Високоафінне людське антитіло до людського ангіопоетину-2

Реферат: Винахід належить до виділеного людського антитіла або його антигензв'язувального фрагмента, яке специфічно зв'язується з людським ангіопоетином-2 (Ang-2), але по суті не зв'язується з hAng-1, фармацевтичної композиції, що містить антитіло проти Ang-2, та способів застосування такого антитіла при лікуванні пухлини, захворювання або порушення опосередкованого Ang-2. UA 108207 C2 (12) UA 108207 C2 UA 108207 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Галузь техніки Даний винахід стосується антитіл і їх антигензв'язувальних фрагментів, які специфічні до ангіопоетину-2 (Ang-2). Рівень техніки Ангіогенез являє собою біологічний процес, в результаті якого утворюються нові кровоносні судини. Аберантний ангіогенез асоційований з декількома хворобливими станами, що включають, наприклад, проліферативні ретинопатії, ревматоїдний артрит і псоріаз. Крім того, добре відомо, що ангіогенез є критичним для зростання і підтримування пухлини. Ангіопоетин-2 (Ang-2) є лігандом для рецептора Tie-2 (Tie-2), і, як було продемонстровано, він відіграє роль в ангіогенезі. Ang-2 також позначається в даній галузі техніки як ліганд Tie-2. (США 5643755; Yancopoulos et al., 2000, Nature 407:242-248). Антитіла і інші пептидні інгібітори, які зв'язуються з Ang-2, згадані в US 6166185; 7521053; 7205275; 2006/0018909 і 2006/0246071. Існує потреба в даній галузі техніки в створенні нових Ang-2-модулюючих агентів, що включають Ang-2-антитіла, які можуть використовуватися для лікування захворювань і патологічних станів, викликаних або обтяжених ангіогенезом. Короткий опис винаходу У даному винаході пропонуються людські антитіла, які зв'язуються з людським Ang-2. Автори даного винаходу в зв'язку з різними очевидними відомостями і дослідженнями зрозуміли необхідність створення Ang-2-інгібіторів, які не зв'язуються і не є антагоністами спорідненій молекулі Ang-1. Наприклад, попередні дослідження продемонстрували або передбачили корисну роль Ang-1 в гемостазі (див., наприклад, Li et al., 2001, Thrombosis and Haemostasis 85:191-374) і в захисті судинної системи дорослого від просочення плазми (див., наприклад, Thurston et al., 2000, Nature Medicine 6:460-463; Thurston et al., 1999, Science 286:2511-2514). Таким чином, авторам даного винаходу зрозуміло, що в певних анти-ангіогенних терапевтичних випадках може бути корисним збереження активності Ang-1. Відповідно, в даному винаході пропонуються антитіла, які специфічно зв'язуються з Ang-2, але по суті не зв'язуються з Ang-1. Даний винахід також включає антитіла, які блокують взаємодію між Ang-2 і його рецептором Tie2, але по суті не блокують взаємодію між Ang-1 і Tie-2. Антитіла за винаходом застосовуються серед іншого для інгібування ангіогенез-стимулюючої активності Ang-2 і для лікування захворювань і порушень, викликаних або пов'язаних з процесом ангіогенезу. Антитіла за винаходом можуть бути повнорозмірними (наприклад, антитіло IgG1 або IgG4) або можуть включати тільки антигензв'язувальну частину (наприклад, фрагмент Fab, F(ab') 2 або scFv), і можуть бути модифіковані з впливом на функціональність, наприклад, з виключенням залишкових ефекторних функцій. У одному втіленні, винахід включає антитіло або антигензв'язувальний фрагмент антитіла, що включає варіабельну ділянку важкого ланцюга (HCVR), що має амінокислотну послідовність, вибрану з групи, яка складається з SEQ ID NO: 2, 18, 22, 26, 42, 46, 50, 66, 70, 74, 90, 94, 98, 114, 118, 122, 138, 142, 146, 162, 166, 170, 186, 190, 194, 210, 214, 218, 234, 238, 242, 258, 262, 266, 282, 286, 290, 306, 310, 314, 330, 334, 338, 354, 358, 362, 378, 382, 386, 402, 406, 410, 426, 430, 434, 450, 454, 458, 474, 478, 482, 498, 502, 506, 514 і 516, або з по суті подібної їм послідовності, що має щонайменше 90 %, щонайменше 95 %, щонайменше 98 % або щонайменше 99 % ідентичності послідовності. У одному втіленні, винахід включає антитіло або антигензв'язувальний фрагмент антитіла, що включає HCVR, що має амінокислотну послідовність, вибрану з групи, яка складається з SEQ ID NO: 18, 42, 66, 162, 210, 266 і 434. У одному втіленні, винахід включає антитіло або антигензв'язувальний фрагмент антитіла, що включає варіабельну ділянку легкого ланцюга (LCVR), що має амінокислотну послідовність, вибрану з групи, яка складається з SEQ ID NO: SEQ ID NO: 10, 20, 24, 34, 44, 48, 58, 68, 72, 82, 92, 96, 106, 116, 120, 130, 140, 144, 154, 164, 168, 178, 188, 192, 202, 212, 216, 226, 236, 240, 250, 260, 264, 274, 284, 288, 298, 308, 312, 322, 332, 336, 346, 356, 360, 370, 380, 384, 394, 404, 408, 418, 428, 432, 442, 452, 456, 466, 476, 480, 490, 500 і 504, або з по суті подібної їм послідовності, що має щонайменше 90 %, щонайменше 95 %, щонайменше 98 % або щонайменше 99 % ідентичності послідовності. У одному втіленні, винахід включає антитіло або антигензв'язувальний фрагмент антитіла, що включає LCVR, що має амінокислотну послідовність, вибрану з групи, яка складається з SEQ ID NO: 20, 44, 68, 164, 212, 274 і 442. У конкретних втіленнях, антитіло або його антигензв'язувальний фрагмент включають пари амінокислотних послідовностей HCVR і LCVR (HCVR/LCVR), вибрані з групи, яка складається з SEQ ID NO: 2/10, 18/20, 22/24, 26/34, 42/44, 46/48, 50/58, 66/68, 70/72, 74/82, 90/92, 94/96, 98/106, 114/116, 118/120, 122/130, 138/140, 142/144, 146/154, 162/164, 166/168, 170/178, 186/188, 190/192, 194/202, 210/212, 214/216, 218/226, 234/236, 238/240, 242/250, 258/260, 262/264, 1 UA 108207 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 266/274, 282/284, 286/288, 290/298, 306/308, 310/312, 314/322, 330/332, 334/336, 338/346, 354/356, 358/360, 362/370, 378/380, 382/384, 386/394, 402/404, 406/408, 410/418, 426/428, 430/432, 434/442, 450/452, 454/456, 458/466, 474/476, 478/480, 482/490, 498/500 і 502/504. У одному втіленні, антитіло або його фрагмент включають HCVR і LCVR, вибрані з пар амінокислотних послідовностей SEQ ID NO: 18/20, 42/44, 66/68, 162/164, 210/212, 266/274 і 434/442. У наступному аспекті, у винаході пропонується антитіло або антигензв'язувальний фрагмент антитіла, що включає домен важкого ланцюга CDR3 (HCDR3), що має амінокислотну послідовність, вибрану з групи, яка складається з SEQ ID NO: 8, 32, 56, 80, 104, 128, 152, 176, 200, 224, 248, 272, 296, 320, 344, 368, 392, 416, 440, 464, 488 і 512, або з по суті подібної їм послідовності, що має щонайменше 90 %, щонайменше 95 %, щонайменше 98 % або щонайменше 99 % ідентичності послідовності; і домен легкого ланцюга CDR3 (LCDR3), вибраний з групи, яка складається з SEQ ID NO: 16, 40, 64, 88, 112, 136, 160, 184, 208, 232, 256, 280, 304, 328, 352, 376, 400, 424, 448, 472 і 496, або з по суті подібної їм послідовності, що має щонайменше 90 %, щонайменше 95 %, щонайменше 98 % або щонайменше 99 % ідентичності послідовності. У конкретних втіленнях, антитіло або антигензв'язувальний фрагмент антитіла включають пару амінокислотних послідовностей HCDR3/LCDR3, вибрану з групи, яка складається з SEQ ID NO: 8/16, 32/40, 56/64, 80/88, 104/112, 128/136, 152/160, 176/184, 200/208, 224/232, 248/256, 272/280, 296/304, 320/328, 344/352, 368/376, 392/400, 416/424, 440/448, 464/472 і 488/496. У одному втіленні, антитіло або антигензв'язувальний фрагмент антитіла включають пару амінокислотних послідовностей HCDR3/LCDR3, вибрану з групи, яка складається з SEQ ID NO: 8/16, 32/40, 56/64, 152/160, 200/208, 272/280 і 440/448. Не обмежуючі приклади анти-Ang-2 антитіл, що містять ці пари HCDR3/LCDR3, являють собою антитіла, позначені H1 H685, H1 H690, H1 H691, H1 H696, H1 H706, H1 M724 і H2M744, відповідно. У наступному втіленні, винахід включає антитіло або його фрагмент, що додатково включає домен HCDR1, що має амінокислотну послідовність, вибрану з групи, яка складається з SEQ ID NO: 4, 28, 52, 76, 100, 124, 148, 172, 196, 220, 244, 268, 292, 316, 340, 364, 388, 412, 436, 460, 484 і 508, або з по суті подібної їм послідовності, що має щонайменше 90 %, щонайменше 95 %, щонайменше 98 % або щонайменше 99 % ідентичності послідовності; домен важкого ланцюга CDR2 (HCDR2), що має амінокислотну послідовність, вибрану з групи, яка складається з SEQ ID NO: 6, 30, 54, 78, 102, 126, 150, 174, 198, 222, 246, 270, 294, 318, 342, 366, 390, 414, 438, 462, 486 і 510, або з по суті подібної їм послідовності, що має щонайменше 90 %, щонайменше 95 %, щонайменше 98 % або щонайменше 99 % ідентичності послідовності; домен LCDR1, що має амінокислотну послідовність, вибрану з групи, яка складається з SEQ ID NO: 12, 36, 60, 84, 108, 132, 156, 180, 204, 228, 252, 276, 300, 324, 348, 372, 396, 420, 444, 468 і 492, або з по суті подібної їм послідовності, що має щонайменше 90 %, щонайменше 95 %, щонайменше 98 % або щонайменше 99 % ідентичності послідовності; і домен LCDR2, що має амінокислотну послідовність, вибрану з групи, яка складається з SEQ ID NO: 14, 38, 62, 86, 110, 134, 158, 182, 206, 230, 254, 278, 302, 326, 350, 374, 398, 422, 446, 470 і 494, або з по суті подібної їм послідовності, що має щонайменше 90 %, щонайменше 95 %, щонайменше 98 % або щонайменше 99 % ідентичності послідовності. Конкретні не обмежуючі типові антитіла і антигензв'язувальні фрагменти за винаходом включають домени HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 і LCDR3, відповідно, вибрані з групи, яка складається з: (i) SEQ ID NO: 4, 6, 8, 12, 14 і 16 (наприклад, H1 H685); (ii) SEQ ID NO: 28, 30, 32, 36, 38 і 40 (наприклад, H1 H690); (iii) SEQ ID NO: 52, 54, 56, 60, 62 і 64 (наприклад, H1 H691); (iv) SEQ ID NO: 148, 150, 152, 156, 158 і 160 (наприклад, H1 H696); (v) SEQ ID NO: 196, 198, 200, 204, 206 і 208 (наприклад, H1 H706); (vi) SEQ ID NO: 268, 270, 272, 276, 278 і 280 (наприклад, H1 M724); і (vii) SEQ ID NO: 436, 438, 440, 444, 446 і 448 (наприклад, H2M744). У спорідненому втіленні, винахід включає антитіло або антигензв'язувальний фрагмент антитіла, яке специфічно зв'язується з Ang-2, де антитіло або фрагмент включають домени важкого і легкого ланцюга CDR (тобто, CDR1, CDR2 і CDR3), що містяться в послідовностях варіабельних доменів важкого і легкого ланцюга, вибраних з групи, яка складається з SEQ ID NO: 2/10, 18/20, 22/24, 26/34, 42/44, 46/48, 50/58, 66/68, 70/72, 74/82, 90/92, 94/96, 98/106, 114/116, 118/120, 122/130, 138/140, 142/144, 146/154, 162/164, 166/168, 170/178, 186/188, 190/192, 194/202, 210/212, 214/216, 218/226, 234/236, 238/240, 242/250, 258/260, 262/264, 266/274, 282/284, 286/288, 290/298, 306/308, 310/312, 314/322, 330/332, 334/336, 338/346, 354/356, 358/360, 362/370, 378/380, 382/384, 386/394, 402/404, 406/408, 410/418, 426/428, 430/432, 434/442, 450/452, 454/456, 458/466, 474/476, 478/480, 482/490, 498/500 і 502/504. У одному втіленні, антитіло або його фрагмент включають послідовності CDR, що містяться 2 UA 108207 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 всередині HCVR і LCVR, вибрані з пар амінокислотних послідовностей SEQ ID NO: 18/20, 42/44, 66/68, 162/164, 210/212, 266/274 і 434/442. У іншому аспекті, у винаході пропонуються молекули нуклеїнової кислоти, що кодують антиAng-2 антитіла або їх фрагменти. Також винаходом охоплюються рекомбінантні експресуючі вектори, які несуть нуклеїнові кислоти за винаходом, і клітини-хазяїни, в які вводяться такі вектори, а також способи отримання антитіл шляхом культивування клітин в умовах, що дають можливість продукування антитіл і витягання отриманих антитіл. У одному втіленні, у винаході пропонується антитіло або його фрагмент, які включають HCVR, що кодується послідовністю нуклеїнової кислоти, вибраною з групи, яка складається з SEQ ID NO: 1, 17, 21, 25, 41, 45, 49, 65, 69, 73, 89, 93, 97, 113, 117, 121, 137, 141, 145, 161, 165, 169, 185, 189, 193, 209, 213, 217, 233, 237, 241, 257, 261, 265, 281, 285, 289, 305, 309, 313, 329, 333, 337, 353, 357, 361, 377, 381, 385, 401, 405, 409, 425, 429, 433, 449, 453, 457, 473, 477, 481, 497, 501, 505, 513 і 515, або по суті з ідентичної їм послідовності, що має щонайменше 90 %, щонайменше 95 %, щонайменше 98 %, або щонайменше 99 % ідентичності послідовності. У одному втіленні, антитіло або його фрагмент включають HCVR, що кодується послідовністю нуклеїнової кислоти, вибраною з групи, яка складається з SEQ ID NO: 17, 41, 65, 161, 209, 265 і 433. У одному втіленні, у винаході пропонується антитіло або його фрагмент, які включають LCVR, що кодується послідовністю нуклеїнової кислоти, вибраною з групи, яка складається з SEQ ID NO: 9, 19, 23, 33, 43, 47, 57, 67, 71, 81, 91, 95, 105, 115, 119, 129, 139, 143, 153, 163, 167, 177, 187, 191, 201, 211, 215, 225, 235, 239, 249, 259, 263, 273, 283, 287, 297, 307, 311, 321, 331, 335, 345, 355, 359, 369, 379, 383, 393, 403, 407, 417, 427, 431, 441, 451, 455, 465, 475, 479, 489, 499 і 503, або по суті з ідентичної їм послідовності, що має щонайменше 90 %, щонайменше 95 %, щонайменше 98 %, або щонайменше 99 % ідентичності послідовності. У одному втіленні, антитіло або його фрагмент включають LCVR, що кодується послідовністю нуклеїнової кислоти, вибраною з групи, яка складається з SEQ ID NO: 19, 43, 67, 163, 211, 273 і 441. У одному втіленні, у винаході пропонується антитіло або антигензв'язувальний фрагмент антитіла, що включає домен HCDR3, що кодується нуклеотидною послідовністю, вибраною з групи, яка складається з SEQ ID NO: 7, 31, 55, 79, 103, 127, 151, 175, 199, 223, 247, 271, 295, 319, 343, 367, 391, 415, 439, 463, 487 і 511, або з по суті ідентичної їм послідовності, що має щонайменше 90 %, щонайменше 95 %, щонайменше 98 % або щонайменше 99 % ідентичності послідовності; і домен LCDR3, що кодується нуклеотидною послідовністю, вибраною з групи, яка складається з SEQ ID NO: 15, 39, 63, 87, 111, 135, 159, 183, 207, 231, 255, 279, 303, 327, 351, 375, 399, 423, 447, 471 і 495, або з по суті подібної їм послідовності, що має щонайменше 90 %, щонайменше 95 %, щонайменше 98 % або щонайменше 99 % ідентичності послідовності. У одному втіленні, антитіло або його фрагмент включають послідовності HCDR3 і LCDR3, що кодуються парою послідовностей нуклеїнової кислоти, вибраною з групи, яка складається з SEQ ID NO: 7/15, 31/39, 55/63, 151/159, 199/207, 271/279 і 439/447. У наступному втіленні, антитіло або його фрагмент додатково включають: домен HCDR1, що кодується нуклеотидною послідовністю, вибраною з групи, яка складається з SEQ ID NO: 3, 27, 51, 75, 99, 123, 147, 171, 195, 219, 243, 267, 291, 315, 339, 363, 387, 411, 435, 459, 483 і 507, або з по суті ідентичної їм послідовності, що має щонайменше 90 %, щонайменше 95 %, щонайменше 98 % або щонайменше 99 % ідентичності послідовності; домен HCDR2, що кодується нуклеотидною послідовністю, вибраною з групи, яка складається з SEQ ID NO: 5, 29, 53, 77, 101, 125, 149, 173, 197, 221, 245, 269, 293, 317, 341, 365, 389, 413, 437, 461, 485 і 509, або з по суті подібної їм послідовності, що має щонайменше 90 %, щонайменше 95 %, щонайменше 98 % або щонайменше 99 % ідентичності послідовності; домен LCDR1, що кодується нуклеотидною послідовністю, вибраною з групи, яка складається з SEQ ID NO: 11, 35, 59, 83, 107, 131, 155, 179, 203, 227, 251, 275, 299, 323, 347, 371, 395, 419, 443, 467 і 491, або з по суті ідентичної їм послідовності, що має щонайменше 90 %, щонайменше 95 %, щонайменше 98 % або щонайменше 99 % ідентичності послідовності; і домен LCDR2, що кодується нуклеотидною послідовністю, вибраною з групи, яка складається з SEQ ID NO: 13, 37, 61, 85, 109, 133, 157, 181, 205, 229, 253, 277, 301, 325, 349, 373, 397, 421, 445, 469 і 493, або з по суті подібної їм послідовності, що має щонайменше 90 %, щонайменше 95 %, щонайменше 98 % або щонайменше 99 % ідентичності послідовності. У одному втіленні, антитіло або його фрагмент включають послідовності CDR важкого і легкого ланцюга, що кодуються послідовностями нуклеїнових кислот SEQ ID NO: 17 і 19; SEQ ID NO: 41 і 43; SEQ ID NO: 65 і 67; SEQ ID NO: 161 і 163; SEQ ID NO: 209 і 211; SEQ ID NO: 265 і 273; або SEQ ID NO: 433 і 441. 3 UA 108207 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Винахід охоплює анти-Ang-2 антитіла, що мають модифікований профіль глікозилування. У деяких застосуваннях може використовуватися модифікація для видалення сайтів глікозилування. Наприклад, даний винахід охоплює модифіковані варіанти будь-якого антитіла, представленого в даному документі, де модифікований варіант позбавлений фукозного компонента, присутнього на олігосахаридному ланцюзі, наприклад, для збільшення функції антитілозалежної клітинної цитотоксичності (ADCC) (див. Shield et al. (2002) JBC 277:26733). У інших застосуваннях, може бути здійснена модифікація галактозилування з метою модифікації комплементзалежної цитотоксичності (CDC). У іншому аспекті, у винаході пропонується фармацевтична композиція, що включає рекомбінантне людське антитіло або його фрагмент, які специфічно зв'язуються з Ang-2, і фармацевтично прийнятний носій або розріджувач. У спорідненому аспекті, винахід описує композицію, яка являє собою комбінацію інгібітору Ang-2 і другого терапевтичного агента. У одному втіленні, інгібітор Ang-2 являє собою антитіло або його фрагмент. У одному втіленні, другий терапевтичний агент являє собою будь-який агент, який переважно об'єднується з інгібітором Ang-2. Типові агенти, які можуть переважно об'єднуватися з інгібітором Ang-2, включають без обмеження будь-який агент, який інгібує або зменшує ангіогенез, інші протиракові терапевтичні агенти, протизапальні агенти, інгібітори цитокінів, інгібітори факторів росту, протигемопоетичні фактори, нестероїдні протизапальні лікарські засоби (NSAID), противірусні агенти і антибіотики. Ще в одному аспекті, у винаході пропонуються способи інгібування активності Ang-2 із застосуванням анти-Ang-2 антитіла або антигензв'язувального фрагмента антитіла за винаходом, де терапевтичні способи включають введення терапевтично ефективної кількості фармацевтичної композиції, що включає антитіло або антигензв'язувальний фрагмент антитіла за винаходом. Порушення, що піддається лікуванню, являє собою будь-яке захворювання або патологічний стан, який поліпшується, ослабляється, інгібується або запобігається шляхом видалення, інгібування або зменшення активності Ang-2. Переважно, анти-Ang-2 антитіло або фрагмент антитіла за винаходом застосовуються для лікування будь-якого захворювання або патологічного стану, що викликається, асоціюється або зберігається за допомогою процесу ангіогенезу. У конкретних втіленнях винаходу, анти-Ang-2 антитіла або їх антигензв'язувальні ділянки застосовуються для лікування раку. У контексті протиракових терапій, анти-Ang-2 антитіла за винаходом або їх антигензв'язувальні ділянки можуть вводитися окремо або в комбінації з іншими протираковими терапевтичними антитілами, хіміотерапевтичними агентами і/або з променевою терапією. У інших втіленнях даного винаходу анти-Ang-2 антитіла або їх антигензв'язувальні фрагменти застосовуються для лікування одного або декількох очних порушень, наприклад, вікової макулярної дегенерації, діабетичної ретинопатії і т. д., і/або одного або декількох запальних або інфекційних захворювань. Інші втілення стають очевидними в результаті огляду докладного опису. Короткий опис креслень Фіг. 1 являє собою вирівнювання останніх 88 С-кінцевих амінокислот людського Ang-2 (залишки 409-496 SEQ ID NO:518) з відповідною амінокислотною послідовністю людського Ang1 (SEQ ID NO:531). Залишки, які відрізняються у hAng-1 і hAng-2, відмічені білим шрифтом і чорною штриховкою. Зірочками (*) відмічені амінокислоти hAng-2, які, як було продемонстровано за допомогою аналізу кристалічної структури, взаємодіють з людським Tie-2. Див. Barton et al., Nat. Struct. Mol. Biol. 73:524-532 (2006). Трикутниками (∆) відмічені положення амінокислот, взаємодіючих з Tie-2, які відрізняються у hAng-2 і hAng-1. Фіг. 2 (Панелі A-C) зображує результати Вестерн-блот аналізів, які ілюструють міру, до якої Ang-2-зв'язувальні молекули інгібують або не здатні інгібувати індуковане за допомогою Ang-1 фосфорилування Tie-2. Фіг. 3 являє собою короткий виклад експерименту зв'язування з точковим мутантом Ang2FD-mFc Прикладу 13, що демонструє амінокислотні заміни, які приводять в результаті до більше ніж п'ятикратного зменшення T½ дисоціації (зображено зафарбованими колами •) відносно дикого типу для різних тестованих антитіл і пептитіл (peptibodies). Докладний опис Перед тим як даний винахід буде додатково описано, потрібно розуміти, що цей винахід не обмежується конкретними описаними методами і експериментальними умовами, оскільки такі методи і умови можуть варіюватися. Також потрібно розуміти, що використана в даному документі термінологія необхідна тільки для цілей опису конкретних втілень, і не призначена для обмеження рамок даного винаходу, які будуть обмежені тільки прикладеною формулою винаходу. 4 UA 108207 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Якщо не визначено інакше, всі технічні і наукові терміни, використані в даному документі, мають те ж значення, яке вкладається в них звичайним фахівцем в галузі, до якої належить даний винахід. При використанні в даному документі, термін "приблизно", коли він використовується відносно конкретного приведеного значення, означає, що значення може варіюватися відносно приведеного значення не більше ніж на 1 %. Наприклад, при використанні в даному документі, вираження "приблизно 100" включає 99 і 101 і всі значення між ними (наприклад, 99,1, 99,2, 99,3, 99,4 і т. д.). Хоча будь-які методи і матеріали, подібні або еквівалентні тим, що описані в даному документі, також можуть використовуватися на практиці або при тестуванні даного винаходу, далі будуть описані переважні методи і матеріали. Визначення При використанні в даному документі, термін "ангіопоетин-2" або "Ang-2", поки не визначено, що він має походження з виду, відмінного від людини, (наприклад, "мишачий Ang-2", "мавпячий Ang-2" і т. д.), означає людський Ang-2 або його біологічно активний фрагмент (наприклад, фрагмент білка Ang-2, який здатний індукувати ангіогенез in vitro або in vivo). Людський Ang-2 кодується послідовністю нуклеїнової кислоти, представленою в SEQ ID NO:517, і має амінокислотну послідовність SEQ ID NO:518. Амінокислотні послідовності мишачого і мавпячого білків Ang-2 доступні з бази даних NCBI білкових послідовностей під Реєстраційними номерами NP_031452 і BAE89705.1, відповідно. Термін "ангіопоетин-1" або "Ang-1", доки не визначено, що він має походження з виду, відмінного від людини, (наприклад, "мишачий Ang-1", "мавпячий Ang-1" і т. д.), означає людський Ang-1 або його біологічно активний фрагмент. Людський Ang-1 має амінокислотну послідовність, представлену в базі даних NCBI білкових послідовностей під Реєстраційним номером AAB50557. Термін "Tie-2" (що також позначається в рівні техніки як "TEK"), доки не визначено, що він має походження з виду, відмінного від людини, (наприклад, "мишачий Tie-2", "мавпячий Tie-2" і т. д.), означає людський Tie-2 або його біологічно активний фрагмент. Людський Tie-2 має амінокислотну послідовність, представлену в базі даних NCBI білкових послідовностей під Реєстраційним номером AAA61130. Термін "антитіло", при використанні в даному документі, призначений для позначення молекул імуноглобулінів, що включають чотири поліпептидні ланцюги, два важких (Н) ланцюги і два легких (L) ланцюги, пов'язаних між собою дисульфідними зв'язками, а також їх мультимери (наприклад, IgM). Кожний важкий ланцюг включає варіабельну ділянку важкого ланцюга (позначений в даному документі як HCVR або VH) і константну ділянку важкого ланцюга. Константна ділянка важкого ланцюга включає три домену, C H1, CH2 і CH3. Кожний важкий ланцюг включає варіабельну ділянку легкого ланцюга (позначений в даному документі як LCVR або VL) і константну ділянку легкого ланцюга. Константна ділянка легкого ланцюга включає одну домен (CL1). Ділянки VH і VL можуть бути додатково поділені на ділянки гіперваріабельності, що називаються ділянками, які відповідають за комплементарність зв'язування (CDR), перемежаючись ділянками, які є більш консервативними, що називаються каркасними областями (FR). Кожний VH і VL складається з трьох CDR і чотирьох FR, розташованих від Nкінця до С-кінця в наступному порядку: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. У різних втіленнях винаходу, FR-ділянки анти-Ang-2 антитіла (або його антигензв'язувальної ділянки) можуть бути ідентичні з людськими зародковими послідовностями або можуть бути природно або штучно модифіковані. Консенсусна амінокислотна послідовність може визначатися на основі паралельного аналізу двох або декількох CDR. При використанні в даному документі, термін "антитіло" також включає антигензв'язувальні фрагменти повнорозмірних молекул антитіла. При використанні в даному документі, терміни "антигензв'язувальна ділянка" антитіла, "антигензв'язувальний фрагмент" антитіла і тому подібні, включають будь-який природний, ферментативно отримуваний, синтетичний або генетично сконструйований поліпептид або глікопротеїн, який специфічно зв'язується з антигеном з утворенням комплексу. Антигензв'язувальні фрагменти антитіла можуть бути виділені, наприклад, з повнорозмірних молекул антитіла з використанням будь-яких прийнятних стандартних методів, таких як протеолітичний гідроліз або методи генетичної інженерії, що включають маніпуляцію і експресію ДНК, що кодує варіабельні і необов'язково константні домени антитіла. Така ДНК відома і загальнодоступна, наприклад, з комерційних джерел, ДНКбібліотек (що включають, наприклад, фагові бібліотеки антитіл), або може бути синтезована. ДНК може бути секвенована, і з нею проводять маніпуляції з використанням хімічних методів або з використанням методів молекулярної біології, наприклад, для розташування одного або декількох варіабельних і/або константних доменів у прийнятній конфігурації або для введення кодонів, створення цистеїнових залишків, модифікації, вставки або делеції амінокислот і т. д. 5 UA 108207 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Не обмежуючі приклади антигензв'язувальних фрагментів включають: (i) Fab-фрагменти; (ii) F(ab')2-фрагменти; (iii) Fd-фрагменти; (iv) Fv-фрагменти; (v) одноланцюжкові молекули Fv (scFv); (vi) dAb-фрагменти; і (vii) мінімальні розпізнавальні компоненти, що складаються з амінокислотних залишків, які імітують гіперваріабельну ділянку антитіла (наприклад, виділена ділянка, що відповідає за комплементарність зв'язування (CDR)). При використанні в даному документі, вираз "антигензв'язувальний фрагмент" також охоплює інші сконструйовані молекули, такі як діатіла, триатіла, тетратіла і мінітіла. Антигензв'язувальний фрагмент антитіла також буде включати, щонайменше один варіабельний домен. Варіабельний домен може бути будь-якого розміру або амінокислотного складу і, як правило, буде включати, щонайменше один CDR, який розташований по сусідству або знаходиться в одній рамці з однією або декількома каркасними послідовностями. У антигензв'язувальних фрагментах, що містять домен VH, асоційований з доменом VL, домени VH і VL можуть знаходитися один відносно одного у прийнятному розташуванні. Наприклад, варіабельна ділянка може бути димерною і може містити димери V H-VH, VH-VL або VL-VL. Альтернативно, антигензв'язувальний фрагмент антитіла може містити мономерний домен V H або VL. У конкретних втіленнях, антигензв'язувальний фрагмент антитіла може містити, щонайменше один варіабельний домен, ковалентно пов'язаний, щонайменше з одним константним доменом. Не обмежуючі типові конфігурації варіабельних і константних доменів, які можуть виявитися всередині антигензв'язувального фрагмента антитіла за даним винаходом, включають: (i) VH-CH1; (ii) VH-CH2; (iii) VH-CH3; (iv) VH-CH1-CH2; (V) VH-CH1-CH2-CH3; (vi) VH-CH2-CH3; (vii) VH-CL; (viii) VL-CH1; (ix) VL-CH2; (х) VL-CH3; (xi) VL-CH1-CH2; (xii) VL-CH1-CH2CH3; (xiii) VL-CH2-CH3; і (xiv) VL-CL. У будь-якій конфігурації варіабельних і константних доменів, що включає будь-яку з типових конфігурацій, приведених вище, варіабельні і константні домени можуть бути пов'язані або безпосередньо один з одним, або можуть бути пов'язані за допомогою повної або часткової шарнірної або лінкерної ділянки. Шарнірна ділянка складається щонайменше з 2 (наприклад, 5, 10, 15, 20, 40, 60 або більше) амінокислот, які приводять в результаті до отримання гнучкого або напівгнучкого зв'язку між сусідніми варіабельними і/або константними доменами в одній поліпептидній молекулі. Крім того, антигензв'язувальний фрагмент антитіла за даним винаходом може включати гомодимер або гетеродимер (або інший мультимер) будь-якого з конфігурацій варіабельних і константних доменів, перерахованих вище, в нековалентному зв'язку один з одним і/або з одним або декількома мономерними доменами VH або VL (наприклад, за допомогою дисульфідного зв'язку(ів)). Також як і повнорозмірні молекули антитіл, антигензв'язувальні фрагменти можуть бути моноспецифічними або мультиспецифічними (наприклад, біспецифічними). Мультиспецифічний антигензв'язувальний фрагмент антитіла, як правило, буде включати, щонайменше два різних варіабельні домени, де кожний варіабельний домен здатний до специфічного зв'язування з окремим антигеном або з різними епітопами на одному антигені. Будь-який мультиспецифічний формат антитіла, що включає типові біспецифічні формати антитіл, розкритих в даному документі, може бути адаптований для застосування в контексті антигензв'язувального фрагмента антитіла за даним винаходом з використанням стандартних методів, доступних з рівня техніки. Константна ділянка антитіла має значення для здатності антитіла фіксувати комплемент і опосередковувати клітинно-опосередковану цитотоксичність. Таким чином, ізотип антитіла може бути вибраний на основі того, чи доцільно для антитіла опосередкування цитотоксичності. При використанні в даному документі, мається на увазі, що термін "людське антитіло" включає антитіла, що містять варіабельні і константні ділянки, виділені з послідовностей людських зародкових імуноглобулінів. Людські антитіла за винаходом можуть включати амінокислотні залишки, що не кодуються людськими послідовностями зародкових імуноглобулінів (наприклад, мутації, введені неспецифічним або сайтспецифічним мутагенезом in vitro або соматичними мутаціями in vivo), наприклад, в ділянках CDR і особливо в CDR3. Однак, при використанні в даному документі, мається на увазі, що термін "людське антитіло" не включає антитіла, в яких послідовності CDR, отримані із зародкової лінії інших видів ссавців, таких як миші, були пересаджені в людські каркасні послідовності. При використанні в даному документі, мається на увазі, що термін "рекомбінантне людське антитіло" включає всі людські антитіла, які отримують, експресують, створюють або виділяють за допомогою рекомбінантних способів, такі як антитіла, експресування з використанням рекомбінантного експресуючого вектора, трансфікованого в клітину-хазяїна (описано нижче), антитіла, виділені з рекомбінантної комбінаторної бібліотеки людських антитіл (описано нижче), антитіла, виділені з тварини (наприклад, миші), які є трансгенними для людських генів 6 UA 108207 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 імуноглобулінів (див., наприклад, Taylor et al. (1992) Nucl. Acids Res. 20:6287-6295), або антитіла, отримані, експресовані, створені або виділені за допомогою будь-якого іншого способу, який включає сплайсинг послідовностей людських генів імуноглобулінів з іншими ДНКпослідовностями. Такі рекомбінантні людські антитіла містять варіабельні і константні ділянки, отримані з послідовностей людських зародкових імуноглобулінів. У деяких втіленнях, однак, такі рекомбінантні людські антитіла можуть бути піддані in vitro-мутагенезу (або, якщо використовуються трансгенні відносно людини послідовності імуноглобулінів тварин, то соматичному мутагенезу in vivo), і, таким чином, амінокислотні послідовності ділянок V H і VL рекомбінантних антитіл є послідовностями, які хоча і походять з і належать до людських зародкових послідовностей VH і VL, при цьому не можуть існувати в природних умовах в зародковому репертуарі людських антитіл in vivo. Людські антитіла можуть існувати в двох формах, які пов'язані з шарнірною гетерогенністю. У одній формі, молекула імуноглобуліну включає стабільну конструкцію з чотирьох ланцюгів приблизно 150-160 кДа, в якій димери підтримуються разом за допомогою взаємодії дисульфідного зв'язку важкого ланцюга. У другій формі, димери не пов'язані за допомогою дисульфідних зв'язків між ланцюгами, і утворюється молекула з молекулярною масою приблизно 75-80 кДа, що складається з ковалентно пов'язаних легкого і важкого ланцюга (напівантитіло). Ці форми дуже важко розділити навіть після афінного очищення. Частота появи другої форми в різних інтактних ізотипах IgG асоційована зокрема з ізотипом шарнірної ділянки антитіла. Єдина амінокислотна заміна в шарнірній ділянці шарніра людського IgG4 може значно зменшувати частоту появи другої форми (Angal et al. (1993) Molecular Immunology 30:105) до рівня, який, як правило, спостерігається з використанням шарніра людського IgG1. Даний винахід охоплює антитіла, що містять одну або декілька мутацій в шарнірній ділянці, CH2 або CH3 ділянки, які можуть бути доцільні, наприклад, при отриманні антитіла для поліпшення виходу цільової форми антитіла. При використанні в даному документі, мається на увазі, що "виділене антитіло" означає антитіло, яке по суті вільне від інших антитіл, що мають відмінну антигенну специфічність (наприклад, виділене антитіло, яке специфічно зв'язується з людським Ang-2 або з фрагментом людського Ang-2, по суті вільне від антитіл, які специфічно зв'язуються з антигенами, відмінними від людського Ang-2). Термін "специфічно зв'язується" або йому подібні означає, що антитіло або його антигензв'язувальний фрагмент утворюють з антигеном комплекс, який відносно стабільний при фізіологічних умовах. Специфічне зв'язування може характеризуватися -8 KD приблизно 1×10 М або менше. Методи визначення того, чи специфічно зв'язуються дві молекули, добре відомі з рівня техніки і включають, наприклад, рівноважний діаліз, поверхневий плазмонний резонанс і тому подібні. Виділене антитіло, яке специфічно зв'язується з людським Ang-2, може однак мати перехресну реактивність з іншими антигенами, такими як молекули Ang-2 з інших видів. Крім того, виділене антитіло може бути по суті вільним від іншого клітинного матеріалу і/або хімічних речовин. При використанні в даному документі, мається на увазі, що "нейтралізуюче" або "блокуюче" антитіло означає антитіло, зв'язування якого з Ang-2 блокує взаємодію між Ang-2 і його рецептором (Tie-2) і/або приводить в результаті до інгібування, щонайменше однієї біологічної функції Ang-2. Інгібування, викликане антитілом, нейтралізуючим або блокуючим Ang-2, необов'язково повинне бути повним при умові, що воно детектується при використанні прийнятного аналізу. Типові аналізи для детектування інгібування Ang-2 описані в іншому місці цього документа. Повністю людські анти-Ang-2 антитіла, розкриті в даному документі, можуть включати одну або декілька амінокислотних замін, вставок і/або делецій в каркасній і/або в ділянках CDR варіабельних доменів важкого і легкого ланцюга в порівнянні з відповідними зародковими послідовностями. Такі мутації легко можуть бути ідентифіковані шляхом порівняння амінокислотних послідовностей, розкритих в даному документі, із зародковими послідовностями, доступними, наприклад, із загальнодоступних баз даних послідовностей антитіл. Даний винахід включає антитіла і їх антигензв'язувальні фрагменти, які отримані з будьякої з амінокислотних послідовностей, розкритих в даному документі, де одна або декілька амінокислот всередині однієї або декількох каркасних і/або ділянок CDR мутували зворотно відносно відповідних зародкових залишків або консервативної амінокислотної заміни (природної або штучної) відповідних зародкових залишків (такі заміни послідовності позначаються в даному документі як "зародкові зворотні мутації"). Фахівець в даній галузі, маючи початково послідовності варіабельних ділянок важкого і легкого ланцюгів, розкритих в даному документі, легко може отримати множину антитіл і антигензв'язувальних фрагментів, які включають одну або декілька індивідуальних зародкових зворотних мутацій або їх комбінацію. У деяких 7 UA 108207 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 втіленнях, кожний із залишків каркасних і/або CDR ділянок всередині доменів V H і/або VL мутують назад в зародкову послідовність. У інших втіленнях, тільки конкретні залишки мутують назад в зародкову послідовність, наприклад, тільки мутовані залишки виявлені всередині перших 8 амінокислот FR1 або всередині останніх 8 амінокислот FR4, або тільки мутовані залишки виявлені всередині CDR1, CDR2 або CDR3. Крім того, антитіла за даним винаходом можуть містити будь-яку комбінацію двох або декількох зародкових зворотних мутацій всередині каркасних і/або CDR ділянок, тобто, де конкретні індивідуальні залишки мутують назад до зародкової послідовності, в той час як деякі інші залишки, які відрізняються від зародкової послідовності, зберігаються. Після отримання, антитіла і антигензв'язувальні фрагменти, які містять одну або декілька зародкових зворотних мутацій, можуть бути легко протестовані на предмет однієї або декількох цільових властивостей, таких як поліпшена специфічність зв'язування, поліпшена афінність зв'язування, поліпшені або посилені антагоністичні або агоністичні біологічні властивості (залежно від конкретного випадку), зменшена імуногенність, і т. д. Антитіла і антигензв'язувальні фрагменти, отримані цим загальним способом, охоплені даним винаходом. Даний винахід також включає анти-Ang-2 антитіла, що включають варіанти будь-якої з амінокислотних послідовностей HCVR, LCVR і/або CDR, які розкриті в даному документі і містять одну або декілька консервативних замін. Наприклад, даний винахід включає анти-Ang-2 антитіла, що містять амінокислотні послідовності HCVR, LCVR і/або CDR, які включають, наприклад, 10 або менше, 8 або менше, 6 або менше, 4 або менше і т. д. консервативних амінокислотних замін відносно будь-якої з амінокислотних послідовностей HCVR, LCVR і/або CDR, розкритих в даному документі. У одному втіленні, антитіло включає HCVR, що має амінокислотну послідовність SEQ ID NO: 18, яка включає 8 або менше консервативних амінокислотних замін. У іншому втіленні, антитіло включає HCVR, що має амінокислотну послідовність SEQ ID NO: 18, яка включає 6 або менше консервативних амінокислотних замін. У іншому втіленні, антитіло включає HCVR, що має амінокислотну послідовність SEQ ID NO: 18, яка включає 4 або менше консервативних амінокислотних замін. У іншому втіленні, антитіло включає HCVR, що має амінокислотну послідовність SEQ ID NO: 18, яка включає 2 або менше консервативних амінокислотних замін. У одному втіленні, антитіло включає LCVR, що має амінокислотну послідовність SEQ ID NO: 20, яка включає 8 або менше консервативних амінокислотних замін. У іншому втіленні, антитіло включає LCVR, що має амінокислотну послідовність SEQ ID NO: 20, яка включає 6 або менше консервативних амінокислотних замін. У іншому втіленні, антитіло включає LCVR, що має амінокислотну послідовність SEQ ID NO: 20, яка включає 4 або менше консервативних амінокислотних замін. У іншому втіленні, антитіло включає LCVR, що має амінокислотну послідовність SEQ ID NO: 20, яка включає 2 або менше консервативних амінокислотних замін. При використанні в даному документі, термін "поверхневий плазмонний резонанс" означає оптичне явище, яке передбачає аналіз взаємодій в режимі реального часу шляхом детектування змін концентрацій білка всередині біосенсорної матриці, наприклад, з використанням системи BIAcore™ (Biacore Life Sciences division of GE Healthcare, Piscataway, NJ). При використанні в даному документі, мається на увазі, що термін "K D" означає константу дисоціації при рівновазі конкретної взаємодії антитіло-антиген. Термін "епітоп" означає антигенну детермінанту, яка взаємодіє зі специфічним антигензв'язувальним сайтом у варіабельній ділянці молекули антитіла, відомій як паратоп. Один антиген може містити більше одного епітопу. Таким чином, різні антитіла можуть зв'язуватися з різними областями на антигені і можуть мати різні біологічні ефекти. Епітопи можуть бути або конформаційними або лінійними. Конформаційний епітоп отримують за допомогою просторово суміщених амінокислот з різних сегментів лінійного поліпептидного ланцюга. Лінійний епітоп це - епітоп, отриманий за допомогою сусідніх амінокислотних залишків в поліпептидному ланцюзі. У певних обставинах, епітоп може включати компоненти сахаридів, фосфорильних груп або сульфонільних груп на антигені. Термін "істотна ідентичність" або "по суті ідентичний" відносно нуклеїнової кислоти або її фрагмента означає, що коли нуклеїнова кислота, оптимально вирівняна по відповідних нуклеотидних вставках або делеціях з іншою нуклеїновою кислотою (або її комплементарним ланцюгом), буде мати місце ідентичність нуклеотидної послідовності у щонайменше приблизно 95 %, і більш переважно, щонайменше приблизно 96 %, 97 %, 98 % або 99 % нуклеотидних основ, згідно з вимірюваннями за допомогою добре відомого алгоритму ідентичності послідовності, такого як FASTA, BLAST або Gap, як обговорюється нижче. Молекула нуклеїнової кислоти, що має істотну ідентичність з еталонною молекулою нуклеїнової кислоти, може в 8 UA 108207 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 певних випадках, кодувати поліпептид, що має по суті схожу амінокислотну послідовність як у поліпептиду, що кодується еталонною молекулою нуклеїнової кислоти. Застосовно до поліпептидів термін "істотна схожість" або "по суті схожі" означає, що дві пептидні послідовності при оптимальному вирівнюванні, такому як за допомогою програм GAP або BESTFIT з використанням параметрів пропускання маси за умовчанням розділяють щонайменше 95 % ідентичності послідовності, ще більш переважно, щонайменше 98 % або 99 % ідентичності послідовності. Переважно, положення залишків, які не ідентичні, відрізняються консервативними амінокислотними замінами. "Консервативна амінокислотна заміна" являє собою заміну, в якій амінокислотний залишок замінюють на інший залишок, що має бічний ланцюг (R-групу) зі схожими хімічними властивостями (наприклад, заряд або гідрофобність). Взагалі, консервативна амінокислотна заміна по суті не змінить функціональних властивостей білка. У випадках, коли дві або декілька амінокислотних послідовностей відрізняються одна від одної консервативними замінами, процент ідентичності послідовності або міра схожості може регулюватися у бік збільшення для корекції з метою отримання консервативної природи заміни. Способи здійснення такої регуляції добре відомі фахівцям в даній галузі. Див., наприклад, Pearson (1994) Methods Mol. Biol. 24: 307-331. Приклади груп амінокислот, що мають бічні ланцюги зі схожими хімічними властивостями, включають (1) аліфатичні бічні ланцюги: гліцин, аланін, валін, лейцин і ізолейцин; (2) аліфатичні гідроксильні бічні ланцюги: серин і треонін; (3) амідовмісні бічні ланцюги: аспарагін і глутамін; (4) ароматичні бічні ланцюги: фенілаланін, тирозин і триптофан; (5) основні бічні ланцюги: лізин, аргінін і гістидин; (6) кислотні бічні ланцюги: аспартат і глутамат і (7) сірковмісні бічні ланцюги: цистеїн і метіонін. Переважними групами консервативних амінокислотних замін є: валін-лейцинізолейцин, фенілаланін-тирозин, лізин-аргінін, аланін-валін, глутумат-аспартат і аспарагінглутамін. Альтернативно, консервативна заміна являє собою будь-яку заміну, що має позитивне значення в матриці PAM250 логарифмічної правдоподібності, розкритій у Gonnet et al. (1992) Science 256: 1443-1445. "Помірно консервативна" заміна являє собою будь-яку заміну, що має ненегативне значення в матриці PAM250 логарифмічної правдоподібності. Схожість послідовностей поліпептидів, яку також позначають як ідентичність послідовності, як правило, вимірюють з використанням пакету програм аналізу послідовностей. Пакет програм аналізу білків знаходить схожі послідовності з використанням заходів схожості, які оцінюють для різних замін, делецій і інших модифікацій, що включають консервативні амінокислотні заміни. Наприклад, пакет програм GCG містить програми, такі як Gap і Bestfit, які можутьвикористовуватися з параметрами за умовчанням для визначення гомології послідовностей або ідентичності послідовностей між близькоспорідненими поліпептидами з різних видів організмів або між білком дикого типу і його мутантною формою. Див., наприклад, GCG Версія 6.1. Поліпептидні послідовності також можуть порівнюватися з використанням FASTA з використанням параметрів за умовчанням або з використанням рекомендованих параметрів в програмі GCG Версія 6.1. FASTA (наприклад, FASTA2 і FASTA3) забезпечує вирівнювання і процент ідентичності послідовності ділянок кращого перекривання між заданою і шуканими послідовностями (Pearson (2000) вище). Іншим переважним алгоритмом для порівняння послідовності за винаходом з базою даних, що містить велику кількість послідовностей з різних організмів, є комп'ютерна програма BLAST, особливо, BLASTP або TBLASTN, з використанням параметрів за умовчанням. Див., наприклад, Altsсhul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403-410 і Altsсhul et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25:3389-402. Отримання людських антитіл Методи генерування моноклональних антитіл, що включають повністю людські моноклональні антитіла, відомі з рівня техніки. Будь-які такі відомі методи можуть використовуватися в контексті даного винаходу для отримання людських антитіл, які специфічно зв'язуються з людським Ang-2 і мають одну або декілька антигензв'язувальних і/або функціональних характеристик будь-якого з типових анти-Ang-2 антитіл, розкритих в даному документі. Використовуючи технологію VELOCIMMUNE™ або будь-який інший відомий метод генерування моноклональних антитіл, спочатку виділяють високоафінні химерні антитіла до Ang-2, що містять людську варіабельну ділянку і мишачу константну ділянку. Згідно з експериментальним розділом, представленим нижчим, антитіла характеризуються і вибираються з метою отримання цільових характеристик, що включають афінність, селективність, епітоп і т. д. Мишачі константні ділянки замінюють на цільову людську константну ділянку з генеруванням повністю людського антитіла за винаходом, наприклад, дикого типу або модифікованого IgG1 або IgG4. У той час як вибрану константну ділянку може варіюватися 9 UA 108207 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 згідно з конкретним застосуванням, характеристики високоафінного антигенного зв'язування і цільова специфічність розташовуються у варіабельній ділянці. Біоеквіваленти Анти-Ang-2 антитіла і фрагменти антитіл за даним винаходом охоплюють білки, що мають амінокислотні послідовності, які відрізняються від послідовностей описаних антитіл, але які зберігають здатність зв'язуватися з людським Ang-2. Такі варіантні антитіла і фрагменти антитіл включають одну або декілька вставок, делецій або замін амінокислот в порівнянні з батьківською послідовністю, але демонструють біологічну активність, яка по суті еквівалентна активності описаних антитіл. Аналогічно, ДНК-послідовності, що кодують анти-Ang-2 антитіло за даним винаходом, охоплюють послідовності, які включають одну або декілька вставок, делецій або замін нуклеотидів в порівнянні з розкритою послідовністю, але які кодують анти-Ang-2 антитіло або фрагмент антитіла, що по суті біоеквівалентни анти-Ang-2 антитілу або фрагменту антитіла за винаходом. Приклади таких варіантних амінокислотних і ДНК-послідовностей розкриті вище. Два антигензв'язувальні білки або антитіла вважаються біоеквівалентними, якщо вони, наприклад, є фармацевтичними еквівалентами або фармацевтичними альтернативами, швидкість і міра всмоктування яких не демонструє значної відмінності при введенні в однакових молярних дозах при однакових експериментальних умовах, як при однократній дозі, так і при багаторазових дозах. Деякі антитіла будуть вважатися еквівалентами або фармацевтичними альтернативами, якщо вони еквівалентні по їх мірі всмоктування, але не по швидкості всмоктування, і ще можуть вважатися біоеквівалентами, оскільки такі відмінності в швидкості всмоктування є навмисними і відбиваються в міченні, не будучи істотними в досягненні ефективних концентрацій лікарського засобу, наприклад, при постійному застосуванні, і вважаються незначущими з медичної точки зору для конкретного досліджуваного лікарського продукту. У одному втіленні, два антигензв'язувальні білки є біоеквівалентами, якщо немає клінічно значущих відмінностей в їх безпеці, чистоті і ефективності. У одному втіленні, два антигензв'язувальні білки є біоеквівалентними, якщо пацієнт може переключатися один або декілька разів між еталонним продуктом і біологічним продуктом без очікуваного підвищення ризику побічних ефектів, що включають клінічно значущі зміни імуногенності або послаблення ефективності в порівнянні з терапією, що продовжується без такого переключання. У одному втіленні, два антигензв'язувальні білки є біоеквівалентними, якщо вони обидва діють за допомогою загального механізму або механізмів дії для умови або умов застосування в такій мірі, в якій такі механізми відомі. Біоеквівалентність може демонструватися за допомогою методів in vivo і in vitro. Вимірювання біоеквівалентності включають, наприклад, (a) in vivo-тест у людей або інших ссавців, для яких вимірюють концентрацію антитіла або його метаболітів як функцію від часу в крові, плазмі, сироватці або в іншій біологічній рідині; (b) in vitro-тест, який корелює з обґрунтовано прогнозованими даними in vivo-біодоступності для людини; (с) in vivo-тест на людях або інших ссавцях, у яких відповідний явний фармакологічний ефект антитіла (або його мішені) вимірюють як функцію від часу; і (d) добре контрольоване клінічне випробування, яке перевіряє безпеку, ефективність або біодоступність або біоеквівалентність антитіла. Біоеквівалентні варіанти анти-Ang-2 антитіл за винаходом можуть бути сконструйовані, наприклад, шляхом здійснення різних замін залишків або послідовностей або шляхом делеції внутрішніх залишків або послідовностей, які не є необхідними для біологічної активності. Наприклад, залишки цистеїну, не істотні для біологічної активності, можуть бути делетовані або замінені іншими амінокислотами для запобігання утворенню непотрібних або некоректних внутрішньомолекулярних дисульфідних містків при ренатурації. Біологічні і терапевтичні характеристики антитіл Загалом, антитіла за даним винаходом зв'язуються з людським Ang-2 з KD, що складає менше ніж 100 пM, як правило, з KD, що складає менше ніж 50 пM, і в деяких втіленнях, з KD, що складає менше ніж 40 пM, згідно з вимірюваннями за допомогою зв'язування з антигеном, який або іммобілізований на твердій підкладці або знаходиться в рідкій фазі. Крім того, деякі типові анти-Ang-2 антитіла за винаходом можуть демонструвати одну або декілька з наступних характеристик: (1) здатність зв'язуватися з людським Ang-2, але не з мишачим Ang-2; (2) здатність зв'язуватися з людським Ang-2 і з мишачим Ang-2; (3) здатність зв'язуватися з людським Ang-2, але не з людським Ang-1, -3 або -4; (4) здатність зв'язуватися з людським Ang-2, але не з мишачим Ang-1, -3 або -4; (5) здатність зв'язуватися з людським Ang-2 і з людським Ang-1, -3 або -4; (6) здатність зв'язуватися з людським Ang-2 і з мишачим Ang-1, -3 10 UA 108207 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 або -4; (7) здатність блокувати зв'язування людського Ang-2 з людським Tie-2; (8) здатність блокувати зв'язування людського Ang-2 з мишачим Tie-2; (9) здатність блокувати зв'язування мишачого Ang-2 з людським Tie-2; (10) здатність блокувати зв'язування мишачого Ang-2 з мишачим Tie-2; (11) здатність блокувати зв'язування людського Ang-1 з людським Tie-2; (12) здатність блокувати зв'язування людського Ang-1 з мишачим Tie-2; (13) здатність блокувати зв'язування мишачого Ang-1 з людським Tie-2; (14) здатність блокувати зв'язування мишачого Ang-1 з мишачим Tie-2; (15) здатність інгібувати фосфорилування людського Tie-2, індуковане людським Ang-2; (16) здатність інгібувати фосфорилування мишачого Tie-2, індуковане людським Ang-2; (17) здатність інгібувати фосфорилування людського Tie-2, індуковане мишачим Ang-2; (18) здатність інгібувати фосфорилування мишачого Tie-2, індуковане мишачим Ang-2; (19) здатність інгібувати фосфорилування людського Tie-2, індуковане людським Ang-1; (20) здатність інгібувати фосфорилування мишачого Tie-2, індуковане людським Ang-1; (21) здатність інгібувати фосфорилування людського Tie-2, індуковане мишачим Ang-1; (22) здатність інгібувати фосфорилування мишачого Tie-2, індуковане мишачим Ang-1; (23) здатність інгібувати in vivo ангіогенез в експериментальній моделі (наприклад, ангіогенез, індукований циліндром з Матригелю, що містять клітини MCF-7, імплантованим підшкірно голим мишам); і/або (24) здатність інгібувати або зменшувати розмір пухлини в мишачій моделі ксенотрансплантата. Даний винахід також включає антитіла, які зв'язуються з високою афінністю з конструкцією, що включає фібронектинподібний домен Ang-2, але позбавленим N-кінцевого суперспірального домену Ang-2 (такі конструкції позначаються в даному документі як "Ang-2FD"). Типові Ang-2FD конструкції включають людський Ang-2FD (SEQ ID NO;519), мишачий Ang-2FD (SEQ ID NO:520) і мавпячий Ang-2FD (SEQ ID NO:521). Людська, мишача і мавпяча конструкції Ang-2FD можуть бути мономерними або димерними. Конструкції Ang-2FD також можуть включати інші, відмінні від Ang-2, амінокислотні послідовності, такі як людський або мишачий Fc-домен, приєднаний до молекул Ang-2FD. Інша типова конструкція Ang-2FD позначається в даному документі "hBA2" (або людський "складчатий-Ang2"), яка являє собою тетрамер людських фібриногеноподібних доменів Ang-2, асоційованих один з одним за допомогою людських або мишачих Fc-доменів з утворенням петлеподібної конфігурації. Як правило, hBA2 складається з двох димерів Ang-2, де кожний димер Ang-2 містить два фібронектиноподібні домену Ang-2, пов'язані один з одним за допомогою Fc-домену. Типові компоненти hBA2 включають поліпептиди, позначені hBA2-hIgG1 (SEQ ID NO:522) і hBA2-mIgG2a (SEQ ID NO:523). Несподівано виявили, що деякі анти-Ang-2 антитіла за даним винаходом зв'язуються з конструкціями Ang-2FD з набагато вищою афінністю, ніж відоме контрольне антитіло до Ang-2 (див. Приклади, представлені в даному документі). Високоафінне зв'язування в контексті зв'язування анти-Ang-2 антитіла з димерною конструкцією людського або мишачого Ang-2FD, означає, що анти-Ang-2 антитіло зв'язується з людським або мишачим димером Ang-2FD з KD, що складає менше ніж 300 пM. Наприклад, анти-Ang-2 антитіла, які зв'язуються з високою афінністю з людським або мишачим димером Ang-2-FD, включають антитіла, які зв'язуються з людським або мишачим димером Ang-2-FD з KD, що складає менше ніж 300 пM, менше ніж 250 пM, менше ніж 200 пM, менше ніж 190 пM, менше ніж 180 пM, менше ніж 170 пM, менше ніж 160 пM, менше ніж 150 пM, менше ніж 140 пM, менше ніж 130 пM, менше ніж 120 пM, менше ніж 110 пM, менше ніж 100 пM, менше ніж 90 пM, менше ніж 80 пM, менше ніж 70 пM, менше ніж 60 пM або менше ніж 50 пM, згідно з вимірюваннями при 25 °C за допомогою аналізу поверхневого плазмонного резонансу. Високоафінне зв'язування в контексті зв'язування анти-Ang-2 антитіла з димерною конструкцією мавпячого Ang-2FD означає, що анти-Ang-2 антитіло зв'язується з мавпячим димером Ang-2FD з KD, що складає менше ніж 500 пM. Наприклад, анти-Ang-2 антитіла, які зв'язуються з високою афінністю з мавпячим димером Ang-2-FD, включають антитіла, які зв'язуються з мавпячим димером Ang-2-FD з KD, що складає менше ніж 500 пM, менше ніж 450 пM, менше ніж 400 пM, менше ніж 350 пM, менше ніж 300 пM, менше ніж 250 пM, менше ніж 200 пM, менше ніж 190 пM, менше ніж 180 пM, менше ніж 170 пM, менше ніж 160 пM, менше ніж 150 пM, менше ніж 140 пM, менше ніж 130 пM, менше ніж 120 пM, менше ніж 110 пM, менше ніж 100 пM, менше ніж 90 пM, менше ніж 80 пM, згідно з вимірюваннями при 25 °C за допомогою аналізу поверхневого плазмонного резонансу. Високоафінне зв'язування в контексті зв'язування анти-Ang-2 антитіла з мономерною конструкцією людського Ang-2FD, означає, що анти-Ang-2 антитіло зв'язується з людським мономером Ang-2FD з KD, що складає менше ніж 40 пM. Наприклад, анти-Ang-2 антитіла, які зв'язуються з високою афінністю з людським мономером Ang-2-FD, включають антитіла, які зв'язуються з людським мономером Ang-2-FD з KD, що складає менше ніж 40 нM, менше ніж 30 11 UA 108207 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 нM, менше ніж 25 нM, менше ніж 20 нM, менше ніж 15 нM, менше ніж 10 нM, менше ніж 9 нM, менше ніж 8 нM, менше ніж 7 нM, менше ніж 6 нM, менше ніж 5 нM, менше ніж 4 нM, менше ніж 3 нM, менше ніж 2 нM, менше ніж 1 нM, менше ніж 0,9 нM, менше ніж 0,8 нM, менше ніж 0,7 нM, менше ніж 0,6 нM, згідно з вимірюваннями при 25 °C за допомогою аналізу поверхневого плазмонного резонансу. Високоафінне зв'язування в контексті зв'язування анти-Ang-2 антитіла з конструкцією hBA2, означає, що анти-Ang-2 антитіло зв'язується з hBA2 з KD, що складає менше ніж 80 пM. Наприклад, анти-Ang-2 антитіла, які зв'язуються з високою афінністю з hBA2, включають антитіла, які зв'язуються з hBA2 з KD, що складає менше ніж 80 пM, менше ніж 75 пM, менше ніж 70 пM, менше ніж 65 пM, менше ніж 60 пM, менше ніж 55 пM, менше ніж 50 пM, менше ніж 45 пM, менше ніж 40 пM, менше ніж 35 пM, менше ніж 30 пM, менше ніж 25 пM, менше ніж 20 пM, менше ніж 18 пM, менше ніж 16 пM, менше ніж 14 пM або менше ніж 12 пM, згідно з вимірюваннями при 25 °C за допомогою аналізу поверхневого плазмонного резонансу. Даний винахід включає антитіла, які зв'язуються з Ang-2, але по суті не зв'язуються з Ang-1. При використанні в даному документі, антитіло "по суті не зв'язується з Ang-1", якщо антитіло при тестуванні на зв'язування з Ang-1 за допомогою аналізу поверхневого плазмонного резонансу, і повнорозмірний людський Ang-1 дикого типу в концентрації приблизно 25 нM ін'єктується над поверхнею захопленого антитіла зі швидкістю потоку приблизно 60 мкл/хв. протягом приблизно 3 хвилин при 25 °C, і демонструє KD більше ніж приблизно 1 нM, наприклад, KD, більше ніж приблизно 5 нM, більше ніж приблизно 10 нM, більше ніж приблизно 50 нM, більше ніж приблизно 100 нM, більше ніж приблизно 150 нM, більше ніж приблизно 200 нM, більше ніж приблизно 250 нM, більше ніж приблизно 300 нM, більше ніж приблизно 350 нM, більше ніж приблизно 400 нM, більше ніж приблизно 450 нM, більше ніж приблизно 500 нM, або більше. (Див. наприклад, Приклад 4). Крім того, антитіло "по суті не зв'язується з Ang-1", якщо антитіло не здатне демонструвати якого-небудь зв'язування з Ang-1, при тестуванні в такому аналізі або його еквіваленті. Даний винахід також включає антитіла, які блокують взаємодію між Ang-2 і Tie-2, але по суті не блокують зв'язування Ang-1 з Tie-2. При використанні в даному документі, антитіло "по суті не блокує зв'язування Ang-1 з Tie-2", у випадку, якщо коли антитіло попередньо змішують з Ang1-антигеном в співвідношенні приблизно 100:1 (антитіло:антиген) і інкубують при 25 °C протягом приблизно 60 хвилин і потім урівноважену суміш тестують на зв'язування з Tie-2 за допомогою поверхневого плазмонного резонансу над поверхнею, покритою Tie-2 (5 мкл/хв. протягом 5 хв. при 25 °C), кількість Ang-1, зв'язаного з Tie-2, складає щонайменше 50 % кількості Ang-1, зв'язаного з Tie-2, в присутності сторонньої контрольної молекули. (Див. наприклад, Приклад 6). Наприклад, якщо кількість Ang-1, зв'язаного з Tie-2, після попередньої інкубації з антитілом становить щонайменше приблизно 50 %, щонайменше приблизно 55 %, щонайменше приблизно 60 %, щонайменше приблизно 65 %, щонайменше приблизно 70 %, щонайменше приблизно 75 %, щонайменше приблизно 80 %, щонайменше приблизно 85 %, щонайменше приблизно 90 %, щонайменше приблизно 95 %, або приблизно 100 % кількості Ang-1, що зв'язується з Tie-2, після попередньої інкубації з сторонньою контрольною молекулою у вищезгаданих експериментальних умовах, після чого вважається, що антитіло "по суті не блокує зв'язування Ang-1 з Tie-2". Крім того, даний винахід включає антитіла, які блокують або по суті послаблюють біологічну активність Ang-2 (наприклад, Ang-2-опосередковане фосфорилування Tie-2; Ang-2-індукований ангіогенез; і т. д.), але не блокують або по суті не послаблюють відповідну біологічну активність Ang-1 (наприклад, Ang-1-опосередковане фосфорилування Tie-2; Ang-1-індукований ангіогенез; і т. д.). Аналізи і тести, що застосовуються для визначення того, чи задовольняє антитіло одну або декілька вищеперелічених характеристик, буде легко зрозуміло і легко здійсненно на практиці фахівцями в даній галузі і/або може бути повністю встановлено з даного опису. Наприклад, експериментальні процедури, детально описані нижче, можуть використовуватися для визначення того, зв'язується чи ні дане антитіло з Ang-2 і/або Ang-1; блокує чи ні зв'язування Ang-2 і/або Ang-1 з Tie-2; інгібує чи ні Ang-2- і/або Ang-1-опосередковане фосфорилування Tie-2; і т. д. Картування епітопів і пов'язані з цим технології Для скринінгу на предмет пошуку антитіл, які зв'язуються з конкретним епітопом (наприклад, тих, які блокують зв'язування IgE з його високоафінним рецептором), може бути здійснений звичайний аналіз перехресного блокування, такий як той, що описаний в "Antibodies", Harlow and Lane (Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harb., NY). Інші методи включають скануючий аланіном мутагенез, пептидні блоти (Reineke (2004) Methods Mol Biol 248:443-63), або аналіз 12 UA 108207 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 пептидного розщеплення. Крім того, можуть застосовуватися методи, такі як вирізання епітопів, виділення епітопів і хімічна модифікація антигенів (Tomer (2000) Protein Science 9: 487-496). Термін "епітоп" означає сайт на антигені, на який відповідають В- і/або Т-клітини. В-клітинні епітопи можуть бути сформовані як з послідовно розташованих амінокислот, так і з не послідовно розташованих амінокислот, зближених за допомогою третинної структури білка. Епітопи, сформовані з послідовно розташованих амінокислот, як правило, залишаються експонованими при денатурації розчинниками, тоді як епітопи сформовані третинною структурою, як правило, втрачаються при обробці денатуруючими розчинниками. Епітоп, як правило, включає, щонайменше 3 і більше, і частіше, щонайменше 5 або 8-10 амінокислот в унікальній просторовій конформації. Метод Профілювання за Допомогою Модифікацій (Modification-Assisted Profiling) (MAP), також відомий як Профілювання Антитіл на Основі Структури (Antigen Structure-based Antibody Profiling) (ASAP), являє собою метод, який розділяє на категорії велику кількість моноклональних антитіл (mAb), спрямованих проти одного і того ж антигенна згідно зі схожістю профілю зв'язування кожного антитіла з хімічно і ферментативно модифікованими поверхнями антигенів (США 2004/0101920). Кожна категорія може відображати унікальний епітоп або який істотно відрізняється або частково перекривається з епітопом, який характеризується іншою категорією. Ця технологія дає можливість швидкої фільтрації генетично ідентичних антитіл, так що характеризація може бути сфокусована на генетично віддалених антитілах. При застосуванні до гібридомному скринінгу, MAP може полегшувати ідентифікацію рідких гібридомних клонів, які продукують mAb, що мають цільові характеристики. MAP може використовуватися для сортування анти-Ang-2 антитіл за винаходом в групи антитіл, що зв'язуються з різними епітопами. Анти-Ang-2 антитіла можуть зв'язуватися з епітопом всередині N-кінцевого домену з подвійною спіраллю або всередині С-кінцевого фібриногеноподібного домену ("FD"). У переважних втіленнях даного винаходу, анти-Ang-2 антитіла і їх антигензв'язувальні фрагменти зв'язуються з епітопом всередині FD. Амінокислоти всередині FD Ang-2, який взаємодіє з Tie-2, були встановлені за допомогою аналізу кристалічної структури. See Barton et al., Nat. Struct. Mol. Biol. 13:524-532 (May 2006). Що стосується антитіл, які блокують зв'язування Ang-2 з Tie-2, але по суті не блокують зв'язування Ang-1 з Tie-2 (наприклад, H1 H685P, див. Приклади 5 і 6 нижче), епітоп, з яким такі антитіла зв'язуються, може включати одну або декілька амінокислот Ang-2, які (a) взаємодіють з Tie-2 і (b) не є ідентичними відповідній амінокислоті в Ang-1. (див. Фігуру 1). Таким чином, епітоп, з яким зв'язуються такі антитіла, що віддають перевагу Ang-2, може включати одну або декілька з наступних амінокислот hAng-2 (SEQ ID NO:518): S-417; K-432; I-434; N-467; F-469; Y-475; або S480. Наприклад, автори даного винаходу виявили, що антитіла, які взаємодіють з амінокислотами F-469, Y-475 і S-480 з Ang-2 (SEQ ID NO:518), переважно взаємодіють з Ang-2 в порівнянні з Ang-1, і це переважне зв'язування може мати терапевтичну користь. Таким чином, даний винахід включає анти-Ang-2 антитіла, які специфічно зв'язуються з людським ангіопротеїном-2 (hAng-2), але по суті не зв'язуються з hAng-1, де антитіла зв'язуються з епітопом на hAng-2 (SEQ ID NO:518), що включає амінокислоти F-469, Y-475 і S-480. Таким чином, даний винахід включає анти-Ang-2 антитіла, які специфічно зв'язуються з людським ангіопротеїном-2 (hAng-2), але по суті не зв'язуються з hAng-1, де антитіла зв'язуються з епітопом на hAng-2 (SEQ ID NO:518), що включає амінокислоти F-469, Y-475 і S-480. Даний винахід включає анти-Ang-2 антитіла, які зв'язуються з тим же епітопом, що будь-які специфічні типові антитіла, описані в даному документі (наприклад, H1 H685, H1 H690, H1 H691, H1H696, H1 H706, H1 M724 і/або H2M744). Аналогічно, даний винахід також включає анти-Ang-2 антитіла, які конкурують за зв'язування з Ang-2 з будь-яким зі специфічних типових антитіл, описаних в даному документі (наприклад, H1 H685, H1 H690, H1 H691, H1 H696, H1 H706, H1 M724 і/або H2M744). Фахівець за допомогою звичайних методів, відомих з рівня техніки, може легко визначити, чи зв'язується антитіло з тим же епітопом, що і еталонне анти-Ang-2 антитіло, або конкурує за зв'язування з ним з еталонним анти-Ang-2 антитілом. Наприклад, для визначення того, чи зв'язується тестоване антитіло з тим же епітопом, що і еталонне анти-Ang-2 антитіло за винаходом, еталонному антитілу надається можливість зв'язування з Ang-2-білком або пептидом при умовах насичення. Потім оцінюється здатність тестованого антитіла зв'язуватися з молекулою Ang-2. Якщо тестоване антитіло здатне зв'язуватися з Ang-2 після зв'язування в умовах насичення з еталонним анти-Ang-2 антитілом, то можна зробити висновок, що тестоване антитіло зв'язується з епітопом, відмінним від того, з яким зв'язується еталонне анти-Ang-2 антитіло. З іншого боку, якщо тестоване антитіло не здатне зв'язуватися з молекулою Ang-2 13 UA 108207 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 після зв'язування в умовах насичення еталонним анти-Ang-2 антитілом, то тестоване антитіло може зв'язуватися з тим же епітопом, з яким зв'язується еталонне анти-Ang-2 антитіло за винаходом. Потім можуть проводитися додаткові звичайні експерименти (наприклад, аналізи пептидних мутацій і зв'язування) для підтвердження того, що фактично, відсутність зв'язування тестованого антитіла, що спостерігається, відбувається завдяки зв'язуванню з тим же епітопом, що у еталонного антитіла, або якщо за відсутність зв'язування, що спостерігається, відповідає стеричне блокування (або інше явище). Експерименти такого типу можуть здійснюватися з використанням ELISA, RIA, Biacore, проточної цитометрії або будь-якого іншого кількісного або якісного аналізу, доступного з рівня техніки. Згідно з деякими втіленнями даного винаходу, два антитіла зв'язуються з одним і тим же (або з такими, що перекриваються) епітопом, якщо наприклад, 1-, 5-, 10-, 20- або 100-кратний надлишок одного антитіла інгібує зв'язування іншого щонайменше на 50 %, але переважно на 75 %, 90 % або навіть 99 % по вимірюваннях в конкурентному аналізі зв'язування (див., наприклад, Junghans et al., Cancer Res. 1990:50:14951502). Альтернативно, вважається, що два антитіла зв'язуються з одним і тим же епітопом, якщо по суті всі амінокислотні мутації в антигені, які зменшують або виключають зв'язування одного антитіла, при цьому зменшують або виключають зв'язування іншого. Вважається, що два антитіла мають "епітопи, що перекриваються", якщо тільки частина амінокислотних мутацій, які зменшують або виключають зв'язування одного антитіла, при цьому зменшують або виключають зв'язування іншого. Для визначення того, чи конкурує антитіло за зв'язування з еталонним анти-Ang-2 антитілом, здійснюють вищеописану методологію зв'язування в дві дії: в першій дії еталонному антитілу дають можливість зв'язатися з молекулою Ang-2 при умовах насичення з подальшою оцінкою зв'язування тестованого антитіла з молекулою Ang-2. У другій дії тестованому антитілу дають можливість зв'язатися з молекулою Ang-2 при умовах насичення з подальшою оцінкою зв'язування еталонного антитіла з молекулою Ang-2. Якщо в обох діях тільки перше антитіло (що насичує) здатне до зв'язування з молекулою Ang-2, то роблять висновок, що тестоване антитіло і еталонне антитіло конкурують за зв'язування з Ang-2. Фахівцеві в даній галузі зрозуміло, що антитіло, яке конкурує за зв'язування з еталонним антитілом, необов'язково може зв'язуватися з тим же епітопом, що і еталонне антитіло, але може стерично блокувати зв'язування еталонного антитіла шляхом зв'язування з тим, що перекривається, або з сусіднім епітопом. Видова селективність і видова перехресна реактивність Згідно з деякими втіленнями винаходу, анти-Ang-2 антитіла зв'язуються з людським Ang-2, але не з Ang-2 з інших видів. Альтернативно, анти-Ang-2 антитіла за винаходом в деяких втіленнях зв'язуються з людським Ang-2 і з Ang-2 з одного або декількох видів, відмінних від людини. Наприклад, Ang-2-антитіла за винаходом можуть зв'язуватися з людським Ang-2 і можуть зв'язуватися або не зв'язуватися залежно від конкретного випадку з одним або декількома з Ang-2 миші, щура, морської свинки, хом'яка, піщанки, свині, кішки, собаки, кролика, кози, вівці, корови, коня, верблюда, макаки-крабоїда, ігрунки, макаки-резус або шимпанзе. Імунокон'югати Винахід охоплює анти-Ang-2 моноклональні антитіла, кон'югування з терапевтичним компонентом ("імунокон'югатом"), таким як цитотоксин, хіміотерапевтичний лікарський засіб, імунопригнічувальний засіб або радіоізотоп. Цитотоксичні агенти включають будь-який агент, який негативно позначається на клітинах. Приклади прийнятних цитотоксичних агентів і хіміотерапевтичних агентів для утворення імунокон'югатів відомі з рівня техніки, див., наприклад, WO 05/103081). Поліспецифічні антитіла Антитіла за даним винаходом можуть бути моноспецифічними, біспецифічними або поліспецифічними антитілами. Поліспецифічні mAb можуть бути специфічні до різних епітопів одного поліпептиду-мішені або можуть містити антигензв'язувальні домени для більше ніж одного поліпептиду-мішені. Див., наприклад, Tutt et al. (1991) J. Immunol. 147:60-69. Анти-Ang-2 антитіла за даним винаходом або їх частини можуть бути пов'язані або можуть спільно експресуватися з іншою функціональною молекулою, наприклад, з іншим пептидом або білком з утворенням поліспецифічної молекули. Наприклад, антитіло або його фрагмент можуть бути функціонально пов'язані (наприклад, за допомогою хімічної конденсації, генетичного зшивання, нековалентної асоціації або по-іншому) з одним або декількома молекулярними компонентами, такими як інше антитіло або фрагмент антитіла, з отриманням біспецифічного або поліспецифічного антитіла з другою специфічністю зв'язування. Типовий біспецифічний формат антитіл, який може використовуватися в контексті даного винаходу, включає використання першого CH3-домену імуноглобуліну (Ig) і другого CH3-домену 14 UA 108207 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 імуноглобуліну Ig, де перший і другий C H3-домени Ig відрізняються один від одного, щонайменше однією амінокислотою і де щонайменше одна амінокислотна відмінність зменшує зв'язування біспецифічного антитіла з Протеїном А в порівнянні з біспецифічним антитілом, позбавленим амінокислотних відмінностей. У одному втіленні, перший C H3-домен Ig зв'язується з Протеїном А, і другий CH3-домен Ig містить мутацію, яка зменшує або виключає зв'язування з Протеїном А, таку як модифікація H95R (при нумерації екзонів IMGT; H435R при EU-нумерації). Другий CH3 може додатково включати модифікацію Y96F (по IMGT; Y436F по EU). Додаткові модифікації, які можуть бути виявлені всередині другого C H3, включають: D16E, L18M, N44S, K52N, V57M і V82I (по IMGT; D356E, L358M, N384S, K392N, V397M і V422I по EU) у випадку антитіл IgGI; N44S, K52N і V82I (IMGT; N384S, K392N і V422I по EU) у випадку антитіл IgG2; і Q15R, N44S, K52N, V57M, R69K, E79Q і V82I (по IMGT; Q355R, N384S, K392N, V397M, R409K, E419Q і V422I по EU) у випадку антитіл IgG4. Варіації формату біспецифічних антитіл, описаного вище, передбачаються в рамках даного винаходу. Терапевтичний склад і введення У винаході пропонуються терапевтичні композиції, що включають анти-Ang-2 антитіла або їх антигензв'язувальні фрагменти за даним винаходом. Терапевтичні композиції за даним винаходом можуть додатково включати один або декілька фармацевтично прийнятних носіїв, допоміжних речовин і інших агентів, які включені в склади для забезпечення поліпшеного перенесення, доставки, переносимості і так далі (в даному документі всі разом позначаються як "фармацевтично прийнятні носії або розріджувачі"). Сукупність відповідних складів можна виявити в довіднику, відомому всім хімікам-фармацевтам: Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Easton, PA. Ці склади включають, наприклад, порошки, пасти, мазі, гелі, воски, масла, ліпіди, ліпідовмісні (катіонні або аніонні) носії (такі як LIPOFECTIN™), ДНКкон'югати, пасти безводного всмоктування, емульсії масло-в-воді і вода-в-маслі, емульсії карбоваксу (поліетиленгліколі різної молекулярної маси), напівтверді гелі і напівтверді суміші, що містять карбовакс. Див., також Powell et al. "Compendium of excipients for parenteral formulations" PDA, 1998, J Pharm Sci Technol 52:238-311. Доза антитіла може варіюватися залежно від віку об'єкта, якому здійснюють введення, цільового захворювання, стану, шляху введення, і так далі. Переважну дозу, як правило, розраховують згідно з масою тіла або області поверхні тіла. Коли антитіло за даним винаходом використовують для лікування патологічного стану або захворювання, асоційованого з активністю Ang-2 у дорослого пацієнта, то може бути переважним внутрішньовенне введення антитіла за даним винаходом, як правило, в однократній дозі приблизно від 0,01 приблизно до 20 мг/кг маси тіла, більш переважно, приблизно від 0,02 приблизно до 7, приблизно від 0,03 приблизно до 5, або приблизно від 0,05 приблизно до 3 мг/кг маси тіла. У залежності від тяжкості патологічного стану, може регулюватися частота і тривалість лікування. Ефективне дозування і графіки введення Ang-2-антитіл можуть визначатися емпірично; наприклад, за допомогою періодичної оцінки може відстежуватися прогрес у пацієнта і відповідно регулюється доза. Крім того, міжвидове масштабування дозування може здійснюватися з використанням методів, добре відомих з рівня техніки (наприклад, Mordenti et al., 1991, Pharmaceut. Res. 8:1351). Відомі різні системи доставки, і вони можуть використовуватися для введення фармацевтичної композиції за винаходом, наприклад, інкапсулювання в ліпосоми, мікрочастинки, мікрокапсули, використання рекомбінантних клітин, здатні експресувати мутантні віруси, рецептор-опосередкований ендоцитоз (див., наприклад, Wu et al. 1987, J. Biol. Chem. 262:4429-4432). Способи введення включають, зокрема, внутрішньошкірний, внутрішньом'язовий, внутрішньоочеревинний, внутрішньовенний, підшкірний, інтраназальний, епідуральний або пероральний шляхи введення. Композиція може бути введена будь-яким стандартним шляхом, наприклад, інфузієї або болюсною ін'єкцією, абсорбцією через епітеліальні або муко-слизові вистілки (наприклад, пероральну слизову, ректальну і кишкову слизову і т. д.) і можуть бути введені разом з іншими біологічно активними агентами. Введення може бути системним або місцевим. Фармацевтична композиція за даним винаходом може бути доставлена, наприклад, підшкірно або внутрішньовенно з використанням стандартної голки і шприца. Крім того, відносно підшкірної доставки, пристрій доставки з інжектором у вигляді ручки легко здійснює застосування у вигляді доставки фармацевтичної композиції за даним винаходом. Такий пристрій доставки з інжектором у вигляді ручки може бути використаний повторно або може бути пристроєм однократного використання. Повторний використовуваний пристрій доставки з інжектором у вигляді ручки, як правило, застосовує замінюваний картридж, який містить фармацевтичну композицію. Після того як введена вся фармацевтична композиція всередині 15 UA 108207 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 картриджа, і картридж пустий, то він може бути легко або видалений або замінений на новий картридж, який містить фармацевтичну композицію. Пристрій доставки з інжектором у вигляді ручки може потім повторно використовуватися. У одноразовому пристрої доставки з інжектором у вигляді ручки немає замінюваного картриджа. Навпаки, одноразовий пристрій доставки з інжектором у вигляді ручки, вже попередньо наповнений фармацевтичною композицією, яка знаходиться всередині ємності всередині пристрою. Після того як з ємності видаляється фармацевтична композиція, то весь пристрій викидається. Численні повторно використовувані пристрої доставки з інжектором у вигляді ручки і з автоінжектором знаходять застосування в підшкірній доставці фармацевтичної композиції за даним винаходом. Приклади включають зокрема AUTOPEN™ (Owen Mumford, Inc., Woodstock, UK), DISETRONIC™ pen (Disetronic Medical Systems, Burghdorf, Switzerland), HUMALOG MIX 75/25™ pen, HUMALOG™ pen, HUMALIN 70/30™ pen (Eli Lilly and Co., Indianapolis, IN), NOVOPEN™ I, II і III (Novo Nordisk, Copenhagen, Denmark), NOVOPEN JUNIOR™ (Novo Nordisk, Copenhagen, Denmark), BD™ pen (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ), OPTIPEN™, OPTIPEN PRO™, OPTIPEN STARLET™ і OPTICLIK™ (sanofi-aventis, Frankfurt, Germany), це декілька перерахованих з відомих. Приклади одноразових пристроїв доставки з інжектором у вигляді ручки, що мають застосування в підшкірній доставці фармацевтичної композиції за даним винаходом, включають, зокрема, SOLOSTAR™ pen (sanofi-aventis), the FLEXPEN™ (Novo Nordisk) і KWIKPEN™ (EIi Lilly). Для лікування очних порушень антитіла і антигензв'язувальні фрагменти за винаходом можуть вводитися, наприклад, за допомогою очних крапель, підкон'юктивальної ін'єкції, підкон'юктивального імплантату, ін'єкції в скловидне тіло, імплантату в скловидному тілі, субтенонової ін'єкції або субтенонового імплантату. Фармацевтична композиція може також доставлятися у везикулі, зокрема, в ліпосомі (див. Langer 1990 Science 249:1527-1533; Treat et al. (1989) in Liposomes in the Therapy of Infectious Disease and Cancer, Lopez-Berestein and Fidler (eds.), Liss, New York, pp. 353-365; LopezBerestein, там же., pp. 317-327; див., в основному там же). У деяких втіленнях, фармацевтична композиція може доставлятися в системі з контрольованим вивільненням. У одному втіленні, може використовуватися доставка з нагнітанням насосом (див. Langer, вище; Sefton 1987 CRC Crit. Ref. Biomed. Eng, 14:201). У іншому втіленні, можуть використовуватися полімерні матеріали. Ще в одному втіленні, система з контрольованим вивільненням може вміщуватися поблизу від мішені композиції, таким чином потрібна тільки частина системної дози (див., наприклад, Goodson, 1984, in Medical Applications of Controlled Release, вище, vol. 2, pp. 115-138). Ін'єктовані препарати можуть включати дозовані форми для внутрішньовенних, підшкірних, внутрішньошкірних і внутрішньом'язових ін'єкцій, краплинних інфузій і т. д. Ці ін'єктовані препарати можуть бути отримані за допомогою загальновідомих методів. Наприклад, ін'єктовані препарати можуть бути отримані, наприклад, за допомогою розчинення, суспендування або емульгування антитіла або його солі, описаних вище, в стерильному водному середовищі або в масляному середовищі, що стандартно використовуються для ін'єкцій. Як водне середовище для ін'єкцій використовують, наприклад, фізіологічний розчин, ізотонічний розчин, що містить глюкозу і інші додаткові агенти і т. д., які можуть використовуватися в комбінації з відповідним солюбілізуючим агентом. таким як спирт (наприклад, етанол), поліспирт (наприклад, пропіленгліколь, поліетиленгліколь), неіонна поверхнево-активна речовина [наприклад, полісорбат 80, HCO-50 (поліоксіетиленовий аддукт (50 моль) гідрогенізованої рицинової олії)] і т. д. Як масляне середовище застосовують, наприклад, сезамову олію, соєву олію і т. д., які можуть використовуватися в комбінації з солюбілізуючим агентом, таким як бензилбензоат, бензиловий спирт і т. д. Таким чином, отримують розчин для ін'єкції, переважно заповнений у відповідну ампулу. Переважно, фармацевтичні композиції для перорального або парентерального застосування, описані вище, отримують в дозованих формах з єдиним дозуванням, прийнятним для додавання дози активних інгредієнтів. Дозовані форми в єдиному дозуванні включають, наприклад, таблетки, пілюлі, капсули, ін'єкції (ампули), супозиторії і т. д. Кількість вищезгаданого антитіла, що міститься, як правило, складає приблизно від 5 приблизно до 500 мг на дозовану форму в єдиному дозуванні; особливо в формі розчину для ін'єкції, переважно, щоб вищезгадане антитіло містилося в кількості приблизно від 5 приблизно до 100 мг і в кількості приблизно від 10 приблизно до 250 мг для інших дозованих форм. Терапевтичні застосування антитіл Антитіла за винаходом застосовують серед іншого для лікування, запобігання і/або послаблення будь-якого захворювання або порушення, асоційованого з активністю Ang-2, 16 UA 108207 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 включаючи захворювання або порушення, асоційовані з ангіогенезом. Антитіла або антигензв'язувальні ділянки за даним винаходом можуть використовуватися для лікування, наприклад, первинних і/або метастазуючих пухлин, що з'явилися в мозку і м'яких мозкових оболонках, в ротовій частині глотки, легені і в бронхіальному дереві, шлунково-кишковому тракті, чоловічому і жіночому репродуктивному тракті, в м'язах, кістках, шкірі і додатках, з'єднувальній тканині, в селезінці, імунній системі, в кровотворних клітинах і в кістковому мозку, в печінці і в сечовивідному шляху, і в спеціальних органах чуттів, таких як очі. У деяких втіленнях, антитіла і антигензв'язувальні фрагменти за винаходом використовуються для лікування одного або декількох з наступних ракових захворювань: печінковоклітинної карциноми, панкреатичної карциноми, раку грудей, раку простати, злоякісної гліоми, остеосаркоми, колоректального раку, злоякісної мезотеліоми, множинної мієломи, раку яєчників, дрібноклітинного раку легені, недрібноклітинного раку легені, синовіальної карциноми, раку щитовидної залози або меланоми. Антитіла і антигензв'язувальні фрагменти за даним винаходом також можуть застосовуватися для лікування одного або декількох очних порушень. Типові очні порушення, які можуть бути піддані лікуванню за допомогою антитіл або антигензв'язувальних фрагментів за винаходом, включають, наприклад, вікову макулярну дегенерацію, діабетичну ретинопатію і інші очні порушення, асоційовані з хороїдальною неоваскуляризацією, просочення судин, едему і запалення сітківки. Крім того, анти-Ang-2 антитіла за винаходом можуть вводитися як ад'ювант при глаукомній хірургії для запобігання ранньому гемо- і лімфангіогенезу і залучення макрофагів до фільтраційної подушки після глаукомної хірургії і для поліпшення клінічного результату. У інших втіленнях даного винаходу, антитіла або антигензв'язувальні фрагменти використовуються для лікування, гіпертензії, діабету (включаючи інсулін-незалежний цукровий діабет), псоріазу, артриту (включаючи ревматоїдний артрит), астми, сепсису, захворювання нирок і едеми, асоційованої з раною, інсультом або пухлиною. Було продемонстровано, що експресія Ang-2 корелює з тяжкістю різних запальних і/або інфекційних захворювань (див., наприклад, Siner et al., 2009, Shock 31: 348-353; Yeo et al., 2008, Proc. Natl. Acad. Sci. (USA): 105: 17097-17102). Відповідно, анти-Ang-2 антитіла за даним винаходом можуть використовуватися для лікування, запобігання або послаблення одного або декількох запальних або інфекційних захворювань. Типові інфекційні захворювання, які можуть бути піддані лікуванню, запобіганню або послабленню за допомогою введення анти-Ang-2 антитіл за винаходом, включають, зокрема: малярію (інфекція Plasmodium falciparum), вірусні геморагічні лихоманки (наприклад, лихоманка денге), інфекція рикетсії, синдром токсичного шоку, сепсис, гепатит С, інфекція Bartonella bacilliformis, лейшманіоз, мікобактеріальна інфекція і інфекція вірусом Епштейна-Барра. Комбіновані терапії Комбіновані терапії можуть включати анти-Ang-2 антитіло за винаходом і, наприклад, інший антагоніст Ang-2 (наприклад, анти-Ang-2 антитіло, пептитіло (peptibody), або CovX-тіло, таке як CVX-060 (див., США 7521425)). Анти-Ang-2 антитіла за винаходом також можуть вводитися разом з іншим антиангіогенним агентом, таким як, наприклад, антагоніст VEGF (наприклад, VEGF-Trap, див., наприклад, США 7087411 (також позначений в даному документі як "VEGFінгібуючий злитий білок"), анти-VEGF антитіло (наприклад, бевацизумаб), низкьомолекулярний кіназний інгібітор рецептора VEGF (наприклад, сунитініб, соравеніб або пазопаніб), анти-DLL4 антитіло (наприклад, анти-DLL4 антитіло, розкрите в США 2009/0142354, таке як REGN421) і т. д.), або разом з антагоністом рецептора фактора епідермального росту (EGFR) (наприклад, анти-EGFR антитіло або низькомолекулярний інгібітор активності EGFR). Інші агенти, які можуть з користю вводитися в комбінації з анти-Ang-2 антитілами за винаходом, включають інгібітори цитокінів, що включають низькомолекулярні інгібітори цитокінів і антитіла, які зв'язуються з цитокінами, такими як IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-8, IL-9, IL-11, IL-12, IL-13, IL-17, IL-18, або з їх відповідними рецепторами. Даний винахід також включає терапевтичну комбінацію, що включає будь-яке з анти-Ang-2 антитіл, вказаних в даному документі, і інгібітор одного або декількох з VEGF, DLL4, EGFR, або будь-якого з вищезгаданих цитокінів, де інгібітор являє собою аптамер, антисмислову молекулу, рибозим, міРНК, пептитіло, нанотіло або фрагмент антитіла (наприклад, Fab-фрагмент; F(ab')2-фрагмент; Fd-фрагмент; Fv-фрагмент; scFv; dAbфрагмент; або інші сконструйовані молекули, такі як діатіла, триатіла, тетратіла, мінітіла і мінімальні елементи, що розпізнають). Анти-Ang-2 антитіла за винаходом також можуть вводитися в комбінації з противірусними агентами, антибіотиками, анальгетиками, кортикостероїдами і/або з NSAID. Анти-Ang-2 антитіла за винаходом також можуть вводитися у вигляді частини схеми лікування, яка також включає променеву терапію і/або стандартну хіміотерапію. При об'єднанні з одним або декількома додатковими агентами, анти-Ang-2 17 UA 108207 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 антитіла за винаходом можуть вводитися перед введенням іншого агента (інших агентів), одночасно з ним (наприклад, в тому ж складі або в окремих складах), або послідовно з введенням іншого агента (інших агентів). Діагностичні застосування антитіл Анти-Ang-2 антитіла за даним винаходом також можуть використовуватися для детектування і/або вимірювання Ang-2 в зразку, наприклад, для діагностичних цілей. Наприклад, анти-Ang-2 антитіло або його фрагмент може використовуватися для діагностування патологічного стану або захворювання, що характеризується аберантною експресією (наприклад, над-експресією, низькою експресією, відсутністю експресії і т. д.) Ang-2. Типові діагностичні аналізи для Ang-2 можуть включати, наприклад, контакт зразка, отриманого від пацієнта, з анти-Ang-2 антитілом за винаходом, де анти-Ang-2 антитіло помічене за допомогою детектованої мітки або репортерної молекули. Альтернативно, немічене анти-Ang-2 антитіло може використовуватися в діагностичних застосуваннях в комбінації з вторинним антитілом, яке саме помічено за допомогою детектованої мітки. Детектована мітка або 3 14 32 35 125 репортерна молекула може являти собою радіоізотоп, такий як H, C, P, S або I; флуоресцентний або хемілюмінесцентний компонент, такий як флуоресцеїну ізотіоціанат, або родамін; або фермент, такий як лужна фосфатаза, β-галактозидаза, пероксидаза хріну або люцифераза. Конкретні типові аналізи, які можуть використовуватися для детектування або вимірювання Ang-2 в зразку, включають твердофазний імуноферментний аналіз (ELISA), радіоімуноаналі (RIA), аналіз з використанням клітинного сортера з активацією флуоресценції (FACS). ПРИКЛАДИ Наступні приклади використані з тим, щоб забезпечити фахівця в даній галузі повним розкриттям і описом того, як зробити або застосувати способи і композиції за винаходом, і не призначені для обмеження рамок того, що автори розглядають як свій винахід. Були зроблені зусилля для забезпечення точності відносно використовуваних чисел (наприклад, кількостей, температури і т. д.), але деякі експериментальні помилки і відхилення повинні бути прийняті до уваги. Якщо не вказано інше, частини є масовими частинами, молекулярна маса є середньомасовою молекулярною масою, температура представлена в градусах Цельсія, а тиск є атмосферним або близьким до нього. Приклад 1. Генерування людських антитіл до людського Ang-2 Людський Ang-2-антиген вводили безпосередньо, з ад'ювантом для стимуляції імунної системи, миші VELOCIMMUNE®, що містить ДНК, яка кодує варіабельні ділянки важкого і легкого каппа-ланцюга імуноглобуліну людини. Антитільну імунну відповідь відстежували за допомогою Ang-2-специфічного імуноаналізу. Коли досягали цільової імунної відповіді, спленоцити збирали і зливали з мишачими мієломними клітинами для збереження їх життєздатності і утворення гібридомних клітинних ліній. Гібридомні клітинні лінії скринували і селектували для ідентифікації клітинних ліній, які продукують Ang-2-специфічні антитіла. З використанням даного методу було отримано декілька анти-Ang-2 химерних антитіл (тобто, антитіл, що мають людські варіабельні домени і мишачі константні домени); типові антитіла, генеровані таким способом, позначали таким чином: H1 M724, H1 M727, H1 M728, H2M730, H1 M732, H1 M737, H2M742, H2M743, H2M744, H1 M749, H2M750 і H1 M810. Анти-Ang-2 антитіла також виділяли безпосередньо з антиген-позитивних В-клітин без злиття з мієломними клітинами, як описано в США 2007/0280945A1. З використанням даного методу було отримано декілька людських анти-Ang-2 антитіл (тобто, антитіл, що мають людські варіабельні домени і людські константні домени); типові антитіла, генеровані таким способом, позначали таким чином; H1 H685, H1 H690, H1 H691, H1 H693, H1 H694, H1 H695, H1 H696, H1 H704, H1 H706 і H1 H707. Біологічні властивості типових анти-Ang-2 антитіл, генерованих згідно з методами даного Прикладу, детально описані в Прикладах, представлених нижче. Приклад 2. Аналіз із застосуванням варіабельного гена Для аналізу структури отриманих антитіл клонували і секвенували нуклеїнові кислоти, що кодують варіабельні ділянки антитіл. На основі послідовності нуклеїнової кислоти і передбаченої амінокислотної послідовності антитіл ідентифікували застосування гена для кожної варіабельної ділянки важкого ланцюга (HCVR) і варіабельної ділянки легкого ланцюга (LCVR) (Таблиця 1). 18 UA 108207 C2 Таблиця 1 Антитіло H1H685 H1H690 H1H691 H1H693 H1H694 H1H695 H1H696 H1H704 H1H706 H1H707 H1M724 H1M727 H1M728 H2M730 H1M732 H2M742 H2M743 H2M744 H1M749 H2M750 H1M810 5 VH 3-13 3-23 3-9 3-23 3-15 3-33 3-11 3-33 3-33 3-33 3-33 1-18 3-7 3-7 3-15 3-23 3-23 1-18 3-33 3-33 3-23 HCVR DH 3-16 4-4 4-17 4-4 6-6 5-12 4-17 6-6 3-3 3-3 3-3 3-3 6-19 6-13 1-7 5-5 2-8 4-4 5-5 6-6 3-3 LCVR VK JK 3-20 1 3-11 4 3-20 4 1-12 1 1-5 1 3-15 5 1-16 4 1-16 5 1-16 1 3-20 4 1-17 4 2-28 2 1-5 1 1-5 1 1-17 3 2-28 4 1-12 4 1-12 4 3-15 1 1-16 4 1-12 1 JH 4 3 6 3 4 6 4 4 3 3 5 6 4 4 4 5 4 5 4 4 3 Ідентифікатор антитіла HCVR/LCVR SEQ ID NO 2/10 26/34 50/58 74/82 98/106 122/130 146/154 170/178 194/202 218/226 266/274 338/346 290/298 362/370 242/250 386/394 410/418 434/442 314/322 458/466 482/490 У Таблиці 2 представлені пари амінокислотних послідовностей варіабельних ділянок легкого ланцюга вибраних анти-Ang-2 антитіл і їх відповідні ідентифікатори антитіл. Позначення N, Р і G означають антитіла, що містять важкі і легкі ланцюги з ідентичними CDR-послідовностями, але з варіаціями послідовності в ділянках, які лежать поза CDR-послідовностями (наприклад, в каркасних ділянках). Таким чином, варіанти N, Р і G конкретного антитіла мають ідентичні CDRпослідовності всередині їх варіабельних ділянок важкого і легкого ланцюга, але містять модифікації всередині каркасних ділянок. 10 19 UA 108207 C2 Таблиця 2 Назва H1H685N H1H690N H1H691N H1H693N H1H694N H1H695N H1H696N H1H704N H1H706N H1H707N H1M724N H1M727N H1M728N H2M730N H1M732N H1M737N H2M742N H2M743N H2M744N H1M749N H2M750N H1M810N HCVR/LCVR SEQ ID NO 2/10 26/34 50/58 74/82 98/106 122/130 146/154 170/178 194/202 218/226 266/274 338/346 290/298 362/370 242/250 506/X* 386/394 410/418 434/442 314/322 458/466 482/490 HCVR/LCVR SEQ ID NO 18/20 42/44 66/68 90/92 114/116 138/140 162/164 186/188 210/212 234/236 282/284 354/356 306/308 378/380 258/260 514/X* 402/404 426/428 450/452 330/332 474/476 498/500 Назва H1H685P H1H690P H1H691P H1H693P H1H694P H1H695P H1H696P H1H704P H1H706P H1H707P H1M724P H1M727P H1M728P H2M730P H1M732P H1M737P H2M742P H2M743P H2M744P H1M749P H2M750P H1M810P Назва H1H685G H1H690G H1H691G H1H693G H1H694G H1H695G H1H696G H1H704G H1H706G H1H707G H1M724G H1M727G H1M728G H2M730G H1M732G H1M737G H2M742G H2M743G H2M744G H1M749G H2M750G H1M810G HCVR/LCVR SEQ ID NO 22/24 46/48 70/72 94/96 118/120 142/144 166/168 190/192 214/216 238/240 286/288 358/360 310/312 382/384 262/264 516/X* 406/408 430/432 454/456 334/336 478/480 502/504 Амінокислотна послідовність LCVR H1 M737 не представлена. 5 10 15 20 25 30 Контрольні конструкції, що використовуються в наступних прикладах Різні контрольні конструкції (анти-Ang-2 антитіла і анти-Ang-2 пептитіла) були включені в наступні експерименти для порівняльних цілей. Контрольні конструкції позначені таким чином: Контроль I: людське анти-Ang-2 антитіло, що містить варіабельні домени важкого і легкого ланцюга, що мають амінокислотні послідовності відповідних доменів "Ab536(THW)", як представлено в США 2006/0018909 (див., також Oliner et al., 2004, Cancer Cell 6:507-516); Контроль II: пептитіло, яке зв'язується з людським Ang-2, що має амінокислотну послідовність "2XCon4(С)", як представлено в США 7205275, (див., також Oliner et al., 2004, Cancer Cell 6:507516); Контроль III: пептитіло, яке зв'язується з людським Ang-2, що має амінокислотну послідовність "L1-7", як представлено в США 7138370; Контроль IV: людське анти-Ang-2 антитіло, що містить варіабельні ділянки важкого і легкого ланцюга, що мають амінокислотні послідовності відповідних доменів "3.19.3", як представлено в США 2006/0246071; і Контроль V: людське анти-Ang-2 антитіло, що містить варіабельні ділянки важкого і легкого ланцюга, що мають амінокислотні послідовності відповідних доменів "MEDI1/5", як представлено в WO 2009/097325. (Не всі контрольні конструкції використовувалися в кожному Прикладі). У таблицях, представлених нижчим, позначення "Ab" і "Pb" включені для ідентифікації антитільних і пептитільних контролів, відповідно (тобто, Контроль I=Ab; Контроль II=Pb; Контроль III=Pb; Контроль IV=Ab; і Контроль V=Ab). Приклад 3. Визначення антигензв'язувальної афінності Константи дисоціації при рівновазі (значення KD) для зв'язування вибраних очищених Ang-2антитіл з димерним фібриногеноподібним доменом людського (SEQ ID NO: 519), мишачого (Mus musculus; SEQ ID NO: 520) і мавпячого (Maca fascicularis; SEQ ID NO: 521) Ang-2 (Ang-2FD), кон'югованого з людським IgG1 (SEQ ID NO: 528), визначали за допомогою поверхневої кінетики в режимі реального часу з використанням аналізу поверхневого плазмонного резонансу з використанням біосенсора. Антитіло захоплювали на антитільну поверхню поліклонального козячого антитіла до мишачого IgG, козячого антитіла до людського K (Southern Biotech, Birmingham, AL) або на антитільну поверхню поліклонального козячого антитіла до людського IgG (Jackson Immuno Research Lab, West Grove, PA), створену через пряму аміноконденсацію з 20 UA 108207 C2 5 сенсорним чіпом BIACORE™ CM5 з утворенням захопленої антитільної поверхні. Різні концентрації (в інтервалі від 50 нM до 6,25 нM) білка ін'єктувавали зі швидкістю 100 мкл/хв поверх захопленої антитільної поверхні протягом 90 секунд. Зв'язування і дисоціацію антигенантитіла відстежували в режимі реального часу при кімнатній температурі. Кінетичний аналіз здійснювали для розрахунку KD і періоду півжиття дисоціації комплексу антиген/антитіло. Результати підсумовані в Таблиці 3 нижче. Таблиця 3 Антитіло Димерний людський Ang-2FD H1M724N H1M728N H2M730N H1M732N H1M737N H2M742N H2M743N H2M744N H2M749N H2M750N 10 KD (пM) 179 137 210 484 251 295 154 98,9 165 362 T1/2 (хв.) 42,7 58,4 47 35,5 34,5 38 167 109,1 42,9 32,2 Димерний мишачий Ang- Димерний мавпячий Ang2FD 2FD KD (пM) T1/2 (хв.) KD (пM) T1/2 (хв.) 694 16 730 25,7 5650 9,9 1580 69,5 842 36,6 1700 21,4 7330 24,1 1740 6,3 3810 16 610 30,8 6170 28,5 882 195,2 234 169,2 143 223,1 500 281,7 529 25,5 1500 40,9 1470 23 Вищеописаний експеримент повторювали з використанням вибраних очищених анти-Ang-2 антитіл, клонованих на людських IgG1. Результати підсумовані в Таблиці 4 нижче. Таблиця 4 Антитіло H1H685P H1H690P H1H691P H1H693P H1H694P H1H695P H1H696P H1H704P H1H706P H1H707P H1H724N H1H728N H1H730N H1H732N H1H742N H1H743N H1H744N H1H749N H1H750N Контроль I (Ab) 15 Димерний людський Ang-2FD KD (пM) 71,4 79 220 500 126 245 289 331 201 262 115 162 234 386 186 88,2 114 118 164 339 T1/2 (хв.) 229,4 126,1 38,5 37,1 265,6 147 38,8 86,1 50,4 26,6 107 81 62 57 65 254 127 109 127 34,8 Димерний мишачий Ang- Димерний мавпячий Ang2FD 2FD KD (пM) T1/2 (хв.) KD (пM) T1/2 (хв.) 148 128,7 99,4 177,1 91,3 105,2 55,6 195,2 220 43,8 290 41 446 63,7 1170 17,6 237 166,5 356 85,6 347 124,2 440 84,1 402 37,6 354 36,6 484 61,9 818 33,5 357 47 164 53,3 328 34,4 283 22,3 185 84 239 173 5760 20 2000 77 97,1 90 3400 87 529 51 439 118 276 58 683 93 124 233 96,5 780 158 115 346 164 177 96 407 143 218 121 199 244 339 47,1 537 27,1 Додаткові експерименти зв'язування проводили з використанням вибраних анти-Ang-2 антитіл при двох різних температурах для додаткової оцінки міжвидової афінності. Кожне вибране антитіло або контрольна конструкція захоплювалися зі швидкістю потоку 40 мкл/хв. протягом 1 хвилини на антитільну поверхню поліклонального козячого антитіла до людського каппа ланцюга, створеного за допомогою безпосередньої хімічної конденсації з чіпом BIACORE™ з утворенням захопленої антитільної поверхні. Людський, мавпячий і мишачий Ang2FD-Fc в концентрації 25 нM або 0,78 нM ін'єктували поверх захоплених антитільної поверхні зі 21 UA 108207 C2 швидкістю потоку 60 мкл/хв. протягом 3 хвилин, і дисоціацію антиген-антитіла відстежували в режимі реального часу протягом 20 хвилин або при 25 °C, або при 37 °C. Результати підсумовані в Таблицях 5 (зв'язування при 25 °C) і 6 (зв'язування при 37 °C), представлених нижчим. 5 Таблиця 5 Зв'язування при 25 °C Антитіло H1H685P H1H744N Контроль I (Ab) Контроль IV (Ab) Димерний людський Ang2FD-mFc KD (Молярна) T1/2 (хв.) 1,17E-11 227 1,16E-10 23 Димерний мишачий Ang- Димерний мавпячий Ang2FD-hFc 2FD-hFc KD (Молярна) T1/2 (хв.) KD (Молярна) T1/2 (хв.) 6,51E-11 208 2,20E-11 275 3,85E-10 33 2,44E-10 24 1,07E-09 15 1,07E-09 15 1,03E-09 4 1,27E-11 269 4,02E-11 289 1,55E-11 342 Таблиця 6 Зв'язування при 37 °C Димерний людський Ang- Димерний мишачий Ang- Димерний мавпячий Ang2FD-mFc 2FD-hFc 2FD-hFc KD (Молярна) T1/2 (хв.) KD (Молярна) T1/2 (хв.) KD (Молярна) T1/2 (хв.) H1H685P 2,70E-11 60 9,39E-11 64 7,21E-11 65 H1H744N 1,05E-10 18 2,15E-10 26 3,20E-10 11 Контроль I (Ab) ----3,90E-10 12 ----Контроль IV (Ab) 9,91E-12 184 5,40E-11 119 4,74E-11 107 Антитіло 10 У іншому експерименті визначали значення K D для вибраних очищених антитіл, які зв'язуються з людським "bow-Ang-2" тетрамерною конструкцією ("hBA2") (з використанням методів, описаних вище). hBA2 складається з двох димерів, причому кожний димер містить два фібронектиноподібні домену Ang-2, пов'язаних один з одним за допомогою людського Fcдомену. Амінокислотна послідовність димерних складових hBA2 представлена в SEQ ID NO: 522. Результати підсумовані в Таблиці 7 нижче. 22 UA 108207 C2 Таблиця 7 hBA2 Антитіло KD (пM) 11,9 17,9 106 299 68,4 40,1 111 93,9 79,1 75,2 23,3 41,8 55,9 132 72,1 9,71 17,2 32,5 36,9 83 H1H685P H1H690P H1H691P H1H693P H1H694P H1H695P H1H696P H1H704P H1H706P H1H707P H1H724N H1H728N H1H730N H1H732N H1H742N H1H743N H1H744N H1H749N H1H750N Контроль I (Ab) 5 T1/2 (хв.) 587,2 299,3 50,6 28,7 111,3 254,3 51,5 117,7 63,9 51,4 323 185 152 73 87 1118 442 235 284 57,5 Ще в одному експерименті, визначали значення KD для вибраних очищених антитіл, які зв'язуються з людським Ang-2 дикого типу (hAng-2-WT; SEQ ID NO: 518) і з фібриногеноподібним доменом людського Ang2 (hAng-2FD) (як описано вище). Результати підсумовані в Таблиці 8 нижче. 23 UA 108207 C2 Таблиця 8 Антитіло H1M724N H1M728N H2M730N H1M732N H1M737N H2M742N H2M743N H2M744N H2M749N H2M750N H1H685P H1H691P H1H690P H1H693P H1H694P H1H695P H1H696P H1H704P H1H706P H1H707P H1H724N H1H728N H1H730N H1H732N H1H742N H1H743N H1H744N H1H749N H1H750N Контроль I (Ab) Контроль II (Pb) 5 10 Мономерний hAng-2FD KD (нM) T1/2 (хв.) 1,75 17,4 1,17 33,9 2,06 24,4 6,13 18,7 2,82 13,1 4,81 18,0 0,399 156,7 0,475 89,3 1,38 27,9 4,42 21,5 0,578 55 11 0,57 0,594 25,16 44,8 0,61 7,89 9,85 1,12 50,59 38,4 0,20 0,39 3,31 11 1,02 145 2,4 13,34 1,18 5,86 2,84 3,44 264 0,22 486 2,29 2,35 33,03 1,02 42,14 1,13 33,48 0,787 30,20 44,5 0,03 90 hAng-2-WT KD (пM) T1/2 (хв.) 33,1 568 33,8 725 49,2 519 131 333 59,3 282 67,9 437 14,3 2366 28,9 846 49 479 40,8 991 47,6 1000 19,1 684,6 12,4 1568 425 100 158 209,7 31,1 1770,7 40,3 642,7 36,2 747,6 27,4 661,9 77,1 217,4 22,6 895 43 566 47,5 534 202 264 44,9 666 9,48 3927 30,8 837 12,5 1833 9,5 4442 47,6 512 44,7 334,8 Додаткові експерименти проводили для вимірювання властивостей зв'язування вибраних анти-Ang-2 антитіл з мономерним hAng-2FD при 25 °C і при 37 °C. Кожне вибране антитіло або контрольна конструкція захоплювалися зі швидкістю потоку 40 мкл/хв. протягом 1 хвилини на антитільну поверхню поліклонального козячого антитіла до людського IgG, створеного за допомогою безпосередньої хімічної конденсації з чіпом BIACORE™ з утворенням захопленої антитільної поверхні. Людський Ang-2FD в концентрації 500 нM або 7,8 нM ін'єктували поверх захоплених антитільної поверхні зі швидкістю потоку 60 мкл/хв. протягом 3 хвилин, і дисоціацію антиген-антитіла відстежували в режимі реального часу протягом 20 хвилин або при 25 °C або при 37 °C. Результати підсумовані в Таблицях 9 (25 °C) і 10 (37 °C), представлених нижче. N/D=не визначено. 24 UA 108207 C2 Таблиця 9 Зв'язування з мономерним hAng-2FD при 25 °C -1 H1H685P H1H744N Контроль I (Ab) Контроль II (Pb) Контроль III (Pb) Контроль IV (Ab) ka (Mс ) 2,44E+05 2,92E+05 4,00E+05 Стаціонарний стан 5,40E+05 2,84E+05 -1 KD (с ) KD (Молярна) T½ 7,96E-05 3,36E-10 145 хвилин 1,24E-04 4,24E-10 93 хвилин 5,10E-02 1,28E-07 14 секунд Стаціонарний стан 9,00E-08 Стаціонарний стан 6,30E-02 1,17E-07 11 секунд 3,56E-02 1,25E-07 19 секунд Таблиця 10 Зв'язування з мономерним hAng-2FD при 37 °C ka (Mс-1) H1H685P H1H744N Контроль I (Ab) Контроль II (Pb) Контроль III (Pb) Контроль IV (Ab) 5 10 15 20 25 -1 -1 ka (Mс ) ka (Mс ) 4,06E+05 1,39E-04 3,86E+05 5,48E-04 Стаціонарний стан Стаціонарний стан N/D N/D Стаціонарний стан Стаціонарний стан Стаціонарний стан Стаціонарний стан KD (Молярна) T½ 3,42E-10 83 хвилини 1,42E-09 21 хвилина 1,51E-07 Стаціонарний стан N/D N/D 2,94E-07 Стаціонарний стан 9,40E-08 Стаціонарний стан Як продемонстровано в даному Прикладі, деякі з анти-Ang-2 антитіл, генерованих згідно з методами Прикладу 1, зв'язувалися з конструкціями Ang-2 з еквівалентною або вищою афінністю, ніж контролі. Наприклад, антитіла H1 H685, H1 H690, H1 H724 і H1 H744 зв'язувалися з димерним людським Ang-2-FD з KD 71,4, 79, 115 і 114 пM, відповідно, тоді як антитіло Контроль I зв'язувалося з димерним людським Ang-2-FD з KD 339 пM (див. Таблицю 4). Аналогічно, антитіла H1 H685, H1 H690, H1 H724 і H1 H744 зв'язувалися з людським BA2 (конструкція, що містить тетрамерний фібриногеноподібний домен Ang-2) з KD 11,9, 17,9, 23,3 і 17,2 пM, відповідно, тоді як антитіло Контроль I зв'язувалося з hBA2 з K D 83 пM (див. Таблицю 7). Таким чином, в порівнянні з контрольними конструкціями, багато антитіл за винаходом демонстрували посилення зв'язування з Ang-2. Антитіло H1 H685P демонструвало властивості особливо сильного зв'язування з Ang-2 в порівнянні з контрольними конструкціями. Приклад 4. Переважне зв'язування з ANG-2 в порівнянні з ANG-1 Експеримент зв'язування (аналізи плазмонного резонансу) проводили для перевірки того, чи зв'язуються вибрані антитіла з обома, Ang-2 і Ang-1, або вони переважно зв'язуються тільки з Ang-2. Кожне вибране антитіло або контрольна конструкція захоплювалися зі швидкістю потоку 40 мкл/хв. протягом 1 хвилини на антитільну поверхню поліклонального козячого антитіла до людського IgG, створену за допомогою безпосередньої хімічної конденсації з чіпом BIACORE™ з утворенням захопленої антитільної поверхні. Повнорозмірний людський Ang-1 або Ang-2 дикого типу в концентрації 25 нM або 0,78 нM ін'єктували поверх захопленої антитільної поверхні зі швидкістю потоку 60 мкл/хв. протягом 3 хвилин, і дисоціацію антиген-антитіла відстежували в режимі реального часу протягом 20 хвилин або при 25 °C, або при 37 °C. Результати даних експериментів підсумовані в Таблицях 11-14 нижче. N/D=не визначено. "Немає зв'язування" означає, що не спостерігали детектованого зв'язування в конкретних експериментальних умовах, що використовуються в даних експериментах. 25 UA 108207 C2 Таблиця 11а Зв'язування з hAng-2-WT при 25 °C -1 H1H685P H1H744N Контроль I (Ab) Контроль II (Pb) Контроль III (Pb) Контроль IV (Ab) ka (Mс ) 6,59E+05 7,65E+05 4,74E+05 7,73E+05 3,29E+05 3,80E+06 -1 KD (с ) 1,60E-05 2,57E-05 2,26E-05 3,45E-05 1,98E-05 2,74E-04 KD (Молярна) 2,42E-11 3,35E-11 4,76E-11 4,47E-11 6,01E-11 7,22E-11 T½ (хвилини) 722 450 512 335 584 42 Таблиця 11b Зв'язування з hAng-2-WT при 25 °C -1 H1H685P Контроль II (Pb) Контроль V (Ab) ka (Mс ) 1,15E+05 8,30E+04 1,12E+05 -1 KD (с ) 8,50E-06 5,41E-05 2,66E-05 KD (Молярна) 7,39E-11 6,52E-10 2,73E-10 T½ (хвилини) 1359 213 434 Таблиця 12a Зв'язування з hAng-1-WT при 25 °C -1 -1 ka (Mс ) KD (с ) KD (Молярна) T½ (хвилини) H1H685P Немає зв'язування Немає зв'язування Немає зв'язування Немає зв'язування H1H744N 4,10E+05 3,81E-05 9,30E-11 303 Контроль I (Ab) 4,55E+05 2,49E-05 5,47E-11 464 Контроль II (Pb) 4,53E+05 3,54E-05 7,82E-11 326 Контроль III (Pb) Немає зв'язування Немає зв'язування Немає зв'язування Немає зв'язування Контроль IV (Ab) 6,60E+05 1,11E-04 1,68E-10 105 Таблиця 12b Зв'язування з hAng-1-WT при 25 °C -1 H1H685P Контроль II (Pb) Контроль V (Ab) ka (Mс ) Немає зв'язування 3,04E+05 2,75E+05 -1 KD (с ) Немає зв'язування 2,51E-05 6,68E-05 KD (Молярна) Немає зв'язування 8,26E-11 2,43E-10 T½ (хвилини) Немає зв'язування 460 173 5 Таблиця 13a Зв'язування з hAng-2-WT при 37 °C -1 H1H685P H1H744N ka (Mс ) 8,54E+05 7,01E+05 -1 KD (с ) 3,76E-05 2,43E-04 26 KD (Молярна) 4,40E-11 3,47E-10 T½ (хвилини) 707 48 UA 108207 C2 Таблиця 13b Зв'язування з hAng-2-WT при 37 °C -1 ka (Mс ) 1,36E+05 3,79E+04 9,42E+04 H1H685P Контроль II (Pb) Контроль V (Ab) -1 KD (с ) 2,16E-05 1,17E-04 7,92E-05 KD (Молярна) 1,59E-10 3,09E-09 8,41E-10 T½ (хвилини) 535 99 146 Таблиця 14a Зв'язування з hAng-1-WT при 37 °C -1 H1H685P H1H744N Контроль III (Pb) -1 ka (Mс ) KD (с ) KD (Молярна) T½ (хвилини) Немає зв'язування Немає зв'язування Немає зв'язування Немає зв'язування 1,47E+06 5,20E-05 3,12E-11 222 Немає зв'язування Немає зв'язування Немає зв'язування Немає зв'язування Таблиця 14b Зв'язування з hAng-1-WT при 37 °C -1 -1 ka (Mс ) KD (с ) KD (Молярна) T½ (хвилини) H1H685P Немає зв'язування Немає зв'язування Немає зв'язування Немає зв'язування Контроль II (Pb) 2,81E+05 4,35E-05 1,55E-10 266 Контроль V (Ab) 4,42E+05 5,47E-05 1,24E-10 211 5 10 15 20 25 30 Ці результати демонструють, що H1 H685P є унікальним серед антитіл, тестованих в даному експерименті в тому, що воно зв'язується з високою афінністю з Ang-2, але не зв'язується з Ang1. Інша єдина конструкція, яка демонструє зв'язування з Ang-2, але не з Ang-1, це Контроль III. Однак потрібно підкреслити, що Контроль III являє собою пептитіло і всі інші антитіла, тестовані в даному експерименті, зв'язувалися з обома, Ang-2 і Ang-1. Селективність відносно зв'язування Ang-2 може надавати H1 H685P терапевтичної ефективності, якої не мають антитіла, які зв'язуються з обома, Ang-2 і Ang-1. Приклад 5. Інгібування зв'язування ANG-2 з людським TIE-2 Tie-2 є природним рецептором Ang-2. Анти-Ang-2 антитіла тестували на предмет їх здатності блокувати зв'язування Ang-2 з людським Tie-2 (hTie-2). hTie-2-mFc (химерна конструкція, що складається з людського Tie-2, кон'югованого з мишачим IgG; SEQ ID NO: 525) наносили у вигляді покриття на 96-ямкові планшети в концентрації 2 мкг/мл і інкубували протягом ночі з подальшим промиванням чотири рази в буфері для промивання (PBS разом з 0,05 % Tween-20). Планшет потім блокували за допомогою PBS (Irvine Scientific, Santa Ana, CA), що містить 0,5 % BSA (Sigma-Aldriсh Corp., St. Louis, MO), протягом однієї години при кімнатній температурі. У окремому планшеті очищені анти-Ang-2 антитіла в стартовій концентрації 50 нM послідовно розводили в три рази в ямках планшета. Людський, мишачий або мавпячий білок Ang-2FD, кон'югований з людським IgG (Ang-2FD-hFc), додавали до кінцевої концентрації 2 нM, 8 нM або 2 нM, відповідно, і інкубували протягом однієї години при кімнатній температурі. Суміш антитіло/Ang-2FD-Fc потім додавали до планшета, що містить hTie-2-mFc, і інкубували протягом однієї години при кімнатній температурі. Детектування Ang-2FD-hFc, пов'язаного з білком hTie-2-mFc, визначали за допомогою Пероксидази хріну (HRP), кон'югованої з людським IgG-антитілом (Jackson lmmuno Research Lab, West Grove, PA), і виявляли за допомогою стандартної колориметричний реакції з використанням тетраметилбензидинового (TMB) субстрату (BD Biosciences, San Jose, CA). Поглинання зчитували при OD450 протягом 0,1 сік. процент блокування зв'язування Ang-2FD-hFc з hTie-2mFc за допомогою 16,67 нM вибраних анти-Ang-2 антитіл, представлений в Таблиці 15. 27 UA 108207 C2 Таблиця 15 Процент блокування зв'язування Ang-2FD з Tie-2 Людський Ang-2FD-hFc Мишачий Ang-2FD-hFc Мавпячий Ang-2FD-hFc H1M724N 99,5 96,6 95,2 H1M728N 98,5 83,9 97,1 H2M730N 98,9 55,0 97,3 H1M732N 97,7 90,9 95,8 H1M737N 99,1 95,4 90,5 H2M742N 99,6 98,6 94,1 H2M743N 99,6 98,4 95,1 H2M744N 99,5 98,4 95,5 H2M749N 99,5 97,3 97,4 H2M750N 99,4 53,7 97,4 Контроль I (Ab) 94,5 90,2 96,9 Антитіло 5 В аналогічному експерименті, вибрані очищені анти-Ang-2 антитіла, клоновані на людському IgG1, тестували на предмет їх здатності блокувати зв'язування Ang-2FD з hTie-2 (як описано вище). Процент блокування зв'язування Ang-2FD-hFc з hTie-2-mFc за допомогою 16,67 нM вибраних анти-Ang-2 антитіл, представлений в Таблиці 16. NT: не тестували. Таблиця 16 Антитіло H1H685P H1H690P H1H691P H1H693P H1H694P H1H695P H1H696P H1H704P H1H706P H1H707P H1H724N H1H744N Контроль I (Ab) 10 15 Процент блокування зв'язування Ang-2FD з Tie-2 Людський Ang-2FD-hFc Мишачий Ang-2FD-hFc Мавпячий Ang-2FD-hFc 93,8 97,1 62,2 97,2 98,0 99,6 97,4 96,7 99,8 73,9 63,6 NT 79,8 36,0 NT 98,4 97,6 NT 98,2 94,9 99,2 97,0 41,8 NT 97,1 95,9 99,8 95,1 93,8 NT 96,6 97,1 96,6 97,9 97,6 96,2 97,3 82,2 98,5 У іншому експерименті, вибрані очищені анти-Ang-2 антитіла тестували на предмет їх здатності блокувати зв'язування 20 пM біотинілованого hBA2 з hTie-2 (як описано вище). Для цього експерименту людський Tie-2, кон'югований з гістидиновим тагом (hTie-2-His; SEQ ID NO: 526), використовували аналогічно з hTie-2-mFc, як описано вище. Концентрації антитіла, починаючи від 5 нM, послідовно розводили в три рази. Значення IC50 (Інгібуюча Концентрація) генерували шляхом розрахунку кількості антитіла, необхідне для блокування 50 % сигналу в результаті зв'язування біотин-hBA2 з Tie-2. Середнє значення IC50 для кожного антитіла розраховували на основі двох окремих експериментів. Результати підсумовані в Таблиці 17. NB: не спостерігали блокування при концентрації 5 нM. 28