними в ЕР-0-161-188, ЕР-208375 та ЕР-0-477508. Додатковий спосіб втягує злиття активованого за допомогою ціаногенброміду (або CDAP) сахариду, дериватизованого при використанні гідразиду адипінової кислоти (ADH), з білком носія шляхом карбодіімідної конденсації (Chu С. та ін. Infect. Immunity, 1983 245 256), наприклад, при використанні EDAC. В одному втіленні гідроксильна група (необов'язково активована гідроксильна група, наприклад, гідроксильна група, активована ціанатним естером) на сахариді зв'язується з аміногрупою або карбоксильною групою на білку, або безпосередньо або опосередковано (за допомогою лінкера). Коли є наявним лінкер, то гідроксильна група на сахариді необов'язково зв'язується з аміногру 95238 14 пою на лінкері, наприклад, за допомогою CDAP кон'югації. Додаткова аміногрупа у лінкері (наприклад, ADH) може бути кон'югована з групою карбонової кислоти на білку, наприклад, при використанні карбодіімідного зв'язку, наприклад, при використанні EDAC. В одному втіленні Hib або капсулярний(і) сахарид(и) N. meningitidis (або сахарид взагалі) кон'югують з лінкером перед тим, як лінкер кон'югують з білком носія. Альтернативно, лінкер може бути кон'югованим з носієм перед кон'югацією з сахаридом. В загальному випадку для злиття/кон'югації можуть використовуватися наступні типи хімічних груп на білку носія: A) Карбоксильна група (наприклад, через аспарагінову або глутамінову кислоту). В одному втіленні ця група зв'язується з аміногрупами на сахаридах безпосередньо або з аміногрупою на лінкері за допомогою карбодіімідного зв'язку, наприклад, при використанні EDAC. B) Аміногрупа (наприклад, через лізин). В одному втіленні ця група зв'язується з карбоксильними групами на сахаридах безпосередньо або з карбоксильною групою на лінкері за допомогою карбодіімідного зв'язку, наприклад, при використанні EDAC. В іншому втіленні ця група зв'язується з гідроксильними групами, активованими за допомогою CDAP або CNBr, на сахаридах безпосередньо або з такими групами на лінкері; з сахаридами або лінкерами, які мають альдегідну групу; з сахаридами або лінкерами, що мають групу сукцинімідного естеру. C) Сульфгідрильна група (наприклад, через цистеїн). В одному втіленні ця група зв'язується з бром- або хлорацетилованими сахаридами або лінкером за допомогою малеїмідного зв'язку. В одному втіленні цю групу активують/модифікують при використанні біс-діазобензидину. D) Гідроксильна група (наприклад, через тирозин). В одному втіленні цю групу активують/модифікують при використанні бісдіазобензидину. E) Імідазолільна група (наприклад, через гістидин). В одному втіленні цю групу активують/модифікують при використанні бісдіазобензидину. F) Гуанідильна група (наприклад, через аргінін). G) Індолільна група (наприклад, через триптофан). В загальному випадку, наступні групи на сахариді можуть використовуватися для злиття: ОН, СООН або NH2. Альдегідні групи можуть бути одержані після різноманітних способів обробки, відомих в області техніки, а саме: перйодат, кислотний гідроліз, пероксид водню, тощо Підходи прямого злиття: Сахарид-ОН + CNBr або CDAP → ціанатний естер + NH2-білок → кон'югат Сахарид-альдегід + NН2-білок → Основа Шиффа + NaCNBH3 → кон'югат Сахарид-СООН + NН2-білок + EDAC → кон'югат Сахарид-ІМН2 + СООН-білок + EDAC → кон'югат 15 Підходи опосередкованого злиття через спейсер (лінкер): Сахарид-ОН + CNBr або CDAP → ціанатний естер + NH2 →NH2 → сахарид → NH2 + СООНбілок + EDAC → кон'югат Сахарид-ОН + CNBr або CDAP → ціанатний естер + NH2 → SH → сахарид→ SH + SH-білок (нативний білок з незахищеним цистеїном або одержаний після модифікації аміногруп білка, наприклад, за допомогою SPDP) → сахарид-S-Sбілок Сахарид-ОН + CNBr або CDAP → ціанатний естер + NH2 → SH → сахарид → SH + малеїмідбілок(модифікація аміногруп) → кон'югат Сахарид-СООН + EDAC + NH2 → NH2 → сахарид → NH2 + EDAC + СООН-білок → кон'югат Сахарид-СООН + EDAC+ NH2 → SH → сахарид → SH + SH-білок (нативний білок з незахищеним цистеїном або одержаний після модифікації аміногруп білка, наприклад, за допомогою SPDP) → caxapnfl-S-S-білок Сахарид-СООН + EDAC+ NH2 → SH → сахарид → SH + малеїмід-білок (модифікація аміногруп) → кон'югат Сахарид-Альдегід + NH2 → NH2 → сахарид → NH2 + EDAC + СООН-білок → кон'югат Примітка: замість EDAC, як описано вище, можна застосовувати будь-який прийнятний карбодіімід. Підсумовуючи зазначене вище, можна сказати, що типи хімічної групи білка носія, які можуть в загальному випадку використовуватися для злиття із сахаридом, являють собою аміногрупи (наприклад, на залишках лізину), СООН групи (наприклад, на залишках аспарагінової та глутамінової кислоти) та SH групи (якщо це доступно) (наприклад, на цистеїнових залишках). В одному втіленні Hib сахарид, якщо він присутній, кон'югують з білком носія при використанні CNBr або CDAP, або комбінації CDAP та карбодіімідного зв'язку (такого, як EDAC), або комбінації CNBr та карбодіімідного зв'язку (такого, як EDAC). Необов'язково Hib кон'югують при використанні CNBr та карбодіімідного зв'язку, необов'язково EDAC. Наприклад, CNBr використовують для приєднання сахариду та лінкера, а потім карбодіімідний зв'язок використовують для приєднання лінкера до білкового носія. В одному втіленні принаймні один з капсулярних полісахаридів N. meningitidis (або сахарид в загальному випадку) безпосередньо кон'югують з білком носія; необов'язково MenW та/або MenY та/або МеnС сахарид(и) безпосередньо кон'югують з білком носія. Наприклад MenW; MenY; MenC; MenW та MenY; MenW та МеnС; MenY та МеnС; або MenW, MenY та МеnС безпосередньо зв'язуються з білком носія. Необов'язково, коли принаймні один з капсулярних полісахаридів N. meningitidis безпосередньо кон'югують за допомогою CDAP. Наприклад MenW; MenY; MenC; MenW та MenY; MenW та MenC; MenY та МеnС; або MenW, MenY та МеnС безпосередньо зв'язуються з білком носія за допомогою CDAP (див WO 95/08348 та WO 96/29094). В одному втіленні усі 95238 16 капсулярні полісахариди N. meningitidis кон'югують до токсоїда правця. Необов'язково, співвідношення MenW та/або Υ сахариду до білка носія складає від 1:0,5 до 1:2 (ваг/ваг.), та/або співвідношення МеnС сахариду до білка носія складає від 1:0,5 до 1:4 або від 1:0,5 до 1:1,5 (ваг/ваг.), зокрема, коли ці сахариди є безпосередньо зв'язаними білком, необов'язково при використанні CDAP. В одному втіленні принаймні один з капсулярних сахаридів N. meningitidis (або сахарид в загальному випадку) є кон'югованим до білка носія за допомогою лінкера, наприклад, біфункціонального лінкера. Лінкер є необов'язково гетерофункціональним або гомобіфункціональним та має, наприклад, реактивну аміногрупу та реактивну групу карбонової кислоти, 2 реактивні аміногрупи або 2 реактивні групи карбонової кислоти. Лінкер має, наприклад, від 4 до 20, від 4 до 12, від 5 до 10 атомів вуглецю. Можливий лінкер являє собою ADH. В одному втіленні МеnА; МеnС; або МеnА та МеnС є кон'югованими з білком носія (наприклад, токсоїдом правця) за допомогою лінкера. В одному втіленні принаймні один з капсулярних сахаридів N. meningitidis (або сахарид в загальному випадку) є кон'югованим з білком носія за допомогою лінкера при використанні CDAP та EDAC. Наприклад, МеnА; МеnС; або МеnА та МеnС кон'юнують з білком за допомогою лінкера (наприклад, такого, що має дві групи гідразино на своїх кінцях, такого, як ADH) при використанні CDAP та EDAC, як описано вище. Наприклад, CDAP використовується для кон'югації сахариду до лінкера, a EDAC використовується для кон'югації лінкера до білка. Необов'язково, кон'югація за допомогою лінкера приводить до одержання співвідношення сахариду до білка носія від 1:0,5 до 1:6; від 1:1 до 1:5 або від 1:2 до 1:4 для МеnА; МеnС; або МеnА та МеnС. Додатковий фактор у комбінаційній вакцині, яка включає різноманітні сахариди, кон'юговані з тим самим носієм, є формування імунної супресії носія: можна використовувати дуже багато носіїв, і імунна відповідь може бути послаблена. При однорідному підході до кон'югації носій буде присутній у подібній суміші В- та Т-клітинних епітопів до імунної системи. Проте, якщо кон'югація має місце у різних хімічних групах у межах білка носія для одного сахариду проти іншого, то білкові носії, можливо, будуть в деякій мірі різними у тому, як вони представляються імунній системі. Згідно з цим в окремому втіленні винаходу забезпечується імуногенна композиція, яка включає принаймні 2 різні сахариди, кон'юговані окремо до того самого типу білка носія (наприклад, токсоїда правця), де один або більше сахарид(ів) є кон'югованим(и) з білком носія за допомогою першого типу хімічної групи на білковому носії, а один або більше сахарид(ів) є кон'югованим(и) з білком носія за допомогою другого (відмінного) типу хімічної групи білкового носія. Перший та другий типи хімічної групи можуть бути присутніми у білковому носії на першому та другому наборах амінокислот білкового носія, що 17 взаємно виключають один одного (наприклад, певні залишки аспарагінової/глутамінової кислоти в одному наборі та певні залишки лізину у другому). Один сахарид може бути кон'югованим з карбоксильною групою на носії, а інший, наприклад, з аміногрупою. Така кон'югація може втягувати кон'югацію на окремих В- та/або Т-клітинних епітопах для кожного відмінного кон'югату. Наприклад, у МеnАС вакцині МеnА може бути зв'язаним з хімічною групою першого типу (такої, як карбоксил) на білку носія, а МеnС є зв'язаним з такою другого типу (такою, як аміногрупа). В MenCY вакцині МеnС може бути зв'язаним з хімічною групою першого типу (такої, як карбоксил) на білку носія, a MenY є зв'язаним з такою другого типу (такою, як аміногрупа). В MenACWY вакцині МеnАС може бути зв'язаним з хімічною групою першого типу (такою, як карбоксил) на білку носія, a MenWY є зв'язаним з такою другого типу (такою, як аміногрупа), або МеnА може бути зв'язаним з хімічною групою першого типу (такою, як карбоксил) на білку носія, a MenCWY є зв'язаним з такою другого типу (такою, як аміногрупа). В одному втіленні два кон'югати містять той самий сахарид, приєднаний до того самого носія, але за допомогою відмінних хімічних зв'язків кон'югації. В альтернативному втіленні два різні сахариди є кон'югованими до різних груп на білковому носії. Під виразом «кон'юговані окремо до того самого типу білка носія» розуміють, що сахариди є кон'югованими до того самого носія індивідуально (тобто як перша, так і друга хімічні групи на тій самій молекулі білка носія не використовуються для кон'югації сахаридних залишків, є переважним, коли перша хімічна група на першій аліквоті білкового носія використовується у відношенні кон'югації першого сахарида, а друга хімічна група на другій аліквоті білкового носія використовується у відношенні кон'югації другого сахариду). В одному втіленні перший та другий тип хімічної групи білкового носія є присутніми на окремих В- та/або Т-клітинних епітопах білка носія. Тобто вони є присутніми на відмінних один від одного наборах В- та/або Т-клітинних епітопів. Для прогнозування В-клітинних епітопів для носія можуть використовуватися відомі способи, такі, як один або обидва з наступних двох способів: передбачення 2D-структури та/або антигенний індекс передбачення. Передбачення 2D-структури може бути проведене при використанні програми PSIPRED (від David Jones, Brunei Bioinformatics Group, Dept Biological Sciences, BruneiUniversity, Uxbndge UB8 3PH, UK) Антигенний індекс може бути підрахований на основі способу, описаного Jameson та Wolf (CABIOS :81-186 [1988]). Параметри, що використовуються у цій програмі, являють собою антигенний індекс та мінімальну довжину антигенного пептиду Антигенний індекс 0,9 для мінімум 5 суміжних амінокислот може використовуватися як порогове значення у програмі. Епітопи клітин Т-хелперів являють собою пептиди, зв'язані з молекулами класу II HLA та впізнаються клітинами Т-хелперів. Передбачення корисних епітопів клітин Т-хелперів може базуватися на відомих ме 95238 18 тодиках, таких, як спосіб ТЕРІТОРЕ, описаний Sturniolo та ін (Nature Biotech 17 555-561(1999]). Перша та друга хімічні групи, присутні на білковому носи, є необов'язково відмінними одна від одної та в ідеалі являють собою природні хімічні групи, що можуть легко використовуватися з метою кон'югації. Вони можуть бути незалежно вибрані з групи, яка складається з карбоксильних груп, аміногруп, сульфгідрильних груп, гідроксильних груп, імідазолільних груп, груп гуанідилу та груп індолілу. В одному втіленні перша хімічна група є карбоксильною групою, а друга є аміногрупою, або навпаки. Ці групи розглядаються більш детально нижче. У специфічному втіленні імуногенна композиція включає принаймні 2 різні капсулярні полісахариди N. menmgitidis, де один або більше є вибраним(и) з першої групи, яка складається з МеnА та МеnС, який/які є кон'югованим(и) з білком носія за допомогою хімічної групи першого типу на білковому носи (наприклад, карбоксильної групи), а один або більше відмінних сахаридів, який/які є вибраним(и) з другої групи, яка складається з МеnС, MenY та MenW, який/які кон'югованим(и) з білком носія за допомогою хімічної групи другого типу на білковому носи (наприклад, аміногрупи). У додатковому втіленні імуногенна композиція згідно з винаходом включає МеnА, кон'югований за допомогою першого типу хімічної групи (наприклад, карбоксильної групи), та МеnС, кон'югований за допомогою другого тип хімічної групи (наприклад, аміногрупи). В іншому втіленні імуногенна композиція включає МеnС, кон'югований за допомогою першого типу хімічної групи (наприклад, карбоксильної групи), та MenY, кон'югований за допомогою другого тип хімічної групи (наприклад, аміногрупи). В іншому втіленні імуногенна композиція включає МеnА, кон'югований за допомогою першого типу хімічної групи (наприклад, карбоксильної групи), та МеnС, MenY та MenW, кон'югований за допомогою другого типу хімічної групи (наприклад, аміногрупи). В іншому втіленні імуногенна композиція включає МеnА та МеnС, кон'юговані за допомогою першого типу хімічної групи (наприклад, карбоксильної групи), та MenY та MenW, кон'юговані за допомогою другого типу хімічної групи (наприклад, аміногрупи). У будь-якому з приведених вище втілень може бути присутній Hib, також кон'югований до того самого типу білкового носія. Hib може бути кон'югованим до носія за допомогою першого або другого типу хімічної групи. В одному втіленні він є кон'югованим за допомогою карбоксильної групи. В одному втіленні МеnА капсулярний сахарид, у разі присутності, є принаймні частково Оацетилованим, так, що принаймні 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% або 98% повторюваних одиниць є О-ацетилованими принаймні в одному положенні. О-ацетилування є, наприклад, присутнім принаймні в 0-3 положенні принаймні 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% або 98% повторюваних одиниць. В одному втіленні МеnС капсулярний сахарид, у разі присутності, є принаймні частково О 19 ацетилованим, так, що принаймні 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% або 98% (α2 → 9)-зв'язаних NeuNAc повторюваних одиниць є Оацетилованими принаймні в одному або двох положеннях. О-ацетилування є, наприклад, присутнім в О-7 та/або O-8 положенні принаймні 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% або 98% повторюваних одиниць. В одному втіленні MenW капсулярний сахарид, у разі присутності, є принаймні частково Оацетилованим, так, що принаймні 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% або 98% повторюваних одиниць є О-ацетилованими принаймні в одному положенні. О-ацетилування є, наприклад, присутнім принаймні в O-7 та/або O-9 положенні принаймні 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% або 98% повторюваних одиниць. В одному втіленні MenY капсулярний сахарид, у разі присутності, є принаймні частково Оацетилованим, так, що принаймні 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% або 98% повторюваних одиниць є О-ацетилованими принаймні в одному положенні або двох положеннях. Оацетилування є, наприклад, присутнім принаймні в 7 та/або 9 положенні принаймні 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% або 98% повторюваних одиниць. Процент О-ацетилування відноситься до проценту повторюваних одиниць, які містять Оацетилування. Це значення може вимірюватися у сахариді до кон'югації та/або після кон'югації. В одному втіленні імуногенної композиції згідно з винаходом, присутній сахарид або кожний присутній капсулярний сахарид N. menmgitidis є кон'югованим з ТТ. У додатковому втіленні кожний капсулярний сахарид N. meningitidis є окремо кон'югованим з окремим білком носія У додатковому втіленні кожний кон'югат капсулярного сахариду N. meningitidis має співвідношення сахарид носій 1:5-5:1 або 1:1-1:4 (ваг/ваг). У додатковому втіленні принаймні один, два або три кон'югат(и) капсулярного сахариду N. meningitidis є безпосередньо кон'югований(і) з білком носія У додатковому втіленні MenW та/або MenY, MenW та/або MenC, MenY та/або МеnС, або MenW та МеnС та MenY є безпосередньо кон'югованими з білком носія У додатковому втіленні принаймні один, два або три сахаридний(і) кон'югат(и) N. meningitidis є безпосередньо кон'югованим(и) за допомогою хімічної реакції при використанні CDAP У додатковому втіленні співвідношення MenW та/або Υ сахариду та білка носія знаходиться в межах від 1:0,5 до 1:2 (ваг/ваг) У додатковому втіленні співвідношення МеnС сахариду та білка носія знаходиться в межах від 1:0,5 до 1:2 (ваг/ваг). У додатковому втіленні принаймні один, два або три капсулярний(і) сахарид(и) N. meningitidis є кон'югованим(и) з білком носія через лінкер (який може бути біфункцюнальним, наприклад, таким, що має дві реактивні аміногрупи (таким, як ADH) або дві реактивні карбоксильні групи, або реактивну аміногрупу на одному кінці та реактивну карбоксильну групу на іншому). Лінкер містить від 4 до 12 атомів вуглецю. У додатковому втіленні один або кожний капсулярний(і) сахарид(и) N. meningitidis, кон'юго 95238 20 вані за допомогою лінкера, є кон'югованими з лінкером за допомогою реакції при використанні CDAP. У додатковому втіленні білок носія є кон'югованим з лінкером при використанні карбодпмщного зв'язку, наприклад, при використанні EDAC. У додатковому втіленні один або кожний капсулярний сахарид N. meningitidis кон'югують з лінкером перед кон'югацією білка носія з лінкером. У додатковому втіленні МеnА кон'югують з білком носія за допомогою лінкера (співвідношення МеnА сахариду та білка носія може бути від 1:2 до 1:5 (ваг /ваг)). У додатковому втіленні МеnС кон'югують з білком носія за допомогою лінкера (співвідношення МеnС сахариду та білка носія може складати від 1:2 до 1:5 (ваг /ваг)). Імуногенна композиція згідно з винаходом може, таким чином, включати сахаридні кон'югати, в яких середній розмір кожного сахариду до кон'югації є більшим за 50 кДа, 75 кДа, 100 кДа, 110 кДа, 120 кДа або 130 кДа. В одному втіленні цей кон'югат після кон'югації може легко фільтруватися через фільтр з розміром пор 0,2 мікрона, так, що після фільтрації одержують вихід більший, ніж 50, 60, 70, 80, 90 або 95% у порівнянні зі зразком, який не піддавали фільтрації. Зокрема, імуногенна композиція згідно з винаходом включає капсулярні полісахариди N. meningitidis принаймні з однієї, двох, трьох або чотирьох серогруп А, С, W та Y, кон'юговані з білком носія, де середній розмір (середньовагова молекулярна вага; Мв) принаймні одного, двох, трьох або чотирьох або кожного сахариду N. meningitidis є більшою за 50 кДа, 60 кДа, 75 кДа, 100 кДа, 110 кДа, 120 кДа або 130 кДа. Імуногенна композиція може включати капсулярні полісахариди N. meningitidis з однієї, двох, трьох або чотирьох серогруп А, С, W та Y, кон'юговані з білком носія, де принаймні один, два, три, чотири або кожний сахарид N. meningitidis є або нативним сахаридом, або має розмір, який відрізняється на коефіцієнт х2, х3, х4, х5, х6, х7, х8, х9 або х10 від середньовагової молекулярної ваги нативного полісахариду. Для цілей даного винаходу термін «нативний полісахарид» відноситься до сахариду, який не піддавався процесу, мета якого зменшити сахарид за розміром. Полісахарид може в незначній мірі бути зменшений у розмірі під час проведення звичайних процедур очистки. Такий сахарид все ще є нативним. Тільки тоді, коли полісахарид піддавали процедурам калібрування за розміром, він не вважається нативним. Для цілей даного винаходу термін «калібрований за розміром з коефіцієнтом до 2» означає, що сахарид піддають процесу, призначеному для зменшення розміру сахариду але залишають розмір більшим, ніж половина розміру нативного полісахариду. Х3, х4 тощо інтерпретуються таким самим чином, тобто сахарид піддають процесу, призначеному для зменшення розміру полісахариду, але залишають розмір більшим, ніж третина, чверть, тощо розміру нативного полісахариду. В одному аспекті винаходу імуногенна композиція включає капсулярні полісахариди N. meningitidis з однієї, двох, трьох або чотирьох се 21 рогруп А, С, W та Y, кон'юговані з білком носія, де принаймні один, два, три, чотири або кожний сахарид N. meningitidis є нативним полісахаридом. В одному аспекті винаходу імуногенна композиція включає капсулярні полісахариди N. meningitidis з однієї, двох, трьох або чотирьох серогруп А, С, W та Y, кон'юговані з білком носія, де принаймні один, два, три, чотири або кожний сахарид N. meningitidis є каліброваним за розміром з коефіцієнтом до х1,5, х2, х3, х4, х5, х6, х7, х8, х9 або х10. Імуногенні композиції згідно з винаходом необов'язково включають кон'югати: капсулярний сахарид N. meningitidis серогрупи С (МеnС), капсулярний сахарид серогрупи А (МеnА), капсулярний сахарид серогрупи W135 (MenW), капсулярний сахарид серогрупи Υ (MenY), капсулярні сахариди серогруп С та Υ (MenCY), капсулярні сахариди серогруп С та А (МеnАС), капсулярні сахариди серогруп С та W (MenCW), капсулярні сахариди серогруп А та Υ (MenAY), капсулярні сахариди серогруп А та W (MenAW), капсулярні сахариди серогруп W та Υ (Men WY), капсулярний сахарид серогруп А, С та W (MenACW), капсулярні сахариди серогруп А, С та Υ (MenACY); капсулярні сахариди серогруп A, W135 та Υ (MenAWY), капсулярні сахариди серогруп С, W135 та Υ (MenCWY); або капсулярні сахариди серогруп А, С, W135 та Υ (MenACWY). Це є визначенням «однієї, двох, трьох або чотирьох» або «принаймні однієї з» серогруп А, С, W та Y, або кожного сахариду N. meningitidis, який згадується в даній заявці. В одному втіленні середній розмір принаймні одного двох, трьох, чотирьох або кожного сахариду N. meningitidis складає від 50 кДа до 1500 кДа, від 50 кДа до 500 кДа, від 50 кДа до 300 кДа, від 101 кДа до 1500 кДа, від 101 кДа до 500 кДа, від 101 кДа до 300 кДа, як визначено MALLS. В одному втіленні МеnА сахарид, у разі присутності, має молекулярну вагу 50-500 кДа, 50-100 кДа, 100-500 кДа, 55-90 кДа, 60-70 кДа або 70-80 кДа або 60-80 кДа. В одному втіленні МеnС сахарид, у разі присутності, має молекулярну вагу 100-200 кДа, 50-100 кДа, 100-150 кДа, 101-130 кДа, 150-210 кДа або 180-210 кДа, як визначено MALLS. В одному втіленні MenY сахарид, у разі присутності, має молекулярну вагу 60-190 кДа, 70-180 кДа, 80-170 кДа, 90-160 кДа, 100-150 кДа або 110140 кДа, 50-100 кДа, 100-140 кДа, 140-170 кДа або 150-160 кДа, як визначено MALLS. В одному втіленні MenW сахарид, у разі присутності, має молекулярну вагу 60-190 кДа, 70-180 кДа, 80-170 кДа, 90-160 кДа, 100-150 кДа, 110-140 кДа, 50-100 кДа або 120-140 кДа, як визначено MALLS. Молекулярна вага або середня молекулярна вага сахариду в даній заявці відноситься до середньовагової молекулярної ваги (Мв) сахариду, що вимірюється до проведення кон'югації та вимірюється за допомогою MALLS. Методика MALLS є добре відомою в області техніки, її типово здійснюють так, як описано у Прикладі 2. Для MALLS аналізу менінгококових сахаридів можна використовувати дві колонки у 95238 22 комбінації (TSKG6000 та 5000PWxl), при цьому сахариди піддають елююванню водою. Сахариди визначають при використанні детектора світового розсіювання (наприклад, Wyatt Dawn DSP, оснащеного 10 мВ аргоновим лазером 488 нм) та інтерферометричного рефрактометра (наприклад, Wyatt Otilab DSP, оснащеного Р100 камерою та червоним фільтром при 498 нм). В одному втіленні сахариди N. meningitidis є нативними полісахаридами або нативними полісахаридами, які зменшені у розмірах при проведенні нормального процесу екстракції. В одному втіленні сахариди N. meningitidis є зменшеними за розмірами при використанні механічного розщеплення, наприклад, за допомогою мікропсевдозрідження або обробки ультразвуком. Мікропсевдозрідження та обробка ультразвуком мають перевагу у зменшенні розміру більш великих нативних полісахаридів у достатній мірі для того, щоб забезпечити одержання здатного до фільтрації кон'югату (наприклад, проходження через фільтр з розміром пор 0,2 мікрона). Зменшення розміру є таким, що має коефіцієнт, не більший за х20, х10, х8, х6, х5, х4, х3 або х2. В одному втіленні імуногенна композиція включає кон'югати N. meningitidis які одержані із суміші нативних полісахаридів та сахаридів, які зменшені у розмірах на коефіцієнт, не більший, ніж х20. Наприклад, сахариди з МеnС та/або МеnА є нативними. Наприклад, сахариди з MenY та/або MenW є зменшеними за розмірами з коефіцієнтом, не більшим за х20, х10, х8, х6, х5, х4, х3 або х2. Наприклад, імуногенна композиція містить кон'югат, одержаний з MenY та/або MenW та/або МеnС та/або МеnА, який має розмір, зменшений на коефіцієнт, не більший за х10, та/або є мікропсевдозрідженим. Наприклад, імуногенна композиція містить кон'югат, виготовлений з нативного МеnА та/або МеnС та/або MenW та/або MenY. Наприклад, імуногенна композиція включає кон'югат, виготовлений з нативного МеnС. Наприклад імуногенна композиція включає кон'югат, виготовлений з нативного МеnС та МеnА, який є зменшеним за розміром при використанні коефіцієнта, не більшого за х10 та/або є мікропсевдозрідженим. Наприклад, імуногенна композиція включає кон'югат, виготовлений з нативного МеnС та MenY, який є зменшеним за розміром при використанні коефіцієнта, не більшого за х10 та/або є мікропсевдозрідженим. В одному втіленні полідисперсність сахариду складає 1-1,5, 1-1,3, 1-1,2, 1-1,1 або 1-1,05, а після кон'югації полідисперсність кон'югату складає 1,02,5, 1,0-2,0, 1,0-1,5, 1,0-1,2, 1,5-2,5, 1,7-2,2 або 1,52,0. Усі вимірювання полідисперсності проведені за допомогою MALLS. Сахариди необов'язково піддають зменшенню розміру до 1,5, 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18 або 20 разів у порівнянні з розміром полісахариду, ізольованого з бактерій. В одному втіленні кожний сахарид N. meningitidis є або нативним полісахаридом або є зменшеним у розмірі при використанні коефіцієнту, не більшого за х10. У додатковому втіленні кожний капсулярний сахарид N. meningitidis є на 23 тивним полісахаридом. У додатковому втіленні принаймні один, два, три або чотири капсулярний(і) сахарид(и) N. meningitidis є зменшеним у розмірах за допомогою мікропсевдозрідження. У додатковому втіленні кожний капсулярний сахарид N. meningitidis є зменшеним за розміром на коефіцієнт, не більший за х10. У додатковому втіленні кон'югати N. meningitidis є виготовленими із суміші нативних полісахаридів та сахаридів, які є зменшеними за розмірами на коефіцієнт, не більший за х10. У додатковому втіленні капсулярний сахарид з серогрупи Υ є зменшеним за розмірами на коефіцієнт, не більший за х10. У додатковому втіленні капсулярні полісахариди з серогруп А та С являють собою нативні полісахариди, а сахариди з серогруп W135 та Υ є зменшеними за розмірами з коефіцієнтом, не більшим за х10. У додатковому втіленні середній розмір кожного капсулярного сахариду N. meningitidis знаходиться в межах від 50 кДа до 300 кДа або від 50 кДа до 200 кДа. У додатковому втіленні імуногенна композиція включає МеnА капсулярний сахарид, що має середній розмір, більший за 50 кДа, 75 кДа, 100 кДа, або середній розмір, що складає 50-100 кДа або 55-90 кДа або 60-80 кДа. У додатковому втіленні імуногенна композиція включає МеnС капсулярний сахарид, що має середній розмір, більший за 50 кДа, 75 кДа, 100 кДа або такий, що складає 100-200 кДа, 100-150 кДа, 80-120 кДа, 90-110 кДа, 150-200 кДа, 120-240 кДа, 140-220 кДа, 160-200 кДа або 190-200 кДа. У додатковому втіленні імуногенна композиція включає MenY капсулярний сахарид, що має середній розмір, більший за 50 кДа, 75 кДа, 100 кДа, або такий, що складає 60-190 кДа або 70-180 кДа або 80-170 кДа або 90-160 кДа або 100-150 кДа, 110-145 кДа або 120-140 кДа. У додатковому втіленні імуногенна композиція включає MenW капсулярний сахарид, що має середній розмір, більший за 50 кДа, 75 кДа, 100 кДа, або такий, що складає 60-190 кДа або 70-180 кДа або 80170 кДа або 90-160 кДа або 100-150 кДа, 140-180 кДа, 150-170 кДа або 110-140 кДа. Імуногенна композиція згідно з винаходом може включати капсулярний сахарид Н. influenzae b (Hib), кон'югований з білком носія. Такий сахарид може бути кон'югований з білком носія, вибраним з групи, яка складається з ТТ, DT, CRM197, фрагменту С ТТ та білка D, наприклад, ТТ. Hib сахарид може бути кон'югованим до того самого білка носія, що й принаймні, один, два, три або усі капсулярні сахаридні кон'югати N. meningitidis, наприклад, ТТ. Співвідношення Hib до білка носія в Hib капсулярному сахаридному кон'югаті може бути у межах від 1:5 до 5:1 (ваг/ваг), наприклад, від 1:1 до 1:4, від 1:2 до 1:3,5 або близько 1:3 (ваг/ваг). Hib капсулярний сахарид може бути кон'югованим до білка носія за допомогою лінкера (див. вище). Лінкер може бути біфункціональним (з двома реактивними аміногрупами, таким, як ADH, або двома реактивними групами карбонової кислоти, або реактивною аміногрупою на одному кінці та реактивною групою карбонової кислоти на іншому кінці). Він може містити від 4 до 12 атомів вуглецю. Hib сахарид може бути кон'югованим до білка носія або лінкера при використанні CNBr або CDAP. 95238 24 Білок носія може бути кон'югованим до Hib сахариду через лінкер при використанні способу, що передбачає наявність карбодіімідного хімічного зв'язку, наприклад, при використанні EDAC (за допомогою карбоксильної хімічної групи на носії). Доза Hib сахаридного кон'югату може складати від 0,1 дог 9 мкг, від 1 до 5 мкг або від 2 до 3 мкг сахариду. У додатковому втіленні імуногенна композиція згідно з винаходом включає Hib сахаридний кон'югат та принаймні два сахаридні кон'югати N. meningitidis, де Hib кон'югат є присутнім у більш низькій дозі сахариду, ніж середнє значення дози сахариду принаймні двох сахаридних кон'югатів N. meningitidis. Альтернативно, Hib кон'югат є присутнім у більш високій дозі сахариду, ніж доза сахариду кожного з принаймні двох сахаридних кон'югатів N. meningitidis. Наприклад, доза Hib кон'югату може бути принаймні на 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70% або 80% нижчою за середнє значення найнижчої дози сахариду принаймні двох додаткових сахаридних кон'югатів N. meningitidis. Середнє значення дози визначають шляхом додання доз усіх додаткових сахаридів та ділення на число додаткових сахаридів. Додаткові сахариди являють собою усі сахариди в імуногенній композиції окремо від Hib та можуть включати капсулярні полісахариди N. meningitidis. «Доза» являє собою кількість імуногенної композиції або вакцини, що вводиться людині. Hib сахарид являє собою капсулярний полісахарид на основі полірибозилфосфату (PRP) Haemophilus influenzae типу b або олігосахарид, який має походження від цього мікроорганізму. Вираз «принаймні, два додаткові бактеріальні сахаридні кон'югати» узятий для визначення двох додаткових бактеріальних сахаридних кон'югатів у доповнення до Hib кон'югату. Два додаткові бактеріальні кон'югати можуть включати капсулярні сахаридні кон'югати N. meningitidis. Імуногенні композиції згідно з винаходом можуть включати додаткові сахаридні кон'югати, які походять від одного або більше мікроорганізмів: Neisseria meningitidis, Streptococcus рпеитопіае, Група A Streptococci, Група В Streptococci, S. typhi, Staphylococcus aureus або Staphylococcus epidermidis. В одному втіленні імуногенна композиція включає капсулярні полісахариди, які мають походження від однієї або більше серогруп А, С, W135 та Υ Neisseria meningitidis. Додаткове втілення включає капсулярні полісахариди, які походять від Streptococcus pneumoniae. Пневмококові антигени на основі капсулярного сахариду є необов'язково вибраними з серотипів 1, 2, 3, 4, 5, 6А, 6В, 7F, 8, 9N, 9V, 10А, 11 A, 12F, 14, 15В, 17F, 18С, 19А, 19F, 20, 22F, 23F та 33F (необов'язково з серотипів 1, 3, 4, 5, 6В, 7F, 9V, 14, 18С, 19F та 23F). Додаткове втілення включає капсулярні полісахариди типу 5, типу 8 або 336 Staphylococcus aureus. Додаткове втілення включає капсулярні полісахариди типу І, типу II або типу III Staphylococcus epidermidis. Додаткове втілення включає Vi сахарид з S. typhi. Додаткове втілення включає капсулярні полісахариди типу Іа, типу Іс, типу II, типу III або типу V Streptocoocus групи В. Додаткове вті 25 лення включає капсулярні полісахариди Streptococcus групи А, необов'язково додаткове включає принаймні один Μ білок та необов'язково множинні типи Μ білка. Імуногенні композиції згідно з винаходом можуть також включати DTPa або DTPw вакцину (наприклад, таку, що містить DT, ТТ, та або цільні частинки протикоклюшної (Pw) вакцини, або безклітинну вакцину коклюшу (Ра) (що містить, наприклад, токсоїд коклюшу, FHA, пертактин та, необов'язково, аглютиногени 2 та 3). Такі комбінації можуть також включати вакцину проти гепатиту В (наприклад, вона може включати поверхневий антиген вірусу гепатиту В [НерВ], необов'язково адсорбований на фосфаті алюмінію). В одному втіленні імуногенна композиція згідно з винаходом включає DTPwHepBHibMenAC вакцину, в якій НіbМеnАС компонент є таким, як описано вище. В одному втіленні імуногенна композиція згідно з винаходом додатково включає антиген з N. meningitidis серогрупи В. Антиген є необов'язково капсулярним полісахаридом з N. meningitidis серогрупи В (МеnВ) або полісахаридом зменшеного розміру або олігосахаридом, який походить від нього, що можуть бути кон'юговані з білковим носієм. Антиген є необов'язково препаратом везикули зовнішньої мембрани N. meningitidis серогрупи В, як описано в ЕР301992, WO 01/09350, WO 04/14417, WO 04/14418 та WO 04/14419. В загальному випадку імуногенна композиція згідно з винаходом може включати дозу кожного сахаридного кон'югату у межах від 0,1 до 20 мкг, від 2 до 10 мкг, від 2 до 6 мкг або від 4 до 7 мкг сахариду. В одному втіленні імуногенна композиція згідно з винаходом містить кожний капсулярний сахарид N. meningitidis у дозі 0,1-20 мкг; 1-10 мкг; 2-10 мкг, 2,5-5 мкг, приблизно або точно 5 мкг; або приблизно або точно 2,5 мкг. В одному втіленні імуногенна композиція згідно з винаходом, наприклад, містить Hib сахаридний кон'югат при дозі сахариду від 0,1 до 9 мкг; від 1 до 5 мкг або від 2 до 3 мкг або приблизно або точно 2,5 мкг. У додатковому втіленні імуногенна композиція згідно з винаходом, наприклад, містить Hib сахаридний кон'югат з дозою сахариду від 0,1 до 9 мкг; від 1 до 5 мкг або від 2 до 3 мкг або приблизно або точно 2,5 мкг та кожний з полісахаридних кон'югатів N. meningitidis при дозі сахариду від 2 до 20 мкг, від 3 до 10 мкг, або від 4 до7 мкг або приблизно або точно 5 мкг. «Приблизно» або «близько» визначається як значення, що перебуває у межах 10% більше або менше даної цифри для цілей даного винаходу. В одному втіленні імуногенна композиція згідно з винаходом може містити дозу сахариду Hib сахаридного кон'югату, яка є, наприклад, меншою, ніж 90%, 80%, 75%, 70%, 60%, 50%, 40%, 30%, 20% або 10% середнього значення сахаридної дози принаймні двох, трьох, чотирьох або кожного з сахаридних кон'югатів N. meningitidis. Доза сахариду для Hib сахариду є, наприклад, такою, що знаходиться в межах від 20% до 60%, від 30% до 60%, від 40% до 60% або приблизно або точно 50% середнього значення дози сахариду принай 95238 26 мні двох, трьох, чотирьох або кожного з сахаридних кон'югатів N. meningitidis. В одному втіленні імуногенна композиція згідно з винаходом містить дозу сахариду Hib сахаридного кон'югату, яка є, наприклад, меншою, ніж 90%, 80%, 75%, 70%, 60%, 50%, 40%, 30%, 20% або 10% найнижчої дози сахариду принаймні двох, трьох, чотирьох або кожного з сахаридних кон'югатів N. meningitidis. Сахаридна доза Hib сахариду є, наприклад, такою, що знаходиться в межах від 20% до 60%, від 30% до 60%, від 40% до 60% або приблизно або точно 50% найнижчої дози сахариду принаймні двох, трьох, чотирьох або кожного з сахаридних кон'югатів N. meningitidis. В одному втіленні винаходу доза сахариду кожного з принаймні двох, трьох чотирьох або кожного із сахаридних кон'югатів N. meningitidis є необов'язково такою самою або приблизно такою самою. Приклади імуногенних композицій згідно з винаходом являють собою композиції, що складають з або включають: Hib кон'югат, МеnА кон'югат та МеnС кон'югат, необов'язково при співвідношеннях доз сахариду 1:2:2, 1:2:1, 1:4:2, 1:6:3, 1:3:3, 1:4:4, 1:5:5, 1:6:6 (ваг/ваг.). Необов'язково, коли доза МеnА сахариду є більшою, ніж доза МеnС сахариду. Hib кон'югат, МеnС кон'югат та MenY кон'югат, необов'язково при співвідношеннях доз сахариду 1:2:2, 1:2:1, 1:4:2, 1:4:1, 1:8;4, 1:6:3, 1:3:3, 1:4:4, 1:5:5, 1:6:6 (ваг./ваг). Необов'язково, коли доза МеnС сахариду є більшою, ніж доза MenY сахариду. Hib кон'югат, МеnС кон'югат та MenW кон'югат, необов'язково при співвідношеннях доз сахариду 1:2:2, 1:2:1, 1:4:2, 1:4:1, 1:8;4, 1:6:3, 1:3:3, 1:4:4, 1:5:5, 1:6:6 (ваг./ваг.). Необов'язково, коли доза МеnС сахариду є більшою, ніж доза MenW сахариду. Hib кон'югат, MenA кон'югат та MenW кон'югат, необов'язково, при співвідношеннях доз сахариду 1:2:2, 1:2:1, 1:4:2, 1:4:1, 1:8:4, 1:6:3, 1:3:3, 1:4:4, 1:5:5, 1:6:6 (ваг /ваг) Необов'язково, коли доза МеnА сахариду є більшою, ніж доза MenW сахариду. Hib кон'югат, МеnА кон'югат та MenY кон'югат, необов'язково при співвідношеннях доз сахариду 1:2:2, 1:2:1, 1:4:2, 1:4:1, 1:8:4, 1:6:3, 1:3:3, 1:4:4, 1:5:5, 1:6:6 (ваг /ваг) Необов'язково, коли доза МеnА сахариду є більшою, ніж доза MenY сахариду. Hib кон'югат, MenW кон'югат та MenY кон'югат, необов'язково при співвідношеннях доз сахариду 1:2:2, 1:2:1, 1:1:2, 1:4:2, 1:2:4, 1:4:1, 1:1:4, 1:3,6, 1:1:3, 1:6:3, 1:3:3, 1:4:4, 1:5:5, 1:6:6 (ваг /ваг) Необов'язково, коли доза MenY сахариду є більшою, ніж доза MenW сахариду. МеnА, МеnС, MenW та MenY при співвідношеннях доз сахариду 1:1:1:1 або 2:1:1:1 або 1:2:1:1 або 2:2:1:1 або 1:3:1:1 або 1:4:1:1 (ваг /ваг). Додатковий аспект згідно з винаходом являє собою вакцину, що включає імуногенну композицію згідно з винаходом та фармацевтично прийнятний наповнювач. 27 В одному втіленні імуногенна композиція згідно з винаходом доводиться до значення рН від рН 7,0 до 8,0, від рН 7,2 до 7,6 або приблизно або точно рН 7,4. Імуногенна композиція або вакцина згідно з винаходом є необов'язково люфілізованими у присутності стабілізуючого агенту, наприклад полioлу, такого, як сахароза або трегалоза. Необов'язково, коли імуногенна композиція або вакцина згідно з винаходом містить кількість ад'юванту, достатню для поліпшення імунної відповіді на імуноген. Прийнятні ад'юванти включають, але не обмежені такими, як солі алюмінію (фосфат алюмінію або гідроокис алюмінію), суміші сквалену (SAF-1), мураміловий пептид, похідні сапоніну, препарати стінок клітин мікобактерій, монофосфорил ліпід А, похідні міколєвої кислоти, поверхнево-активні речовини на основі неіонних блок-співполімерів, Quil A, субодиницю холерного токсину В, поліфосфазен та його похідні, а також імуностимулювальні комплекси (ISCOM), такі, як ті, що описані Takahashi та ін. (1990) Nature 344 873875. Для комбінацій N. meningitidis або HibMen, які обговорюються вище, є бажаним не використовувати ад'ювант на основі будь-якої солі алюмінію або будь-який ад'ювант взагалі. Як з усіма імуногенними композиціями або вакцинами, імунологічно ефективні кількості імуногенів повинні визначатися емпірично Фактори, які необхідно враховувати, включають імуногенність, чи буде імуноген створювати комплекс або буде ковалентно приєднуватися до ад'юванту або білка носія або іншого носія, спосіб введення та кількість імунізуючих дозувань, які вводяться. Активний агент може бути присутній у різних концентраціях у фармацевтичній композиції або вакцині згідно з винаходом. Є типовим, коли мінімальна концентрація речовини є кількістю, необхідною для досягнення заданої мети, у той час, коли максимальна концентрація є максимальною кількістю, яка буде залишатися у розчині або гомогенно суспендуватися у початковій суміші. Наприклад, мінімальна кількість терапевтичного агенту є необов'язково такою, що буде забезпечувати одиничну терапевтично ефективну дозу. Для біоактивних речовин мінімальна концентрація є кількістю, необхідною для біоактивності при відновленні, а максимальна концентрація знаходиться у точці, в якій не може підтримуватися гомогенна суспензія. В загальному випадку очікується, що кожна доза буде включати 1-100 мкг білкового антигену, необов'язково, 5-50 мкг або 5-25 мкг. Наприклад, дози бактеріальних сахаридів складають 10-20 мкг, 5-10 мкг, 2,5-5 мкг або 1-2,5 мкг сахариду у кон'югаті. Вакцинні препарати згідно з даним винаходом можуть використовуватися для захисту або лікування ссавця (наприклад, пацієнта-людини), чутливого до інфекції, за допомогою введення вказаної вакцини при використанні системного шляху або шляхом введення через слизову оболонку. Пацієнт-людина є необов'язково немовлям (менше 12 місяців), дитиною, що починає ходити (12-24, 12-16 або 12-14 місяців), дитиною (2-10, 3-8 або 3 95238 28 5 років), підлітком (12-21, 14-20 або 15-19 років) або дорослою людиною. Ці введення можуть включати внутрішньом'язове, інтраперитонеальне, інтрадермальне або підшкірне введення, або введення через слизову оболонку до орального/травного, респіраторного, сечостатевого трактів. Інтраназальне введення вакцин для лікування пневмонії або отиту є переважним (оскільки назофарингеальне носійство пневмококів може більш ефективно запобігатися, що послаблює, таким чином, інфекцію на ранній стадії). Незважаючи на те, що вакцина згідно з винаходом може вводитися як одинична доза, її компоненти можуть також сумісно вводитися одночасно або в різні моменти часу (наприклад, якщо сахариди є присутніми у вакцині, то такі можуть вводитися окремо у той самий час або через 1-2 тижні після введення вакцини на основі бактеріального білка для оптимальної координації імунних відповідей стосовно кожної іншої). У доповнення до одного шляху введення, можуть використовуватися 2 різні шляхи введення. Наприклад, вірусні антигени можуть вводитися ID (інтрадермально), у той час як бактеріальні білки можуть вводитися lМ (внутрішньом'язово) або IN (інтраназально). У разі присутності сахаридів, вони можуть вводитися lМ (або ID), a бактеріальні білки можуть вводитися IN (або ID). У доповнення до цього вакцини згідно з винаходом можуть вводитися IМ для примуючих дозувань та IN доз для бустерних ін'єкцій. Приготування вакцин є описаним у загальних рисах в виданні «Конструювання вакцин» («Субодиничний та ад'ювантний підхід» (ред. Powell M.F. & Newman M.J.) (1995) Plenum Press New York). Інкапсуляція у ліпосоми є описаною Fullerton, Патент США 4,235,877. Додатковий аспект згідно з винаходом являє собою вакцинний набір для сумісного або послідовного введення, що включає дві мультивалентні імуногенні композиції для забезпечення захисту хазяїна проти захворювання, що викликається Bordetella pertussis, Clostridium tetani, Corynebacterium diphtheriae, Neisseria meningitidis та, необов'язково, Haemophilus influenzae. Наприклад, набір необов'язково включає перший контейнер, що містить один або більше компонентів: токсоїд правця (ТТ), дифтерійний токсоїд (DT), та цільноклітинні або неклітинні компоненти коклюшу другий контейнер, що містить: імуногенну композицію згідно з винаходом, як описано вище (наприклад, таку, що включає комбінації сахаридних кон'югатів Men або HibMen). Додатковий аспект згідно з винаходом являє собою вакцинний набір для сумісного або послідовного введення, що включає дві мультивалентні імуногенні композиції для забезпечення захисту хазяїна проти захворювання, що викликається Streptococcus pneumoniae та Neisseria meningitidis та необов'язково Haemophilus influenzae. Наприклад, набір необов'язково включає перший контейнер, що містить: один або більше кон'югатів білкового носія та капсулярного сахариду, одержаного з 29 Streptococcus pneumoniae [де капсулярний сахарид є необов'язково одержаним з пневмококового серопиту, вибраного з групи, яка складається з 1, 2, 3, 4, 5, 6А, 6В, 7F, 8, 9N, 9V, 10А, 11А, 12F, 14, 15В, 17F, 18С, 19А, 19F, 20, 22F, 23F та 33F]. другий контейнер, що містить: імуногенну композицію згідно з винаходом, як описано вище (наприклад, таку, що включає комбінації сахаридних кон'югатів Men або HibMen) Приклади Hib кон'югату та полісахаридних кон'югатів N. meningitidis є такими, як описано вище. Типово, коли вакцина Streptococcus pneumoniae у вакцинному наборі згідно з даним винаходом (або у будь-якій імуногенній композиції згідно з винаходом, описаній вище) буде включати сахаридні антигени (необов'язково кон'юговані), де сахариди є такими, що походять від принаймні чотирьох серотипів пневмококів, вибраних з групи, яка складається з 1, 2, 3, 4, 5, 6А, 6В, 7F, 8, 9N, 9V, 10А, 11А, 12F, 14, 15В, 17F, 18С, 19А, 19F, 20, 22F, 23F та 33F. Необов'язково, коли чотири серотипи включають 6В, 14, 19F та 23F. Необов'язково, принаймні 7 серотипи включаються у композицію, наприклад, такі, що одержані із серотипів 4, 6В, 9V, 14, 18С, 19F, та 23F. Необов'язково, більше 7 серотипів включаються у композицію, наприклад принаймні 10, 11, 12, 13 або 14 серотипів. Наприклад, композиція в одному втіленні включає 10 або 11 капсулярних полісахаридів, які походять від серотипів 1, 4, 5, 6В, 7F, 9V, 14, 18С, 19F та 23F та, необов'язково, 3 (усі необов'язково кон'юговані). В одному втіленні згідно з винаходом у композицію включаються принаймні 13 сахаридних антигенів (необов'язково кон'югованих), хоча додаткові сахаридні антигени, наприклад, 23-валентні (такі, як серотипи 1, 2, 3, 4, 5, 6В, 7F, 8, 9N, 9V, 10А, 11А, 12F, 14, 15В, 17F, 18С, 19А, 19F, 20, 22F, 23F та 33F), також передбачаються даним винаходом. Пневмококові сахариди є незалежно кон'югованими з будь-яким білком носія, наприклад, CRM197, токсоїдом правця, дифтерійним токсоїдом, білком D або будь-якими іншими білками носія, які згадуються вище. Необов'язково, коли вакцинний набір згідно з винаходом включає третій компонент. Наприклад, набір необов'язково включає перший контейнер, що містить один або більше компонентів: токсоїд правця (ТТ), дифтерійний токсоїд (DT), та цільноклітинні або неклітинні компоненти коклюшу другий контейнер, що містить: один або більше кон'югатів білкового носія та капсулярного сахариду, одержаного з Streptococcus pneumoniae [де капсулярний сахарид є необов'язково одержаним з пневмококового серопиту, вибраного з групи, яка складається з 1, 2, 3, 4, 5, 6А, 6В, 7F, 8, 9N, 9V, 10А, 11A, 12F, 14, 15В, 17F, 18С, 19А, 19F, 20, 22F, 23F та 33F], та третій контейнер, що містить: імуногенну композицію згідно з винаходом, як описано вище (наприклад, таку, що включає комбінації Men або HibMen сахаридного кон'югату). 95238 30 Додатковий аспект згідно з винаходом являє собою спосіб одержання імуногенної композиції або вакцини згідно з винаходом, що включають етап змішування сахаридів згідно з винаходом, наприклад, змішування капсулярних полісахаридів N. meningitidis принаймні з однієї, двох, трьох або усіх чотирьох серогруп А, С, W та Y, кон'югованих до білка носія, з фармацевтично прийнятним наповнювачем. Додатковий аспект згідно з винаходом являє собою спосіб імунізації людини-хазяїна проти захворювання, спричиненого бактеріями, наприклад, інфекції N. meningitidis та, необов'язково, Haemophilus influenzae, що включає введення хазяїну імунопротективної дози імуногенної композиції або вакцини або набору згідно з винаходом, необов'язково, при використанні одиничної дози. Незалежний аспект згідно з винаходом являє собою спосіб імунізації людини-хазяїна імуногенною композицією, що включає принаймні 2 різні кон'югати капсулярних сахаридів N. meningitidis , вибрані з групи, яка складається з серогруп А, С, W та Υ (необов'язково, MenA, C, W та Υ), де введення одиничної дози (необов'язково, підліткам, дорослим, дітям) приводить до то того, що кров, узята через місяць після введення, виявляє 50%, 60%, 70%, 80%, 90% або 95% респондерів у SBA аналізі, який вимірює рівні відповіді проти MenA, MenC, MenW та/або MenY. Необов'язково, коли SBA є таким, як описаним у Прикладі 9, з респондером, якого піддавали аналізу так, як описано у Прикладі 9. Додатковий незалежний аспект згідно з винаходом являє собою імуногенну композицію, що включає MenA , MenC, MenW та/або MenY кон'югати, які є здатними викликати імунну відповідь після введення одиничної дози, так, що більше 50%, 60%, 70%, 80%, 90% або 95% людей (дітей, підлітків або дорослих), яких було інокульовано, класифікують як респондерів у SBA аналізі при використанні зразків крові, узятих через місяць після інокуляції (необов'язково при використанні критерію, описаного у Прикладі 9). Така імуногенна композиція необов'язково має додаткові структурні характеристики, описані в даній заявці. Додатковий аспект згідно з винаходом являє собою імуногенну композицію згідно з винаходом для застосування у лікуванні або запобіганні захворювання, спричиненого бактеріями, наприклад, інфекції N. meningitidis та, необов'язково, Haemophilus influenzae. Додатковий аспект згідно з винаходом являє собою застосування імуногенної композиції або вакцини або набору згідно з винаходом у виробництві лікарського засобу для лікування або запобігання захворювань, спричинених бактеріями, наприклад, інфекції N. meningitidis та, необов'язково, Haemophilus influenzae. Терміни «такий, що включає», «включають» та «включає» в даній заявці призначені для застосування почергово з термінами «такий, що складається», «складаються з» «складається з» у кожному випадку. 31 Усі посилання або патентні заявки, що цитуються в даному описі, введені в дану заявку як посилання. Винахід ілюструється прикладами, що його супроводжують. Приклади, представлені нижче,здійснені при використанні стандартних методик, які є добре відомим та звичайними для спеціаліста в даній області техніки, за винятком тих випадків, де інше є детально описаним. Приклади є ілюстративними, але не обмежують винахід. ПРИКЛАДИ Приклад 1 - одержання полісахаридних кон'югатів Ковалентне зв'язування PRP полісахариду Haemophilus influenzae (Hib) з ТТ здійснювали за допомогою хімічного злиття, що була розроблене Chu та ін. (Infection and Immunity 1983, 40 (1); 245256). Hib PRP полісахарид активували шляхом додання CNBr та інкубації при рН 10,5 протягом 6 хвилин. Знижували значення рН до рН 8,75 та додавали дигідразид адипінової кислоти (ADH), інкубацію продовжували протягом додаткових 90 хвилин. Активований PRP приєднували до очищеного токсоїда правця за допомогою карбодіімідної конденсації при використанні 1-етил-3-(3диметилаамінопропіл)карбодііміду (EDAC). EDAC додавали для активації PRP до досягнення заключного співвідношення 0,6 мг EDAC/мг активованого PRP. Значення рН доводили до 5,0 та додавали очищений токсоїд правця до досягнення концентрації 2 мг ТТ/мг активованого PRP. Одержаний розчин залишали на 3 дні при слабкому перемішуванні. Після фільтрування через фільтр 0,45 мкм кон'югат очищали на сефакриловій колонці S500HR (Pharmacia, Sweden), урівноваженій у 0,2М NaCI. МеnС - ТТ кон'югати одержували при використанні нативних полісахаридів (більше 150 кДа, як вимірювали за допомогою MALLS) або таких, що піддавали незначному мікропсевдозрідженню. МеnА-ТТ кон'югати одержували при використанні або нативного полісахариду або в незначній мірі мікропсевдозрідженого полісахариду вагою, більшою за 60 кДа, як вимірювали за допомогою MALLS способу Прикладу 2. MenW та MenY-TT кон'югати одержували при використанні зменшених у розмірі полісахаридів з вагою приблизно 100-200 кДа, як вимірювали за допомогою MALLS (див. Приклад 2). Зменшення розмірів здійснювали шляхом мікропсевдозрідження при використанні гомогенізатора Emulsiflex C-50. Потім полісахариди фільтрували через фільтр 0,2 мкм. Активацію злиття проводили так, як описано в WO 96/29094 та WO 00/56360. Коротко, полісахарид при концентрації 10-20 мг/мл в 2М NaCI рН 5,5-6,0 змішували з розчином CDAP (100 мг/мл свіжоприготовленого в ацетонітрилі/WFI, 50/50) до заключного співвідношення CDAP/полісахарид 0,75/1 або 1,5/1. Через 1,5 хвилини підвищували значення рН до 10,0. за допомогою гідроокису натрію. Через три хвилини додавали токсоїд правця до досягнення співвідношення білок/полісахарид 1,5/1 для MenW, 1,2/1 для MenY, 1,5/1 для МеnА або 1,5/1 для МеnС. Реакцію проводили протягом однієї-двох годин. 95238 32 Після етапу злиття додавали гліцин до заключного співвідношення гліцин/PS (ваг./ваг.) 7,5/1, та значення рН доводили до рН 9,0. Суміш залишали на 30 хвилин. Кон'югат освітлювали при використанні 10 мкм фільтра Kleenpak та потім завантажували у колонку Sephacryl S400HR при використанні буфера для елюювання 150 мМ NaCI, 10 мМ або 5 мМ Трис рН 7,5. Партію для клінічних досліджень фільтрували на фільтрі для стерилізації Opticap 4. Одержані кон'югати мали середнє значення співвідношення полісахарид:білок 1:1-1:5 (ваг./ваг.). Приклад 1а - одержання МеnА та МеnС полісахаридних кон'югатів згідно з винаходом МеnС - ТТ кон'югати одержували при використанні нативних полісахаридів (більше 150 кДа, як вимірювали за допомогою MALLS) або таких, що піддавали незначному мікропсевдозрідженню. МеnА-ТТ кон'югати одержували при використанні або нативного полісахариду або в незначній мірі мікропсевдозрідженого полісахариду вагою, більшою за 60 кДа, як вимірювали за допомогою MALLS способу Прикладу 2. Зменшення розмірів здійснювали шляхом мікропсевдозрідження при використанні гомогенізатора Emulsiflex C-50. Потім полісахариди фільтрували через фільтр 0,2 мкм. Для кон'югації МеnА капсулярного полісахариду до токсоїда правця через спейсер використовували наступний спосіб. Ковалентне зв'язування полісахариду зі спейсером (ADH) здійснювали при використанні реакції спарювання, за допомогою якої полісахарид активували при контрольованих умовах при використанні агента для ціанілування 1-ціано-4-диметиламіно-піридинію тетрафторборату (CDAP). Спейсер вступав у реакцію з ціанілованим PS через гідразинові групи з утворенням стабільного ізосечовинного зв'язку між спейсером та полісахаридом. 10 мг/мл розчин МеnА (рН 6,0) [3,5 г] оброблювали свіжоприготовленим 100 мг/мл розчином CDAP у суміші ацетонітрил/вода (50/50 (об. /об.)) з одержанням співвідношення CDAP/MenA 0,75 (ваг./ваг.). Через 1,5 хвилини підвищували значення рН до 10,0. Через 3 хвилини додавали ADH з одержанням співвідношення ADH/MenA 8,9. Значення рН підвищували до 8,75 та проводили реакцію протягом 2 годин, підтримуючи це значення рН (температуру підтримували на рівні 25 °С). Розчин PSAAH концентрували до одержання чверті початкового об'єму, а потім піддавали діафільтрації з 30 об'ємами 0,2М NaCI при використанні фільтра Filtron Omega з границею пропускання 10 кДа, та продукт концентрування піддавали фільтрації. Перед проведенням реакції кон'югацієї (карбодіімідна конденсація) очищений розчин ТТ та розчин PSAAH розводили до досягнення концентрації 10 мг/мл для PSAAH та 10 мг/мл для ТТ. Додавали EDAC (і-етил-3-(3диметиламінопропіл)карбодіімід) до розчину PSAH (2 г сахариду) для того, щоб досягти заключного співвідношення 0,9 мг EDAC/мг PSAAH. Значення рН доводили до 5,0. Додавали очищений токсоїд правця при використанні перистальтичного насосу (протягом 60 хвилин) до досягнення концентрації 2 33 мг ТТ/мг PSAAH. Одержаний розчин залишали на 60 хвилин при температурі +25°С при перемішуванні для одержання заключного часу спарювання 120 хвилин. Розчин нейтралізували шляхом додання 1М Трис-НСІ рН 7,5 (1/10 заключного об'єму) та залишали на 30 хвилин при температурі +25°С, потім протягом ночі при температурі від +2°С до +8°С. Освітлювали кон'югат при використанні фільтра 10 мкм та очищали при використанні колонки Sephacryl S400HR (Pharmacia, Sweden). Колонку урівноважували за допомогою 10 мМ Трис-НСІ (рН 7,0), 0,075 Μ NaCI та кон'югат (приблизно 660 мл) завантажували у колонку (від +2°С до +8°С). Збирали пул елюювання як функцію оптичної густини при 280 нм. Збір починали, коли поглинання підвищувалося до 0,05. Збір продовжували до тих пір, поки Kd не досягав значення 0,30. Кон'югат стерилізували через фільтр при +20°С, а потім зберігали при температурі від +2°С до +8°С. Одержаний кон'югат мав співвідношення полісахарид:білок 1:2-1:4 (ваг/ваг). Для того, щоб кон'югувати МеnС капсулярний полісахарид до токсоїда правця через спейсер, використовували наступний спосіб. Ковалентне зв'язування полісахариду та спейсера (ADH) здійснювали при використанні реакції спарювання, за допомогою якої полісахарид активували при контрольованих умовах при використанні агента для ціанілування 1-ціано-4-диметиламіно-піридинію тетрафторборату (CDAP). Спейсер вступав у реакцію з ціанілованим PS через гідразинові групи з утворенням стабільного ізосечовинного зв'язку між спейсером та полісахаридом. 20 мг/мл розчину МеnС (рН6,0) (3,5 г) оброблювали свіжоприготовленим розчином 100 мг/мл CDAP у суміші ацетонітрил/вода (50/50 (об./об.)) з одержанням співвідношення CDAP/MenC 1,5 (ваг/ваг). Через 1,5 хвилини підвищували значення рН до 10,0. Через 3 хвилини додавали ADH з одержанням співвідношення ADH/MenC 8,9. Значення рН підвищували до 8,75 та проводили реакцію протягом 2 годин (температуру підтримували на рівні 25 °С). Розчин PSAAH концентрували до одержання мінімального об'єму 150 мл, а потім піддавали діафільтрацп з 30 об'ємами 0,2М NaCI при використанні фільтра Filtron Omega з границею пропускання 10 кДа, та продукт концентрування піддавали фільтрації. Перед проведенням реакції кон'югації очищений розчин ТТ та розчин PSAAH (2 г) розводили в 0,2М NaCI до досягнення концентрації 15 мг/мл для PSAAH та 20 мг/мл для ТТ. Очищений токсоїд правця додавали до розчину PSAH для того, щоб досягти заключного співвідношення 2 мг ТТ/мг PSAAH. Значення рН доводили до 5,0. Додавали EDAC (16,7 мг/мл в Трис 0,1 Μ рН 7,5) при використанні перистальтичного насосу (протягом 10 хвилин) до досягнення концентрації 0,5 мг EDAC/мг PSAAH. Одержаний розчин залишали на 110 хвилин при +25°С при перемішуванні та регуляції значення рН для одержання заключного часу спарювання 120 хвилин. Потім розчин нейтралізували шляхом додання 1М Трис 95238 34 НСІ рН 9,0 (1/10 заключного об'єму) та залишали на 30 хвилин при +25°С, а потім протягом ночі при температурі від +2°С до +8°С. Освітлювали кон'югат при використанні фільтра 10 мкм та очищали при використанні колонки Sephacryl S400HR (Pharmacia, Sweden). Колонку урівноважували 10 мМ Трис-НСІ (рН 7,0), 0,075 Μ NaCI, та кон'югат (приблизно 460 мл) завантажували у колонку (температура від +2°С до +8°С). Збирали пул елюювання як функцію оптичної густини при 280 нм. Збір починали, коли поглинання підвищувалося до 0,05 Збір продовжували до тих пір, поки Kd не досягав значення 0,20. Кон'югат стерилізували через фільтр при +20°С, а потім зберігали при температурі від +2°С до +8°С. Одержаний кон'югат мав співвідношення полісахарид білок 1 2-1 4 (ваг/ваг). Приклад 2 - визначення молекулярної ваги при використанні MALLS Детектори приєднували до колонки високоефективної хроматографії за розмірами молекул, з якої елюювали зразки 3 одного боку детектор розсіювання лазерного світла вимірював інтенсивності світла, розсіяні при куті 16 градусів за допомогою макромолекулярного розчину, а з іншого боку, інтерферометричний рефрактометр, вбудований у систему, дозволяв проводити визначення кількості елюйованого зразка. Зі значень цих інтенсивностей можна визначити розмір та форму макромолекул у розчині. Середнє значення молекулярної ваги (Mw) визначали як суму ваги усіх видів, помноженої на їх відносну молекулярну вагу та поділену на суму ваги усіх видів. а) Середньовагова молекулярна вага -Mw Wi  Mi  m2 Мw  m1  Wi b) Середньокількісна молекулярна вага: -Μn Ni  Mi  m1 Мn  m0  Ni c) Корінь з квадрату середнього значення ра2 діусу: -Rw- та R w являє собою квадрат радіусу, який визначається рівнянням: R2w або (r 2 )w   mi  ri2  mi (-mi- являє собою масу центру розсіювання, а ri- являє собою відстань між центром розсіювання та центром тяжіння макромолекули). d) Полідисперсність визначають як співвідношення -Mw / Мn-. Менінгококовії полісахариди піддають аналізу за допомогою MALLS шляхом завантажування у дві колонки ВЕРХ (TSKG6000 та 5000PWxl), що використовуються у комбінації. 25 мкл полісахариду завантажують у колонку та піддають елююванню 0,75 мл профільтрованої води. Полісахариди визначають при використанні детектора розсіяного світла (Wyatt Dawn DSP, оснащеного 10 мВ аргоновим лазером, при 488 нм) та інтерферометричного рефрактометра (Wyatt Otilab DSP, оснащеного Р100 камерою та червоним фільтром 498 нм). Молекулярну вагу полідисперсій та відновлених розчинів длшя усіх зразків підраховували за 35 95238 допомогою способу Дебая при використанні послідовності підбору многочлена 1 у програмі Astra 4,72. Приклад 3 - клінічний дослід, що підтверджує імунізацію за допомогою Meningitec або MenC-ΤΤ кон'югату більшого розміру Фаза II, відкрите, контрольоване дослідження проводили для порівняння менінгококової кон'югатної вакцини серогрупи С (MenC) GSK Biologicals з кон'югатною вакциною Haemophilus influenzae bменінгококової серогрупи С GSK Biologicals (HibMenC) або Meningitec ®. Кожна доза Meningitec ® містила 10 мкг олігосахариду менінгококу серогрупи С, кон'югованого з 15 мкг CRM197, що виробляється Wyeth. MenC кон'югати GSK містили нативні полісахариди розміром приблизно 200 кДа, кон'юговані з токсоїдом правця (ТТ). Дослідження складалося з п'яти груп, кожна з яких була запрограмована на 100 осіб, розділених на дві паралельні гілки, як описано далі: У цьому дослідженні усі особи обох гілок дослідження одержували одну п'яту (1/5) дози Mencevax™ ACWY та супутню дозу Infanrix™ гекса у віці 12-15 місяців (дослідження місяць 0). У цих осіб відбирали два зразки крові (дослідження місяць 0 та дослідження місяць 1). Гілка 1 складалася з чотирьох груп дослідження первинної вакцинації, які піддавали примуванню у віці 3, 4 та 5 місяців за допомогою наступних вакцин: • Група K: кон'югат МеnС (10 мкг), не адсорбований (не адс), токсоїд правця (ТТ) та Infanrix™ гекса (MenC10-TT + Infanrix™ гекса) • Група L: Hib (10 мкг)-МеnС (10 мкг), не адс, ТТ кон'югат та Infanrix™ пента (Hib10-MenC10-TT + Infanrix™ пента) • Група М: Hib (5 мкг)-МеnС (5 мкг), не адс, ТТ кон'югат та Infanrix™ пента (Ніb5-MenC5-TT + Infanrix™ пента) • Група N: Meningitec™ та Infanrix™ гекса (Meningitec™ + Infanrix™ гекса) Дві вакцинні групи Hib-MenC-TT (групи L та М) залишали сліпими у бустерному дослідженні щодо точного складу кандидатної вакцини. Гілка 2 (Група О) складалася з відібраних за віком осіб, яких раніше не піддавали вакцинації при використанні менінгококової вакцини серогрупи С, але таких, що одержували традиційні педіатричні вакцини у відповідності з Німецькою постійною комісією з імунізації. Критерії для оцінки: 36 Імуногенність: Визначення бактерицидних титрів антитіл проти менінгокока С (SBA-MenC) за допомогою бактерицидного аналізу (граничне значення: розведення 1:8) та ELISA вимірювання антитіл проти менінгококової серогрупи С (граничне значення аналізу: 0,3 мкг/ мл), Hib полісахариду PRP (граничне значення аналізу: 0,15 мкг/ мл) та токсоїда правця (граничне значення аналізу: 0,1 МО/мл) у зразках крові, одержаних до вакцинації та приблизно через місяць після вакцинації усіх осіб. Статистичні методи: Демографія: Визначення середнього віку у місяцях (із середнім значенням, інтервалом, та стандартним відхиленням [СВ]), расовим та статевим складом АТР та загальної групи вакцинованих. Імуногенність: Проводили два аналізи на основі АТР групи на імуногенність (для аналізів імунної пам'яті та бустерної відповіді) або АТР групи на безпечність (для аналізу персистенції). Такі включали: Оцінка імунної відповіді для МеnС та бустерної відповіді для Hib та правця (за один місяць перед введенням та через один місяць після введення 1/5 дози чистої полісахаридної вакцини): • Визначення середнього геометричного значення титрів та концентрацій (GMT та GMC) з 95% довірчими інтервалами (95% ДІ) • Визначення проценту осіб з титром антитіл/концентрацією, вищою за передбачені граничні значення точно з 95% ДІ (значення серопозитивності/серозахисту) • Дослідження титрів антитіл/концентрації після вакцинації при використанні обернених інтегральних кривих • Обчислення стандартизованого асимптотичного 95% ДІ для відмінності у значенні серопозитивності/серозахисту між примованою групою (групи K, L, Μ та Ν) та непримованою групою (група О) • Визначення середньогеометричного значення індивідуального співвідношення SBA-MenC титру та концентрації анти-PSC з 95% ДІ • Визначення 95% ДІ для співвідношення GMT/C після вакцинації між групами K, L, Μ та контрольною групою N для анти-PRP та антиправцевих антитіл та між кожною з примованих груп (групи K, L, Μ та Ν) та непримованою групою (група О) для SBA-MenC та анти-PSC при використанні моделі ANOVA Результати Таблиця 1 Титри SBA-MenC та концентрація анти-PSC антитіл після бустерної вакцинації Антитіло SBA-MenC Анти-PSC Група K - MenC-TT L - HibMenC Μ - HibMenC Ν - Meningitec О - Контроль K - MenC-TT L - HibMenC Μ - HibMenC Ν - Meningitec O - Контроль N GMT/C 71 79 81 85 91 70 71 76 78 94 3508,9 2530,1 5385,4 1552,6 9,3 28,10 30,01 34,58 16,59 3,05 95% ДІ нижня грани- 95% ДІ верхня граця ниця 2580,1 4772,2 1831,7 3494,7 4425,0 6554,2 1044,4 2307,9 6,3 13,6 22,59 34,95 24,09 37,38 29,10 41,09 12,98 21,21 2,36 3,93 37 95238 Група K: особи, яких піддавали примуванню за допомогою МеnС10-ТТ + Infanrix гекса. Група L: особи, яких піддавали примуванню за допомогою Ніb10-МеnС10-ТТ + Infanrix пента. Група М: особи, яких піддавали примуванню за допомогою Ніb5МеnС5-ТТ + Infanrix пента. Група N: особи, яких піддавали примуванню за допомогою Meningitec + Infanrix гекса; Група О: особи контролю (тобто особи, яких не піддавали примуванню за допомогою МеnС кон'югатної вакцини) 38 N: кількість осіб з прийнятними результатами Більш високі титри антитіл проти МеnС та більш високі титри SBA були одержані шляхом примування за допомогою кон'югатних вакцин на основі МеnС полісахариду, що піддавався відбору на більший розмір (групи K, L та М) у порівнянні з олігосахаридною кон'югатною вакциною Meningitec. Таблиця 2 Середньогеометричне значення співвідношення титр SBA МеnС/концентрація анти-PSC Група K L Μ Ν O Час N 70 66 76 70 77 74 84 76 3 87 До Після До Після До Після До Після До Після GMR 49,470 126,138 36,528 90,200 51,298 164,950 22,571 90,168 91,634 2,708 В усіх трьох примованих групах (групи K, L, Μ та N) GMR значно підвищувалося у період часу перед бустерною вакцинацією - після бустерної вакцинації, що вказувало на наявність дозрівання Нижня границя 34,939 101,419 25,849 70,153 36,478 139,304 16,521 67,757 0,651 1,767 Верхня границя 70,044 156,882 51,621 115,975 72,139 195,318 30,837 119,991 12889,8 4,149 антитіл та їх функціональність. GMR у групі Μ (примовані за допомогою Ніb5-МеnС5-ТТ) було вищим, ніж у групі N (примовані за допомогою Meningitec™). Таблиця 3 Персистенція у віці 12-15 місяців безпосередньо перед введенням бустерної вакцини Кінцеві точки SBAMenC ≥ 1:8 SBAMenC ≥ 1:128 Анти-PSC ≥ 0,3 мкг/мл Анти-PSC ≥ 2 мкг/ мл Анти-PRP ≥ 0,15 мкг/мл Анти-PRP ≥ 1 мкг/ мл Анти-правцеві ≥ 0,1 МО/ мл Група K L Μ K L Μ K L Μ K L Μ K L Μ K L Μ K L Μ Ν 79 84 85 79 84 85 79 84 88 79 84 88 81 86 90 81 86 90 81 86 90 % 88,6 93,3 87,1 65,8 56,0 64,7 100,0 100,0 98,9 72,2 64,3 64,3 88,9 96,5 98,9 33,3 55,8 74,4 100,0 100,0 100,0 Група Κ: особи, яких піддавали примуванню за допомогою МеnС10-ТТ + Infanrix™ гекса; Група L: особи, яких піддавали примуванню за допомогою Ніb10-МеnС10-ТТ + Infanrix™ пента; Група М: особи, яких піддавали примуванню за допомогою Ніb5-МеnС5-ТТ + Infanrix™ пента; Група N: особи, яких піддавали примуванню за допомогою Meningitec™ + Infanrix™ гекса; Група Ν Ν Ν Ν Ν Ν Ν Ν Ν Ν Ν Ν Ν Ν Ν Ν Ν Ν Ν Ν Ν Ν 91 91 91 91 91 91 91 91 91 91 91 91 91 91 91 91 91 91 91 91 91 % 80,2 80,2 80,2 51,6 51,6 51,6 100,0 100,0 100,0 81,3 81,3 81,3 85,7 85,7 85,7 28,6 28,6 28,6 96,7 96,7 96,7 Відмінність Ν-Κ N-L Ν-Μ Ν-Κ N-L Ν-Μ Ν-Κ N-L Ν-Μ Ν-Κ N-L Ν-Μ Ν-Κ N-L Ν-Μ Ν-Κ N-L Ν-Μ Ν-Κ N-L Ν-Μ Значення % -8,4 -3,1 -6,8 -14,2 -4,3 -13,1 0,0 0,0 1,1 9,2 17,0 8,6 -3,2 -10,8 -13,2 -4,8 -27,2 -45,9 -3,3 -3,3 -3,3 Ν: кількість осіб з прийнятними результатами Більш високих титрів SBA проти МеnС досягали при примуванні за допомогою МеnС більшого розміру (групи K, L та М) у порівнянні з примуванням Meningitec™ на основі MenC-олігосахаридного кон'югату. Імунна пам'ять (група АТР для імуногенності) 39 95238 Введення 1/5 дози ACWY вакцини на основі чистого полісахариду викликало одержання дуже високого титру SBA-MenC в усіх чотирьох примованих групах зі значеннями 98,7-100% та 97,5100% осіб, примованих при використанні кандидатної вакцини, демонструючи титри ≥1:8 та ≥1:128, відповідно. У групі, примованій за допомогою Meningitec™, існувала тенденція до більш низького проценту осіб з титрами ≥1:128 (91,8%). Для порівняння, 17,6% непримованих осіб мали титри SBA MenC ≥1:8 та ≥1:128. Приклад 4 Фаза II клінічного дослідження при використанні НіbМеnАС-ТТ кон'югатної вакцини, змішаної з DTPw-HepB Модель дослідження: Відкрите, рандомізоване (1:1:1:1:1), одноцентрове дослідження з п'ятьма групами. П'ять груп одержували наступні режими вакцинації, відповідно, у віці 6, 10 та 14 тижнів. 40 • Tritanrix™-HepB/Hib-MenAC 2,5/2,5/2,5: далі згадується як 2,5/2,5/2,5 • Tritanrix™-HepB/Hib-l\/lenAC 2,5/5/5: далі згадується як 2,5/5/5 • Tritanrix™-HepB/Hib-MenAC 5/5/5: далі згадується як 5/5/5 • Tritanrix™-HepB + Hiberix™: далі згадується як Hiberix • Tritanrix-HepB/Hiberix™ + Meningitec™: далі згадується як Meningitec Зразки крові брали при введенні першої вакцинної дози (До) та через один місяць після введення третьої вакцинної дози (Після-доза 3). Tritanrix являє собою DTPw вакцину, яка продається GlaxoSmithKline Biologicals S.A. 105 осіб використовували у кожній з п'яти груп, вони давали загальну кількість 525 осіб у дослідженні. Таблиця 4 Склад GSK вакцинних композицій Компоненти на дозу (0,5 мл) Hib капсулярний полісахарид PRP, кон'югований до токсоїда правця (ТТ) Капсулярний полісахарид (PSA) Neisseria meningitidis А, кон'югований до ТТ Капсулярний полісахарид (PSC) Neisseria meningitidis С, кон'югований до ТТ 2,5/2,5/2,5* 2,5 мкг 2,5/5/5 2,5 мкг 5/5/5 5 мкг 2,5 мкг 5 мкг 5 мкг 2,5 мкг 5 мкг 5 мкг * Вакцина 2,5/2,5/2,5 являла собою розведення дози вакцини Hib-МеnАС 5/5/5GSK Biologicals', що містить 2,5 мкг кожного з PRP-TT, МеnА-ТТ та МеnС-ТТ. Hib-MenAC вакцинні композиції змішували перед введенням з Tntanirix-HepB GSK Biologicals', поєднаної з вакциною на основі дифтерії, правця, цільних клітин Bordetella pertussis - гепатиту В (DTPw-HB) (Tritanrix-HepB), що містить не менше 30 міжнародних одиниць (МО) дифтерійного токсоїда, не менше 60 МО токсоїда правця, не менше 4 МО вбитих клітин Bordetella pertussis та 10 мкг рекомбінантного поверхневого антигену гепатиту В. Стандартна терапія, доза, спосіб введення, номер партії Графік вакцинації/місце введення: Одна група одержувала вакцину Tritanrix-HepB внутрішньом'язово у ліве стегно та Hibenx внутрішньом'язово у праве стегно у віці 6, 10 та 14 тижнів Інша група одержувала Tritannx-HepB/Hiberix вакцину івнутрішньом'язово у ліве стегно та Meningitec вакцину у внутрішньом'язово у праве стегно у віці 6, 10 та 14 тижнів. Вакцина/склад/доза/номер парті): Вакцина Tritanrix-HepB, що використовувалася, була такою, як описано вище. Одна доза (0,5 мл) кон'югатної вакцини на основі Haemophilus influenzae типу b GSK Biologicals' Hibenx™ містила 10 мкг PRP, кон'югованого з токсоїдом правця. У групі Hibenx™ її змішували зі стерильним розріджувачем, а в групі Meningitec™ її змішували з Tntannx™-HepB. Одна доза (0,5 мл) вакцини MENINGITEC™ Wyeth Lederle's містила 10 мкг капсулярного олігосахариду менінгокової групи С, кон'югованого з 15 мкг білка Corynebactenum diphtheria CRM197 та солями алюмінія. Результати - імунні відповіді, одержані проти Hib, МеnА та МеnС 41 Висновок Порівняння результатів імуногенності, досягнутої при використанні кон'югатної вакцини на основі олігосахариду MenC-CRM197 та трьох композицій GSK, що містять полісахаридні кон'югати МеnА-ТТ та МеnС-ТТ, показало, що полісахаридні Men кон'югати є здатними викликати хорошу імуногенну відповідь, подібну до такої, що досягається при використанні олігосахаридної кон'югатної вакцини Meningitec. Усі досліджувані композиції давали відповідь на МеnС у 100% пацієнтів. Приклад 5 - Фаза II клінічне дослідження при сумісному введенні Hib MenCY та Infanrix пента згідно з графіком введення у 2-, 3- та 4 місяці Модель дослідження: Фаза II, відкрите (частково подвійне, сліпе*), рандомізоване, контрольоване, мультицентрове дослідження з 5 групами, які піддавалися трьохдозовому графіку вакцинації при використанні вакцин, представлених нижче: 95238 42 Група Hib-MenCY 2,5/5/5: Hib-MenCY (2,5/5/5 ) + Infanrix™ пента Група Hib-MenCY 5/10/10: Hib-MenCY (5/10/10) + Infanrix™ пента Група Hib-MenCY 5/5/5: Hib-MenCY (5/5/5) + Infanrix™ пента Група Hib-MenC: Hib-MenC (5/5) + Infanrix™ пента Група Menjugate: Menjugate™** + Infanrix™ гекса (Контроль). *Hib-MenCY 2,5/5/5, Hib-MenCY 5/10/10 та HibMenC вводили при використанні подвійного сліпого способу, у той час, як Hib-MenCY 5/5/5 група та група Menjugate були відкритими. Композиції 2,5/5/5, 5/10/10 та 5/5/5 Hib-MenCY містили МеnС нативні полісахариди та MenY полісахариди, які були мікропсевдозрідженими. **Menjugate™ містить 10 мкг МеnС олігосахаридів, кон'югованих з 12,5-25 мкг CRM197 на дозу, вказана вакцина виробляється Chiron. 43 95238 Вакцинація у +/- 2, 3, 4 місячному віці (Дослідження місяць 0, місяць 1 та місяць 2), та зразки крові (3,5 мл) від осіб за один місяць та через один місяць після первинної вакцинації (Дослідження місяць 0 та місяць 3). 44 Досліджувана вакцина, доза, спосіб введення, номер партії: Три дози вводили внутрішньом'язово з одномісячними інтервалами приблизно у віці 2, 3 та 4 місяців так, як описано нижче: Таблиця 6 Вакцини, що вводяться (Дослідження та Контроль), група, режим/сайт та доза Група Режим (вік у місяцях) Hib-MenCY 2,5/5/5 2, 3, та 4 Hib-MenCY 5/10/10 2, 3, та 4 Hib-MenCY 5/5/5 2, 3, та 4 Hib-MenC 2, 3, та 4 Menjugate™ 2, 3, та 4 Вакцини, що вводяться сумісно місце - у праву верхню частину стегна Hib (2,5 мкг)-МеnС-ТТ (5 мкг)- DTPa-HBV-IPV MenY-TT (5 мкг) (Infanrix™ пента) Hib (5 мкг)-МеnС-ТТ (10 мкг)- DTPa-HBV-IPV МеnY-ТТ (10 мкг) (Infanrix™ пента) Hib (5 мкг)-МеnС-ТТ (5 мкг)-MenY- DTPa-HBV-IPV TT (5 мкг) (Infanrix™ пента) Hib (5 мкг)-Меn С (5 мкг) DTPa-HBV-IPV (Infanrix™ пента) Menjugate™ DTPa-HBV-IPV/Hib (Infanrix™ гекса) Вакцинна доза, що вводиться місце - у ліву верхню частину стегна Імуногенність: Вимірювання титрів/концентрацій антитіл проти кожного вакцинного антигену: Перед введенням першої дози (Місяць 0) та приблизно через один місяць після введення третьої дози (Місяць 3) в усіх осіб на: SBA-MenC та SBA-MenY, анти-PSC та анти-PSY, анти-PRP, анти-Т, анти-FHA, анти-PRN та анти-РТ. При використанні сироваткової бактерицидної активності проти N. meningitidis серогруп С та Υ (SBA-MenC та SBA-MenY граничне значення: 1:8 та 1:128); ELISA аналіз з граничним значенням: ≥0,3 мкг/мл та ≥2 мкг/мл для антитіл проти полісахаридів N. meningitidis серогруп С та Υ (анти-PSC IgG та анти-PSY IgG); ≥0,15 мкг/мл та ≥1,0 мкг/мл для Нib полісахариду полірибозилрибітол фосфату (антиPRP IgG); 5EL од./мл для анти-FHA, анти-PRN, анти-РТ; ≥0,1 МО/мл антитіл до токсоїда правця (анти-ТТ). Тільки через місяць після введення третьої дози (Місяць 3) в усіх осіб: анти-D, анти-HBs та антитіл проти поліомієліту 1, 2 та 3. При використанні ELISA аналізів з граничними значеннями: 0,1 МО/мл для антитіл проти дифтерії (анти-D); ≥10 мМО/мл для антитіл проти гепатиту В (антиHBs); та граничні значення для аналізу мікронейтралізації: 1:8 для антитіл проти поліомієліту 1, 2 та 3 (анти-поліо 1, 2 та 3). Статистичні методи: Співвідношення серозахисту/серопозитивності та середньогеометричне значення концентрацій/(СМСЛЗМТ) з 95% довірчими інтервалами (95% ДІ) розраховували на групу, для SBA-MenC, анти-PSC, SBA-MenY, анти-PSY, анти-PRP, антитіл проти правця, анти-РТ, анти-FHA та анти-PRN за один місяць до вакцинації і через один місяць після вакцинації; для антитіл проти дифтерії, антиHBs, антитіл проти поліомієліту 1, антитіл проти поліомієліту 2 та антитіл проти поліомієліту 3 че рез місяць після вакцинації. Відповіді на вакцини (виникнення антитіл в осіб, які раніше були серонегативними або принаймні підтримання концентрацій антитіл в осіб, які раніше були серопозитивними) з 95% ДІ для анти-РТ, анти-PRN та антиFHA також обчислювали через один місяць після вакцинації. Зворотні криві розподілу для кожного антитіла через 3 місяці також представляли. Відмінність між Hib-MenCY та Hib-MenC групами, у порівнянні з Menjugate™ контрольною групою оцінювали пошуковим чином для кожного антитіла, за винятком SBA-MenY та анти-PSY, у значеннях (1) різниці між Menjugate™ групою (мінус) Hib-MenCY та Hib-MenC групами для одержання процентного значення кількості осіб, які мали значення, більші за вказані граничні значення або відповіді на вакцину, з їх стандартизованими 95% ДІ, (2) GMC або GMT співвідношення Menjugate™ групи та HibMenCY та Hib-MenC груп з їх 95% ДІ. Подібне порівняння проводили для оцінки відмінності між кожною парою Hib-MenCY композицій для антиPRP, SBA-MenC, анти-PSC, SBA-MenY, анти-PSY та анти-ТТ антитіл. Загальну кількість випадків місцевих та загальних симптомів та симптомів, які надаються на вимогу, підраховували для групи згідно з типом симптому, їх інтенсивністю та зв'язком з вакцинацією (як процент осіб, що повідомили загальні, місцеві та будь-які симптоми, які надаються на вимогу, протягом 8 днів після вакцинації та їх точний 95% ДІ). Кількість випадків симптомів, які надавалися на вимогу, підраховували на групу. Для симптомів типу 3 забезпечувалися початок виникнення