T-клітинні епітопи з раково-ембріонального антиген-незрілого рецепторного білка ламініну та їх медичне застосування

1. Пухлиноасоційований пептид, який складається з амінокислотної послідовності відповідно до SEQ ID No: 1. 2. Пухлиноасоційований пептид за пунктом 1, що має здатність зв'язуватися з молекулою головного комплексу гістосумісності людини (МНС) класу І, зокрема з HLA-A*0201. 3. Пухлиноасоційований пептид за п. 2, який при зв'язуванні з HLA-А*0201 здатний викликати утворення цитотоксичного Т-лімфоцита (ЦТК), який розпізнає клітину, що експресує поліпептид, який вміщує дану амінокислотну послідовність. 4. Пухлиноасоційований пептид за п. 1, який має здатність зв'язуватися з молекулою головного комплексу гістосумісності людини (МНС) класу II, зокрема з HLA-DRB1. 5. Пухлиноасоційований пептид за п. 1, де пептид включає непептидні зв'язки. (19) (21) a200712736 (22) 26.04.2006 (24) 10.01.2012 (86) PCT/EP2006/003888, 26.04.2006 (31) 05009095.0 (32) 26.04.2005 (33) EP (46) 10.01.2012, Бюл.№ 1, 2012 р. (72) ЦАЙС МАТТІАС, DE (73) ІММАТІКС БІОТЕКНОЛОДЖІС ГМБХ, DE (56) WO 2004/012681 A, 12.02.2004. DATABASE Geneseq [Online] 29 01.2003, "Human expressed protein tag (EPT) #1444." Retrieved from EBI accession no. GSN:ABU04778 Database accession no. ABU04778 -& DATABASE Geneseq [Online] 29.01.2003, "Human expressed protein tag (EPT) #1335." Retrieved from EBI accession no. GSP:ABU04669 Database accession no. ABU04669 & WO 02/078524 A (ZYCOS INC; CHICZ, ROMAN, M; TOMLINSON, ANDREW, J; URBAN, ROBERT, G) 10.10.2002. WO 2004/030615, 15.04.2004. DATABASE UniProt [Online] 1.11. 1996, "Potential laminin-binding protein (Fragment)." Retrieved from EBI accession no. UNIPROT:Q29231_PIG Database accession no. Q29231 & WINTERO A K ET AL: "Evaluation and characterization of a porcine small intestine cDNA library: analysis of 839 clones." MAMMALIAN GENOME : OFFICIAL JOURNAL OF THE INTERNATIONAL MAMMALIAN GENOME SO C2 2 UA 1 3 до пухлино-асоційованих пептидних епітопів Тхелперів, окремо або в поєднанні з іншими пухлино-асоційованими пептидами, які виступають активними фармацевтичними інгредієнтами композицій вакцин, стимулюючих протипухлинні імунні реакції. Зокрема, цей винахід відноситься до двох нових пептидних послідовностей, одержаних з молекул HLA І або II класу раково-ембріонального антиген-незрілого рецептору ламініну (OFA/iLR) людини, що може використовуватися у вакцинних або інших фармацевтичних композиціях для викликання протипухлинних імунних реакцій. В цілях даного винаходу, усі довідкові матеріали, що згадані тут, включені шляхом посилань в усій повноті. Стимулювання імунної реакції залежить від наявності антигенів, що визнані імунною системою хазяїна як чужорідні. Виявлення існування антигенів, асоційованих з пухлинами, надало можливість використовувати імунну систему хазяїна для впливу на ріст пухлини. Зараз досліджуються різні механізми використання як гуморальних, так і клітинних компонентів імунної системи для імунотерапії раку. Окремі елементи клітинної імунної реакції мають здатність безпосередньо розпізнавати та руйнувати клітини пухлин. Ізоляція цитотоксичних Тлімфоцитів (ЦТЛ) з популяцій пухлинних клітин або з периферичної крові наводить на думку, що такі клітини відіграють значну роль в природних імунних захистах проти раку (Cheever et al., Annals N.Y. Acad. Sci. 1993 690:101-112; Rosenberg SA. Shedding light on immunotherapy for cancer. N Engl J Med. 2004 Apr 1; 350(14):1461-3.). Зокрема, важлива роль в цій реакції відводиться Т-клітинам + + CD8 (TCD8 ), котрі розпізнають молекули головного комплексу гісто-сумісності (МНС) Класу І, що презентують пептиди зазвичай в 8-10 залишків, одержані з білків, які розташовані у ядрі чи цитозолі, або з дефектних рибосомних білків (DRIP). Білки DRIP є важливим джерелом пептидів і являють собою продукти неповної трансляції на рибосомах; вперше вони були описані науковою групою Дж. Юделла (Schubert U, Anton LC, Gibbs J, Norbury CC, Yewdell JW, Bennink JR. Rapid degradation of a large fraction of newly synthesized proteins by proteasomes. Nature. 2000 Apr 13;404(6779):770-4). МНС-молекули людини також мають назву лейкоцитарних антигенів людини (HLA). Існують два основні класи МНС-молекул, котрі можуть бути розпізнані Т-клітинами, що мають рецептори Т-клітин: МНС-І-молекули - їх можна знайти на більшості клітин, що мають ядро, котрі представляють пептиди, утворені в результаті протеолітичного розпаду ендогенних білків та більш крупних пептидів. Молекули МНС класу II можуть бути представлені в професійних антигенпрезентуючих клітинах (АПК), таких як макрофаги, дендритні клітини, на В-клітинах, на ендотеліальних клітинах та на змінених клітинах пухлин та стромі пухлин, що у звичайних обставинах не презентують МНС-молекули класу II на поверхнях клітин та представляють пептиди, які походять з екзогенних білків, що поглинаються АПК в ході ендоцитозу, або які іншим чином надходять до 97092 4 компартменту МНС класу II (МllС) і згодом обробляються та завантажуються до комплексу з МНС класу II. Комплекси пептиду та МНС-І розпізнають+ ся СD8 -позитивними цитотоксичними Тлімфоцитами, а комплекси пептиду та МНС-ІІ + СD4 -Т-хелперами (в цілому описано в роботі "Імунобіологія" -Immunobiology, авторами Charles Α., Jr. Janeway, Paul Travers, Mark Walport, Mark J. Shlomchik). Для того, щоб пептид індукував (викликав) клітинну імунну реакцію, він повинен бути зв'язаним з МНС-молекулою. Цей процес залежить від алелі МНС-молекули та специфічного поліморфізму амінокислотної послідовності пептиду. Зв'язані з МНС класу І пептиди зазвичай мають довжину 810 залишків, яка вміщує два консервативні залишки ("домен") в своїй послідовності, що взаємодіють з відповідною порожниною зв'язування МНСмолекули (див. 2-й перелік, опублікований в роботі "Імуногенетика" - Immunogenetics (Rammensee Η, Bachmann J, Emmerich NP, Bachor О A, Stevanovic S. SYFPEITHI: database for MHC ligands and peptide motifs. Immunogenetics. 1999 Nov; 50(3-4): 213-9). + На даний час є багато прикладів TCD8 як у людей, так і у мишей, котрі специфічно розпізнають клітини пухлин та мають терапевтичну дію після адоптивного перенесення, в деяких випадах призводячи до повної ремісії. Однак, незважаючи на потенціал Т-клітин по знищенню пухлин, прогресуючий зріст більшості видів раку свідчить про те, що багато пухлин уникають розпізнавання + TCD8 in vivo. Хоча було виявлено, що багато пухлин є імуногенними, важко продемонструвати стимуляцію ефективної протипухлинної імунної реакції: останні факти підтверджують те, що імунізація може призвести до потужних Т-клітинних реакцій проти пухлино-асоційованих пептидів (Speiser DE, Lienard D, Rufer N, Rubio-Godoy V, Rimoldi D, Lejeune F, Krieg AM, Cerottini JC, Romero P. Rapid and strong human CD8+ Τ cell responses to vaccination with peptide, IFA, and CpG oligodeoxynucleotide 7909. J Clin Invest. 2005 Mar; 115(3):739-46. Schag K, Schmidt SM, Muller MR, Weinschenk T, Appel S, Week MM, Grunebach F, Stevanovic S, Rammensee HG, Brossart P. Identification of C-met oncogene as a broadly expressed tumor-associated antigen recognized by cytotoxic T-lymphocytes. Clin Cancer Res. 2004 Jun 1;10(11):3658-66.). Антигени, котрі розпізнаються пухлиноспецифічними цитотоксичними Т-лімфоцитами, тобто, їхні епітопи, можуть бути молекулами, одержаними з будь-яких класів білків, таких як ферменти, рецептори, транскрипційні фактори, та ін. Повний перелік пептидів, які можуть зв'язуватися з МНС-молекулами класу І чи II або елююватися з них, можна знайти на сайті www.syfpeithi.org. Крім того, пухлино-асоційовані антигени, можуть, наприклад, бути присутні тільки в клітинах пухлин як продукти генів, що мутували. Належними прикладами є МНС-ліганди класу І, що функціонують як Т-клітинні епітопи, з K-ras, BCR-abl та ген р53, що мутував. Іншим важливим класом пухлиноасоційованих антигенів є тканино-специфічні структури, такі як СТ-антигени (антигени раку сем'яни 5 ків), які експресуються в різних видах пухлин та в здоровій тканині сем'яників. Інші пухлиноасоційовані пептиди, які зв'язуються з МНСмолекулами, мають походження з генів, що існують в більшій кількості копій в ракових клітинах, в порівнянні із здоровими клітинами того ж самого органу чи тканини, або порівняно із здоровими клітинами інших тканин. Стосовно с-met, в якості прикладу, зверніться до роботи Schag K, Schmidt SM, Muller MR, Weinschenk T, Appel S, Week MM, Grunebach F, Stevanovic S, Rammensee HG, Brossart P. Identification of C-met oncogene as a broadly expressed tumor-associated antigen recognized by cytotoxic T-lymphocytes. Clin Cancer Res. 2004 Jun 1; 10(11):3658-66. Інші пухлино-асоційовані пептиди виникають з антигенів, котрі утримуються в клітинах пухлин та не виділяються з них (наприклад, білки з муцинової групи генів). Іншими джерелами можуть бути аберантні транскрипти (внаслідок зсуву рамки генетичного коду), пептиди з точок з'єднання пост-трансляційних білково-білкових взаємодій. Повний перелік антигенів, асоційованих з пухлинами, що описані у науковій літературі, можна знайти на сайті www. cancerimmunity.org. Були ідентифіковані різноманітні антигени, асоційовані з пухлинами. Крім того, проведена значна дослідницька робота по ідентифікації додаткових антигенів, асоційованих з пухлинами. Деякі групи асоційованих з пухлинами антигенів, також згадуваних в літературі як пухлиноспецифічні антигени, є тканино-специфічними. Приклади включають тирозиназу для меланоми, PSA та PSMA для раку простати та хромосомні кросовери, такі як bcr/abl в лімфомі, але не обмежуються ними. Однак, ряд ідентифікованих пухлинних антигенів зустрічається в багатьох видах пухлин, а деякі з них, такі як онкогенні білки та/або гени-супресори пухлин (огляд генів-супресорів пухлин для раку нирок наведено, наприклад, в роботі Linehan WM, Walther MM, Zbar В. The genetic basis of cancer of the kidney. J Urol. 2003 Dec;170(6 Pt 1):2163-72), котрі фактично викликають трансформаційну дію, зустрічаються практично в усіх видах пухлин. Більш детальний огляд генетичних причин раку у людей можна найти в книзі The Genetic Basis of Human Cancer by Bert Vogelstein, Kenneth W. Kinzler, 2002). Наприклад, звичайні білки клітин, контролюючі ріст та диференціацію клітин, такі як р53 (що є прикладом генасупресора пухлин), ras, c-met, myc, pRB, VHL та HER-2/neu, можуть накопичувати мутації, що призводить до посилення експресії цих генних продуктів, таким чином роблячи їх онкогенними (McCartey et al. Cancer Research 1998 15:58 2601-5; Disis et al. Ciba Found. Symp. 1994 187:198-211). Ці білки-мутанти можуть бути мішенню пухлиноспецифічної імунної реакції при багатьох видах ракових захворювань. Раково-ембріональний антиген-незрілий рецептор ламініну (OFA/iLR) є широко вираженим в багатьох видах пухлин у людей, включаючи гематологічні злоякісні новоутворення (Rohrer JW, Barsoum AL, Coggin JH Jr. The development of a new universal tumor rejection antigen expressed on human and rodent cancers for vaccination, prevention of 97092 6 cancer, and anti-tumor therapy. Mod Asp Immunobiol. 2001; 5: 191-195. Barsoum AL, Rohrer JW, Coggin JH. 37kDa oncofoetal antigen is an autoimmunogenic homologue of the 37kDa laminin receptor precursor. Cell Моl Biol Lett. 2000; 19: 5535-5542. Castronovo V. Laminin receptors and laminin-binding proteins during tumor invasion and metastasis. Invasion Metas. 1993; 13: 1-30. Coggin JH Jr, Barsoum, AL, Rohrer JW. Tumors express both unique TSTA and crossprotective 44 kDa oncofetal antigen. Immunol Today. 1998; 19, 405-408. Coggin JH Jr, Barsoum AL, Rohrer JW. 37 kilo Dalton oncofetal antigen protein and immature laminin receptor protein are identical, universal T-cell inducing immunogens on primary rodent and human cancers. Anticancer Res. 1999; 19, 5535-5542), але вони відсутні в нормальних диференційованих тканинах дорослих людей. OFA-iLRP може, зокрема, розпізнаватися Т- і Влімфоцитами, що робить його привабливою молекулою-мішенню для методів вакцинації стосовно декількох форм раку. При використанні дендритних клітин (ДК), в які була введена РНК, кодована OFA-iLR, пухлино-специфічні реакції Т-клітин проти гемопоетичних клітин-мішеней можуть утворюватися як in vitro, так і in vivo (Siegel S, Wagner A, Kabelitz D et al. Coggin, J.Jr., Barsoum, Α., Rohrer, J., Schmitz, N., Zeis, M. Induction of cytotoxic Τ cell responses against the oncofoetal antigen-immature laminin receptor for the treatment of hematological malignancies. Blood 2003; 102, 4416-4423.). В патенті US 6,753,314 описується очищений білковий комплекс, який вміщує перший поліпептид та другий поліпептид, причому зазначений комплекс включає амінокислотні послідовності першого поліпептиду (SMI1, Ід. номер послідовності: 359) та другого поліпептиду (BAS1, Ід. номер послідовності: 518), що визначається як ProPair 267a-267b. В патенті US 4,861,710 розкривається клон, який вміщує клон рекомбінантної кДНК для кодування рецептора ламініну на клітинній поверхні, а також відповідні проби. Для того, щоб білки розпізнавалися цитотоксичними Т-лімфоцитами (ЦТЛ) як пухлиноспецифічні антигени, та з метою використання в лікуванні, треба дотримуватися деяких попередніх умов. Антиген має бути синтезований, головним чином, клітинами пухлин, а не нормальними здоровими тканинами, чи він має бути присутній в здорових клітинах в достатньо невеликих кількостях. Крім того, бажано, щоб відповідний антиген був не тільки присутній в одному виді пухлин, але також знаходився у високих концентраціях (наприклад, кількість копій на клітину). Істотною є присутність епітопів в амінокислотній послідовності антигену, оскільки такий пептид ("імуногенний пептид"), котрий одержується з асоційованого з пухлиною антигену, повинен призводити до Т-клітинної реакції in vitro чи in vivo. До цього часу, були описані різноманітні стратегії щодо включення антигенів до шляхів перетворення класу II. Можна інкубувати антигенпрезентуючі клітини (АПК) з відповідним антигеном, що представляє інтерес, для його прийняття та обробки (Chaux, P., Vantomme, V., Stroobant, V., 7 Thielemans, К., Corthals, J., Luiten, R., Eggermont, A. M., Boon, T. & van der, B. P. (1999) J. Exp. Med. 189, 767-778). Інші стратегії використовують гібридні білки, які вміщують цільові послідовності для лізосом. Такі гібридні білки, експресовані в АПК, направляють антигени до ділянки обробки класу II (Marks, Μ. S., Roche, P. Α., van Donselaar, E., Woodruff, L., Peters, P. J. & Bonifacino, J. S. (1995) J. Cell Вiol. 131, 351-369, Rodriguez, F., Harkins, S., Redwine, J. M., de Pereda, J. M. & Whitton, J. L. (2001) J. Virol. 75, 10421-10430). Крім того, були розроблені спеціальні ліпосомні композиції для доставки пептидів та інших активних фармацевтичних інгредієнтів до пАПК ((Walter S, Herrgen L, Schoor О, Jung G, Wernet D, Buhring HJ, Rammensee HG, Stevanovic S. Cutting edge: predetermined avidity of human CD8 Τ cells expanded on calibrated MHC/anti-CD28-coated microspheres. J Immunol. 2003 Nov 15; 171 (10):4974-8.). Іншим способом вибору є зовнішнє завантаження МНС-молекул до пАПК in vitro або in vivo. В цьому випадку, АПК з надлишком пептидів інкубуються у середовищі клітинної культури, призводячи до конкуренції за зв'язування з МНС-молекул ами на поверхні АПК. Т-хелпери відіграють важливу роль в регуляції ефекторної функції ЦТЛ в протипухлинному імунітеті. Епітопи Т-хелперів, що запускають реакцію цих клітин типу ТЫ, підтримують ефекторні функції + CD8 Т-клітин- кілерів, котрі включають цитотоксичні функції, спрямовані проти клітин пухлин, що експресують комплекси пухлино-асоційованого пептиду/МНС на своїх клітинних поверхнях. Таким способом, пептидні епітопи Т-хелперів, самостійно чи в комбінації з іншими пухлино-асоційованими, можуть служити активними фармацевтичними інгредієнтами композицій вакцин, які стимулюють протипухлинні імунні реакції. Основна задача розробки протипухлинної вакцини полягає, таким чином, в ідентифікації та характеристиці нових асоційованих з пухлинами антигенів та епітопів імуногенних Т-хелперів, які + походять з них, що можуть розпізнаватися CD4 ЦТЛ. Отже, задача цього винаходу полягає в знаходженні нових амінокислотних послідовностей для таких пептидів, що мають здатність зв'язуватися з молекулою головного комплексу гістосумісності людини (МНС) класу І та викликати Т-клітинні реакції проти клітин, що несуть на своїй поверхні пептиди в поєднанні з МНС-молекулами. Відповідно до цього винаходу, така задача вирішується визначенням пухлино-асоційованого пептиду, що обирається з групи пептидів, яка вміщує, принаймні, послідовність відповідно до послідовності з номером 1 (SEQ ID No. 1) та номером 2 (SEQ ID No. 2) доданого переліку, де пептид має здатність зв'язуватися з молекулою головного комплексу гістосумісності людини (МНС) класу І, що вміщує HLA-алель, виражену найчастіше в білій расі, та HLA-A2 (включаючи підтипи HLA-A2, такі як HLA-A*0201), але не обмежується ними. Крім того, цей винахід відноситься до двох нових пептидних послідовностей, одержаних з молекул HLA І класу раково-ембріонального антигеннезрілого рецептору ламініну, що можуть використовуватися у композиціях вакцин для викликання 97092 8 протипухлинних імунних реакцій. Нові пептидні послідовності були ідентифіковані із використанням нового та загальноприйнятого комбінованого підходу для ідентифікації невідомих HLA-лігандів класу І, модифікованих природним шляхом, визначених як антигени, наприклад, асоційовані з пухлинами антигени. Тобто, автори винаходу ідентифікували два окремі HLA-A* 0201-специфічні Тклітинні епітопи, які мають походження з OFA/iLRбілку, здатні індукувати специфічну реактивність Тклітин проти клітин пухлин у людей, включаючи різні гематологічні злоякісні новоутворення, але не обмежуючись ними. Перший аспект винаходу пропонує пептид, який вміщує амінокислотну послідовність, згідно із будь-яким ідентифікаційним номером (SEQ ID No. 1 або SEQ ID No. 2), чи її варіант, за умови, що пептид не є неушкодженим поліпептидом людини, з якого одержується амінокислотна послідовність (тобто, з раково-ембріонального антиген-незрілого рецепторного білка ламініну (OFA/iLRP); номер за каталогом див. в доданій таблиці 1 нижче). Як описується нижче, обидва пептиди, що утворюють базис цього винаходу, представлені клітинами, що несуть МНС класу І. Отже, обидва конкретні пептиди, а також інші пептиди, які вміщують таку ж послідовність (наприклад, похідні пептиди), будуть, найбільш вірогідно, викликати специфічну Т-клітинну реакцію, хоча та міра, в якій ця реакція буде індукуватися, може варіюватися в залежності від конкретного пептиду. Різниця, наприклад, може бути викликана мутаціями в зазначених пептидах (див. нижче). Фахівцю, який має значний досвід в цій галузі, добре відомі методи, що можуть бути застосовані для визначення міри індукування реакції окремим пептидом, зокрема, із посиланням на наведені тут приклади та відповідні літературні джерела. По суті, пептид за цим винаходом переважно складається з амінокислотної послідовності, відповідно до ідентифікаційного номеру 1 чи 2 (SEQ ID No. 1 або SEQ ID No. 2), чи її варіанту. Вираз "складається, по суті, з" буде означати, що пептид, згідно із цим винаходом, на додаток до послідовності за номерами SEQ ID No. 1 або SEQ ID No. 2, чи її варіанту, вміщує додаткові N- та/або С-термінальні ділянки амінокислот, які не обов'язково формують частину пептиду, що функціонує як ключова послідовність пептиду, вміщуючи модель зв'язку, та як епітоп імуногенного Т-хелпера. Однак, ці ділянки можуть бути важливими для забезпечення ефективного введення пептиду, відповідно до цього винаходу, в клітини. Під терміном "варіант" даної амінокислотної послідовності автори винаходу мають на увазі, що бокові ланцюжки, наприклад, одного чи двох амінокислотних залишків змінюються (наприклад, шляхом заміни їх боковим ланцюжком іншого природно існуючого амінокислотного залишку чи якимось іншим боковим ланцюжком) таким чином, що пептид все ще здатний зв'язуватися з молекулою HLA, по суті, в такий же спосіб, як і пептид, що складається з даної амінокислотної послідовності. Наприклад, пептид може бути модифікований так, що він буде якнайменше утримувати, чи навіть 9 поліпшувати, здатність взаємодіяти та зв'язуватися з прийнятною молекулою МНС, такою як HLA-A, та якнайменше утримувати, чи навіть поліпшувати, здатність утворювати активований ЦТЛ, який може розпізнавати та знищувати клітини, котрі експресують поліпептид, що вміщує амінокислотну послідовність, як визначено в аспектах винаходу. Як можна дізнатися з бази даних, описаної далі, окремі позиції HLA-A-зв'язуючих пептидів є, як правило, доменними залишками, формуючими ключову послідовність, що відповідає за зв'язок у порожнини зв'язування HLA. Ті амінокислотні залишки, що не суттєвими для взаємодії з Т-клітинним рецептором, можуть бути модифіковані шляхом заміни іншою амінокислотою, введення якої не має суттєвого впливу на реактивність Т-клітин та не виключає зв'язування із відповідним МНС. Отже, за винятком зазначеної умови, пептид винаходу може бути будь-яким пептидом (до цього терміну автори винаходу відносять олігопептид чи поліпептид), котрий включає амінокислотні послідовності або їхню частину чи варіант, що надається. Стосовно МНС-презентуючих пептидів (класу II) відомо, що ці пептиди складаються з "ключової послідовності", яка має певний HLA-специфічний амінокислотний фрагмент та додаткові N- та/або С-термінальні подовження, які не втручаються у функцію ключової послідовності (тобто, вважаються не релевантними до взаємодії пептиду і Тклітини). N- та/або С-термінальні подовження можуть мати довжину від 1 до 10 амінокислот, відповідно. Отже, переважний пептид цього винаходу із представленням МНС класу II in vivo демонструє загальну довжину від 9 до ЗО амінокислот. Цей пептид може використовуватись безпосередньо, щоб завантажувати МНС-молекули класу II, або ж послідовність може клонуватись у вектори, згідно із наведеним нижче описанням. Оскільки ці пептиди формують кінцевий продукт обробки більш крупних пептидів в межах клітини, також можуть використовуватись довші пептиди. Пептиди винаходу можуть мати будь-який розмір, але як правило вони можуть бути меншими ніж 100 000 за молекулярною вагою, переважно меншими 50 000, ще більш переважно меншими 10 000 та, зазвичай, приблизно 5 000. Що стосується кількості амінокислотних залишків, пептиди винаходу можуть мати менше 1000 залишків, переважно менше, ніж 500 залишків, та ще більш переважно менше 100 залишків. В іншому аспекті цього винаходу, подібно до ситуації, роз'ясненої вище для МНС-молекул класу II, пептиди цього винаходу (хоча і відносяться головним чином до МНС класу І) можуть використовуватись для викликання специфічної реакції МНС класу II, оскільки ILR1 та ILR2 можуть демонструвати одночасні ключові або часткові послідовності HLA-молекул класу II (що відповідають окремим HLA-алелям класу II, як показано в наступних таблицях). Як зазначено вище, N- та/або Стермінальні подовження можуть мати довжину від 1 до 10 амінокислот, відповідно. Тобто, переважний пептид цього винаходу демонструє загальну довжину від 9 до 30 амінокислот. Цей пептид може 97092 10 використовуватись безпосередньо для завантаження МНС-молекул класу II, або послідовність може клонуватись у вектори, згідно із наведеним нижче описанням. Оскільки ці пептиди формують кінцевий продукт обробки більш крупних пептидів в межах клітини, також можуть використовуватися довші пептиди. Пептиди цього втілення винаходу можуть мати будь-який розмір, але, як правило, вони можуть бути меншими ніж 100 000 за молекулярною вагою, переважно меншими 50 000, більш переважно меншими 10 000 та зазвичай приблизно 5 000. Що стосується кількості амінокислотних залишків, пептиди винаходу можуть мати менше, ніж 1000 залишків, переважно менше, ніж 500 залишків, та ще більш переважно - менше 100 залишків. Таблиця A ILR1-"Ключові послідовності", що мають окремий HLA-специфічний амінокислотний фрагмент для HLA-молекул класу II. Відповідність амінокислот відображена курсивом. Прогнози були зроблені із використанням комп'ютерних програм РАРrоС (http://www.uni-tuebingen.de/uni/kxi/) та SYFPEITHY (http ://www. syfpeithi. de). 11 97092 Таблиця B ІLR2-"Ключові послідовності", що мають окремий HLA-специфічний амінокислотний фрагмент для HLA-молекул класу II. Відповідність амінокислот відображена курсивом. Прогнози були зроблені із використанням комп'ютерних програм РАРrоС (http://www.uni-tuebingen.de/uni/kxi/) та SYFPEITHY (http://www.syfpeithi.de). Якщо пептид, що має більше, ніж приблизно 12 амінокислотних залишків, використовується безпосередньо для зв'язування МНС-молекули, бажано, щоб залишки, які розташовуються збоку ключової HLA-зв'язувальної ділянки, не мали значного впливу на здатність пептиду зв'язуватися, зокрема, з порожниною МНС-молекули або презентувати пептид ЦТЛ. Однак, як вже зазначалося вище, перевага надається використанню більш крупних пептидів, особливо, коли вони кодуються полінуклеотидом, оскільки ці більш крупні пептиди можуть розділятися на частини відповідними антиген-презентуючими клітинами. Термін "пептид" трактується авторами винаходу як такий, що включає не тільки молекули, в яких амінокислотні залишки з'єднуються пептидними зв'язками (-CO-NH-), але також молекули, де пептидний зв'язок реверсується. Такі ретро-інверсивні пептидні міметики можуть вироблятися за методами, відомими в даній галузі, наприклад, описаними в роботі Meziere et al (1997) J. Immunol. 159, 3230-3237, яка включена в даний документ шляхом посилання. Цей підхід включає формування псевдо-пептидів, які включають зміни із залученням основи, а не орієнтації бокових ланцюгів. Автори Meziere et al (1997) показали, що, якнайменш, для реакцій клітин МНС класу II і Т-хелперів такі 12 псевдо-пептиди є корисними. Ретро-інверсивні пептиди, які вміщують зв'язки NH-CO замість пептидних зв'язків CO-NH, набагато більш стійкі до протеолізу. Як правило, пептид винаходу - це пептид, котрий при експресії антиген-презентуючою клітиною може бути оброблений так, що створюється фрагмент, який здатний зв'язатися з відповідною молекулою МНС та може бути представлений відповідною клітиною і викликати належну Т-клітинну реакцію. Буде братися до уваги той факт, що фрагмент, який створюється з пептиду, також може бути пептидом винаходу. Прийнятним є те, що пептид винаходу вміщує частину, котра включає дану амінокислотну послідовність або її частину чи варіант, та додаткову частину, яка надає якусь бажану властивість. Наприклад, додаткова частина може включати іншій епітоп Т-клітини (незалежно від того, чи походить він з того ж поліпептиду, що й перша частина епітопа Т-клітини), або вона може включати білок-носій чи пептид. Отже, в одному з втілень винаходу пептид являє собою укорочений білок людини чи гібридний білок або фрагмент білка та іншої поліпептидної частини, за умови, що частина, яка включає білок людини, вмішує одну чи декілька амінокислотних послідовностей винаходу. В особливо переважному втіленні винаходу, пептид включає амінокислотну послідовність винаходу та, якнайменш, один додатковий епітоп Тклітини, причому додатковий епітоп Т-клітини здатний полегшувати викликання Т-клітинної реакції, спрямованої на тип пухлини, що експресує пухлино-асоційований антиген. Таким чином, пептиди винаходу включають так звані "нанизані" поліпептиди, котрі також можуть використовуватися як вакцини. З наведених нижче даних зрозуміло, що в деяких випадках застосування пептиди винаходу можуть використовуватись безпосередньо (тобто, вони не утворюються шляхом експресії полінуклеотиду в клітині пацієнта чи в клітині, що вводиться пацієнту); в таких випадках бажано, щоб пептид мав менше, ніж 100 чи 50 залишків. Переважний пептид цього винаходу має загальну довжину від 9 до 30 амінокислот. Бажано, щоб пептиди винаходу мали здатність зв'язуватись з HLA-A2. Зокрема, переважним є те, щоб пептиди зв'язувалися селективно з HLAA*0201. Під терміном "аберантно експресовані" автори винаходу мають на увазі, що поліпептид надмірно експресований, в порівнянні з нормальними рівнями експресії, або що ген є мовчазним у тканині, з якої походить пухлина, але він експресується в пухлині. Термін "надмірно експресований" трактується авторами винаходу таким чином: поліпептид присутній на рівні, що принаймні в 1.2 рази перевищує рівень, який спостерігається в нормальній тканині; та переважно, принаймні, в 2 рази та ще більш переважно, принаймні, в 5 або 10 разів більше рівня, присутнього в нормальній тканині. Пептиди (принаймні ті, що вміщують пептидні зв'язки між амінокислотними залишками) можуть 13 бути синтезовані за допомогою Fmoc-поліамідного способу синтезу пептидів твердої фази, як розкривається в роботі Lu et al (1981) J. Org. Chem. 46,3433 та посиланнях на літературні джерела, наведених в ній. Тимчасовий захист N-аміно-групи забезпечується 9фторенілметилоксикарбонільною (Fmoc) групою. Повторне розщеплювання цієї високо-лабільної основної захисної групи виконується із використанням 20 % піперидину в N, N-діметилформаміді. Функціональність бокових ланцюгів може захищатися у виді їхніх простих бутилових ефірів (у випадку серинового треоніну і тирозину), складних бутилових ефірів (у випадку глютамінової кислоти та аспарагінової кислоти), бутилоксикарбонільних похідних (у випадку лізину та гістидину), тритилового похідного (у випадку цистеїну) та 4-метокси2,3,6-тріметилбензолсульфонільного похідного (у випадку аргініну). Коли глютамін чи аспарагін є Стермінальними залишками, використовується 4,4'діметоксибензогідрильна група для захисту функціональних амідних груп бокових ланцюгів. В якості твердофазної підкладки використовують полідиметил-акриламідний полімер, що складається з трьох мономерів, диметилакриламіду (основний мономер), бісакрилоїлетилендіаміну (крос-лінкер) та метилового ефіру акрилоїлсаркозину (функціональна речовина). Використовувана речовина пептидно-полімерного зв'язку, що розщеплюється, це кислотно-лабільна похідна 4- гідроксиметилфеноксиоцтової кислоти. Усі амінокислотні похідні додаються у виді їхніх сформованих симетричних ангідридних похідних, за винятком аспарагіну та глютаміну, що додаються за допомогою реверсованої процедури зв'язку, де посередником виступає Ν,Ν-діциклогексилкарбодиімід/1гідроксибензотриазол. Контроль усіх реакцій зв'язування та зняття захисту ведеться із використанням нінгідринового, тринітробензолсульфоново-кислотного чи ізотинового тестів. Після завершення синтезу пептиди звільняються від полімерної підкладки з одночасним видаленням захисних груп бокових ланцюгів шляхом обробки 95% трифтороцтовою кислотою, яка вміщує 50 % суміші поглиначів. Поглиначі, які зазвичай використовуються, - це етандітіол, фенол, анізол та вода; точний вибір залежить від амінокислот-складників пептиду, який синтезується. Крім того, можливе поєднання твердофазного та рідиннофазного синтезу пептидів (див., наприклад, роботу Bruckdorfer Τ, Marder О, Albericio F. From production of peptides in milligram amounts for research to multi-tons quantities for drugs of the future. Curr Pharm Biotechnol. 2004 Feb;5(1):29-43 та посилання, наведені в ній). Трифтороцтова кислота (ТФК) видаляється шляхом випарювання у вакуумі, з подальшим розтиранням в порошок з діетиловим ефіром, з одержанням первинного пептиду. Як альтернативний варіант, можна використовувати солеобмінник (ТФК -> оцтова кислота) до ліофілізації. Будь-які присутні поглиначі видаляються простою процедурою екстракції, яка після ліофілізації водної фази дає первинний пептид, вільний від поглиначів. Реактиви для пептидного синтезу, взагалі, можна 97092 14 одержати в компанії Calbiochem-Novabiochem (UK) Ltd, Nottingham NG7 2QJ, UK. Очищення може виконуватися із використанням будь-кого одного чи кількох методів, таких як, гель-хроматографія, іонообмінна хроматографія, хроматографія гідрофобної взаємодії та (зазвичай) зворотно-фазна високоефективна рідинна хроматографія із використанням градієнтного розділення ацетонітрил/вода. Аналіз пептидів може виконуватися за допомогою тонкошарової хроматографії, зворотно-фазної високоефективної рідинної хроматографії, амінокислотного аналізу після гідролізу кислот, розшифровки послідовності по Едману та масспектрометричного аналізу із бомбардуванням прискореними атомами (БПА), а також масспектрометричного аналізу MALDI та ESI-Q-TOF. Ще один аспект винаходу дає нуклеїнову кислоту (наприклад, полінуклеотид), що кодує пептид винаходу. Полінуклеотидом може бути ДНК, кДНК, ПНК, СНК, РНК чи їхні комбінації, та вони можуть вміщувати або не вміщувати інтрони, за умови, що полінуклеотид кодує пептид. Без сумніву, тільки ті пептиди, що вміщують природно існуючі амінокислотні залишки, з'єднані природними пептидними зв'язками, кодуються полінуклеотидом. Інший аспект винаходу пропонує вектор експресії, здатний експресувати поліпептид, відповідно до винаходу. Були розроблені різноманітні методи для оперативного зв'язку полінуклеотидів, зокрема, ДНК, з векторами, наприклад, за допомогою комплементарних когезійних сайтів термінації. Наприклад, комплементарні гомополімерні ділянки можуть додаватися до ДНК-сегменту для введення у векторну ДНК. Вектор та ДНК-сегмент потім з'єднуються шляхом водневого зв'язку між комплементарними гомополімерними кінцями для формування рекомбінантних молекул ДНК. Синтетичні лінкери, які вмішують один чи кілька рестрикційних сайтів, забезпечують альтернативний метод з'єднання ДНК-сегменту з векторами. ДНК-сегмент, сформований рестрикційним гідролізом ендонуклеази, як описувалось раніше, обробляється ДНК-полімеразою бактеріофага Т4 або ДНК-полімеразою І зі штаму E.coli, ферментів, що видаляють виступаючі, 3'-однониткові сайти за допомогою своїх 3'-5'-екзонуклеотичних функцій та заповнюють заглиблені 3'-кінці завдяки процесам полімеризації. Комбінація цих функцій, таким чином, генерує ДНК-сегменти з тупими кінцями. Сегменти з тупими кінцями потім інкубуються з великим молярним надлишком молекул лінкерів в присутності ферменту, що здатний каталізувати зшивання ДНКмолекул з тупими кінцями, таких як ДНК-лігаза бактеріофагу Т4. Таким чином, продуктами реакції є ДНК-сегменти з послідовностями полімерних лінкерів на кінцях. Ці ДНК-сегменти потім розщеплюються відповідним рестрикційним ферментом та зшиваються з вектором експресії, що був гідролізований ферментом, який утворює сайти термінації, сумісні з сайтами ДНК- сегмента. Синтетичні лінкери, які вміщують ряд рестрикційних сайтів ендонуклеази, доступні для прид 15 бання в ряді компаній, включаючи International Biotechnologies Inc, Нью Хейвен, Цинцинаті, США. Бажаним способом модифікації ДНК, що кодує поліпептид винаходу, є використання ланцюгової полімеразної реакції, як розкривається в роботі Saiki et al (1988) Science 239,487-491. Цей метод може застосовуватись для введення ДНК у відповідний вектор, наприклад, шляхом створення належних рестрикційних сайтів, чи для модифікації ДНК іншими прийнятними шляхами, які відомі в цій галузі. В цьому методі до ферментативно примноженої ДНК з обох сторін примикають два праймери, котрі самі по собі включаються у примножену ДНК. Зазначені праймери можуть вміщувати сайти розпізнавання рестрикційних ендонуклеаз, що можна використовувати для клонування векторів експресії за методами, відомими в цій галузі. ДНК (або у випадку ретровірусних векторів, РНК) потім експресується в належному організмі хазяїна для утворення поліпептиду, що становить сполуку цього винаходу. Таким чином, ДНК, що кодує поліпептид, який є сполукою винаходу, може використовуватися за відомими методами, відповідним чином модифікованими згідно із доктринами, вміщеними тут, для створення вектору експресії, що згодом використовується для трансформації відповідної клітини хазяїна з метою експресії та формування поліпептиду винаходу. Такі методи розкриті в патентах США: № 4,440,859, виданий 3 квітня 1984 р. авторам Rutter et al, № 4,530,901, виданий 23 липня 1985 p. автору Weissman, № 4,582,800, виданий 15 квітня 1986 p. автору Crowl, № 4,677,063, виданий 30 червня 1987 р. авторам Mark et al, № 4,678,751, виданий 7 липня 1987 p. автору Goeddel, № 4,704,362, виданий 3 листопада 1987 р. авторам Itakura et al, № 4,710,463, виданий 1 грудня 1987 p. автору Murray, № 4,757,006, виданий 12 липня 1988 р. авторам Toole, Jr. et al, № 4,766,075, виданий 23 серпня 1988 p. авторам Goeddel et al та № 4,810,648, виданий 7 березня 1989 p. автору Stalker, всі з яких включені в цей документ шляхом посилань. ДНК (або у випадку ретровірусних векторів, РНК), що кодує поліпептид, який є сполукою винаходу, може з'єднуватись з різними іншими ДНКпослідовностями для введення в належний організм хазяїна. Супутня ДНК буде залежати від характеру хазяїна, способу введення ДНК до хазяїна та від того факту, чи бажане епісомне утримання або інтеграція. В цілому, ДНК вводиться у вектор експресії, такий як плазміда, в належній орієнтації та з відповідною рамкою зчитування для експресії. При необхідності, ДНК може зв'язуватися з належними нуклеотидними послідовностями транскрипційного і трансляційного регуляторного контролю, що розпізнаються бажаним хазяїном, хоча такі контрольні елементи взагалі є доступними у векторі експресії. Потім вектор вводиться хазяїну із використанням стандартних методик. В цілому, не всі організмихазяїни будуть трансформуватися вектором. Таким чином, виникає необхідність обрати трансформовані клітини хазяїна. Одна з методик вибору включає введення у вектор експресії ДНКпослідовності з будь-якими необхідними контроль 97092 16 ними елементами, що кодує специфічну рису у трансформованій клітині, наприклад, резистентність до антибіотиків. Як альтернативний варіант, ген для такої специфічної риси може бути на іншому векторі, котрий використовується для ко-трансформації бажаної клітини хазяїна. Клітини хазяїна, трансформовані рекомбінантною ДНК винаходу, потім культивуються протягом достатнього часу в належних умовах, які відомі досвідченим фахівцям, з урахуванням розкритих в цьому документі доктрин, щоб дозволити експресію поліпептиду, котрий згодом може бути виділений. Існує багато систем експресії, включаючи бактерії (наприклад, Е. соlі та Bacillus subtilis), дріжджі (наприклад, Saccharomyces cerevisiae), нитковидні грибки (наприклад, Aspergillus), клітини рослин, тварин і комах. Переважною системою можуть бути клітини Awells. Промотором є елемент контролю експресії, що сформований ДНК-послідовністю, яка забезпечує зв'язування РНК-полімерази і транскрипцію. Промоторні послідовності, порівнювані із зразковими бактеріальними хазяїнами, як правило, знаходяться у векторах плазмід, які вміщують зручні сайти рестрикції для введення ДНК-сегмента цього винаходу. Типовими векторними плазмідами прокаріотів є pUC18, pUC19, pBR322 та pBR329, які можна придбати в Biorad Laboratories, (Річмонд, Каліфорнія, США) та рТrс99А і рKK223-3, які продає компанія Pharmacia, Пескатавей, Нью-Джерсі, США. Типовою векторною плазмідою клітин ссавців є pSVL, що є в наявності в компанії Pharmacia, Пескатавей, Нью-Джерсі, США. Цей вектор використовує останній промотор SV40, для викликання експресії клонованих генів, і найвищий рівень експресії спостерігається в Т-антиген-утворюючих клітинах, таких як клітини COS-1.. Прикладом індукованого вектора експресії у ссавців є pMSG, який також можна придбати в Pharmacia. Цей вектор використовує індукований глюкокортикоїдом промотор вірусу пухлини грудей у мишей з довгим термінальним повтором для викликання експресії клонованого гена. Прийнятними плазмідними векторами дріжджів є pRS403-406 та pRS413-416, які доступні для придбання в Stratagene Cloning Systems, Ла Джолла, Каліфорнія 92037, США. Плазміди pRS403, pRS404, pRS405 та pRS406 - це дріжджові інтегровані плазміди (Ylp), що включають специфічні маркери дріжджів HIS3, TRP1, LEU2 та URA3. Плазміди pRS413-416 - це дріжджові центромерні плазміди (Yep). Існують також інші вектори та системи експресії, для використання з клітинами різних хазяїв. Цей винахід також відноситься до клітини хазяїна, що трансформується полінуклеотидним вектором даного винаходу. Клітина хазяїна може бути прокаріотом чи еукаріотом. Бактеріальні клітини можуть бути переважно прокаріотичними клітинами хазяїна, в деяких обставинах це типові штами Е. соlі, такі як, наприклад, штами DH5 Е. соlі, які можна придбати в Bethesda Research Laboratories Inc., Бетесда, Меріленд, США, та RR1, які доступні 17 для придбання в American Type Culture Collection (АТСС), Роквілль, Меріленд, США (№ АТСС 31343). Переважні еукаріотичні клітини хазяїна включають клітини дріжджів, комах та ссавців, переважно клітини хребетних, такі як клітини мишей, пацюків, мавп чи фібробластичні та ниркові клітинні лінії людини. Дріжджові клітини хазяїна включають YPH499, YPH500 та YPH501, які доступні для придбання в Stratagene Cloning Systems, Ла Джолла, Каліфорнія 92037, США. Переважні клітини хазяїна у ссавців включають клітини яєчника китайського хом'ячка (СНО), що можна придбати в АТСС як CCL61; клітини ембріона NIH швейцарської миші (NIH/3T3), які можна придбати в АТСС як CRL 1658; клітини COS-1, виділені з нирок мавпи, що є в наявності для продажу в АТСС як CRL 1650, та клітини 293, які представляють клітини нирок ембріону людини. Переважними клітинами комах є клітини Sf9, в які можуть вводитись вектори експресії бакуловірусу. Трансформація клітин хазяїна ДНКконструкцією цього винаходу виконується за допомогою добре відомих методів, що, як правило, залежать від типу використовуваного вектору. Трансформація прокаріотичних клітин хазяїна описана, наприклад, в роботах Cohen et al (1972) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 69,2110 та Sambrook et al (1989) Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY. Трансформація дріжджових клітин описана в роботі Sherman et al (1986) Methods In Yeast Genetics, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, NY. Метод Бегса - Beggs (1978) Nature 275,104-109 також є прийнятним. Стосовно клітин хребетних, реактиви, які використовуються для трансфекції таких клітин, наприклад, фосфат кальцію та DEAEдекстран чи ліпосомні композиції, можна придбати в компаніях Stratagene Cloning Systems або Life Technologies Inc., Гейтерсберг, Меріленд, 20877, США. Електропорація також прийнятна для трансформації та/або трансфекції клітин і є добре відомим методом трансформації дріжджових клітин, бактеріальних клітин, клітин комах та хребетних. Успішно трансформовані клітини, тобто, клітини, які вміщують ДНК-конструкцію цього винаходу, можна ідентифікувати за допомогою добре відомих методик. Наприклад, клітини, одержані в результаті введення конструкції експресії цього винаходу, можуть вирощуватись з утворенням поліпептиду винаходу. Клітини можуть збиратись та лізуватися із дослідженням вмісту ДНК на присутність ДНК за методом, описаним в роботі Southern (1975) J. Моl. Віоl. 98,503 чи Berent et al (1985) Biotech. 3,208. Альтернативно, присутність білку в надосадовій рідині може визначатися із використанням антитіл, як описано нижче. На додаток до прямого визначення присутності рекомбінантної ДНК, успішна трансформація може підтверджуватися добре відомими імунологічними методами, коли рекомбінантна ДНК здатна спрямовувати експресію білка. Наприклад, клітини, успішно трансформовані вектором експресії, утворюють білки, які демонструють належну антигенність. Зразки клітин з вірогідною трансформацією збираються та досліджуються на білок за допомо 97092 18 гою належних антитіл. Отже, на додаток до самих трансформованих клітин хазяїна, цей винахід також передбачає культуру таких клітин, переважно моноклональну (клонально гомогенну) культуру, чи культуру, яка виділяється з моноклональної культури у живильному середовищі. Далі роз'яснюється, що певні клітини хазяїна, згідно із винаходом, можуть застосовуватись у синтезі пептидів винаходу, наприклад, бактеріальні, дріжджові клітини та клітини комах. Однак, в ряді терапевтичних методів можуть бути прийнятними інші клітини хазяїна. Наприклад, антигенпрезентуючі клітини, такі як дендритні клітини, можуть з успіхом використовуватись для експресування пептидів винаходу, за умови, що ці пептиди можуть надходити у відповідні МНС-молекули. Інший аспект винаходу пропонує метод створення пептиду для внутрішньовенного (і. ν.) введення, підшкірного (s. с.) введення, інтрадермального (і. d.) введення, внутрішньочеревного (і. р.) введення, внутрішньом'язового (і. т.) введення. Переважні способи введення пептиду - це s. с., і. d., і. p., і. m. та і. ν. Переважними способами введення ДНК є і. d., і. m., s. с., і. p. та і. ν. Можуть вводитись дози від 1 до 500 мг пептиду чи ДНК. Ще один аспект винаходу пропонує метод знищення клітин-мішеней у пацієнта, коли клітинимішені експресують поліпептид, який вміщує амінокислотну послідовність винаходу, і цей метод передбачає введення пацієнту ефективної кількості пептиду, згідно із винаходом, чи ефективної кількості полінуклеотиду або вектору експресії, що кодує даний пептид, причому кількість цього пептиду або полінуклеотиду чи вектору експресії є ефективною для стимуляції імунної реакції проти клітини-мішені у зазначеного пацієнта. Клітинамішень - це, як правило, клітина пухлини чи ракова клітина, зокрема, уражена клітина при лейкемії чи клітина лімфоми. Пептид або нуклеїнова кислота, що кодує пептид, являє собою протипухлинну чи протиракову вакцину. Вона може вводитись безпосередньо пацієнту в уражений орган, або системно, чи застосовуватись ex vivo до клітин, виділених з пацієнта чи клітинної лінії людини, котрі згодом вводяться пацієнту, чи використовуватись in vitro для обирання субпопуляції з імунних клітин, які виділяються з пацієнта і потім знов вводяться йому. Якщо нуклеїнова кислота вводиться у клітини in vitro, вона може бути корисна для трансфекції клітин, з метою ко-експресії імуно-стимулюючих цитокінів, таких, як інтерлейкін-2. Пептид може бути, по суті, чистим чи комбінованим з імуностимулюючим ад'ювантом, таким як Detox, або може використовуватись в комбінації з імуностимулюючими цитокінами чи вводитись з належною системою доставки, наприклад, ліпосомами. Пептид також може з'єднуватись з належним носієм, таким як гемоцианін лімфи равлика (KLH) або маннан (див. WO 95/18145 та Longenecker et al (1993) Ann. NY Acad. Sci. 690,276-291). Пептид також може бути міченим, або бути гібридним білком чи гібридною молекулою. Очікується, що пептиди, послідовність яких дається в цьому винахо+ ду, стимулюють CD8 ЦТЛ. Однак, стимуляція 19 більш ефективна у присутності підтримки, яка на+ дається CD4 Т-клітинами. Отже, гібридний партнер або частини гібридної молекули належним + чином утворюють епітопи, які стимулюють CD4 Т+ клітини. СБ4 -стимулюючі епітопи добре відомі в цій галузі та включають епітопи, ідентифіковані в анатоксині правця. Полінуклеотид може бути, по суті, чистим, або включеним в належний вектор чи в систему доставки. Відповідні вектори та системи доставки включають вірусні системи, основані на аденовірусі, вірусі коров'ячої віспи, ретровірусах, вірусі герпесу, адено-асоційованому вірусі чи гібридах, які включають елементи більш, ніж одного вірусу. Невірусні системи доставки включають катіонні ліпіди та катіонні полімери, добре відомі як засоби доставки ДНК. Також може використовуватись фізична доставка, наприклад, за допомогою "генної пушки". Пептид чи пептид, кодований нуклеїновою кислотою, може бути гібридним білком, на+ приклад, епітопом, що стимулює CD8 Т-клітини. Пептид для використання в протираковій вакцині може бути будь-яким прийнятним пептидом. Зокрема, це може бути прийнятний 9-мерний пептид чи 7-мерний, 8-мерний, 10-мерний, 11-мерний пептид або 12-мер. Пептиди більшої довжини також можуть використовуватись, але 9-мерні або 10-мерні пептиди, описані в доданій таблиці 1, є переважними. Відповідно, будь-яка нуклеїнова кислота, яка вводиться пацієнту, є стерильною і такою, що не вміщує пірогену. Чиста ДНК може вводитися внутрішньом'язовим, інтрадермальним чи підшкірним шляхом. Пептиди можуть вводитись внутрішньом'язовим, інтрадермальним, внутрішньочеревним, внутрішньовенним або підшкірним шляхом (див. також опис методу утворення пептиду вище). Переважно, пептиди, як активні фармацевтичні компоненти вводяться в комбінації з ад'ювантом, наприклад, з IL-2, IL-12, GM-CSF, неповним ад'ювантом Фрейнда, повним ад'ювантом Фрейнда чи ліпосомними композиціями. Найбільш переважні ад'юванти можна знайти, наприклад, в роботі Brinkman JA, Fausch SC, Weber JS, Kast WM. Peptide-based vaccines for cancer immunotherapy. Expert Opin Biol Ther. 2004 Feb;4(2): 181-98. Вакцинація призводить до ЦТЛ-реакцій, стимульованих професійними антигенпрезентуючими клітинами; коли ЦТЛ примовані, з'являється перевага в посиленні МНС-експресії в клітинах пухлин. Також може бути корисним спрямовування вакцини в конкретні клітинні популяції, наприклад, антиген-презентуючі клітини, по місцю введення, використання цільових векторів та систем доставки чи селективна очистка такої клітинної популяції у пацієнта та введення пептиду чи нуклеїнової кислоти ex vivo (наприклад, дендритні клітини можуть сортуватись, як описано авторами Zhou et al (1995) Blood 86,3295-3301; Roth et al (1996) Scand. J. Immunology 43,646-651). Наприклад, цільові вектори можуть вміщувати тканино- чи пухлиноспецифічний промотор, який спрямовує експресію антигену в належне місце. 97092 20 Інший аспект винаходу, таким чином, пропонує вакцину, ефективну проти раку чи ракових або пухлинних клітин, яка включає ефективну кількість пептиду, згідно із винаходом, або нуклеїнову кислоту, яка кодує такий пептид. Також бажано, щоб вакцина була вакциною з нуклеїновою кислотою. Відомо, що щеплення вакциною з нуклеїновою кислотою, такою як ДНК-вакцина, що кодує поліпептид, призводить до Т-клітинної реакції. Найбільш переважною є вакцина, яка вміщує (синтетичний) пептид чи пептиди (тобто, самостійно чи в комбінаціях 1, 2, 3, 4, 5 чи 6 або навіть більше пептидів, див. нижче). Зручним є те, що вакцина з нуклеїновою кислотою може включати будь-який прийнятний засіб доставки нуклеїнової кислоти. Нуклеїнова кислота, переважно ДНК, може бути чистою (тобто, по суті, без інших компонентів для введення) або може доставлятись з ліпосомами чи як частина вірусної векторної системи доставки. Існує думка, що поглинання нуклеїнової кислоти та експресія кодованого поліпептиду дендритними клітинами може бути механізмом ініціації імунної реакції, однак, дендритні клітини не можуть бути трансфековані, але є все ж таки важливими, оскільки вони можуть забирати експресований пептид з трансфекованих клітин в тканині. Бажано, щоб вакцина, така як ДНК-вакцина, вводилася в м'язи. Також переважним варіантом є введення вакцини в шкіру. Вакцина з нуклеїновою кислотою може вводитись без ад'юванта. Вакцина з нуклеїновою кислотою може вводитись з ад'ювантом, таким як BCG чи галун. Інші прийнятні ад'юванти включають стимулон Aquila's QS21 (Aquila Biotech, Ворчестер, Масачусетс, США), який виділяється з сапоніну, мікробактеріальні екстракти та синтетичні імітатори стінок бактеріальних клітин, а також патентовані ад'юванти, наприклад Ribi's Detox. Інший ад'ювант, похідний з сапоніну, Quil А, також може використовуватись (Superfos, Данія). Бажано, щоб вакцина з нуклеїновою кислотою вводилася без ад'юванта. Крім того, можуть використовуватись інші ад'юванти, такі як ад'ювант Фрейнда. Також може бути зручним введення пептиду, зв'язаного з гемоцианіном лімфи равлика, переважно також з ад'ювантом. Імунізаційна терапія раку, в якій посередником виступає полінуклеотид, описана в роботах Conry et al (1996) Seminars in Oncology 23,135-147; Condon et al (1996) Nature Medicine 2,1122-1127; Gong et al (1997) Nature Medicine 3,558-561; Zhai et al (1996) J. Immunol. 156,700-710; Graham et al (1996) Int J. Cancer 65,664-670; та Burchell et al (1996) pp 309-313 In: Breast Cancer, Advances in biology and therapeutics, Calvo et al (eds), John Libbey Eurotext, всі з яких включені в цей документ шляхом посилань. Ще один аспект цього винаходу пропонує використання пептиду, згідно із винаходом, чи полінуклеотиду або вектору експресії, що кодує такий пептид, у виготовленні медикаменту для знищення клітин-мішеней у пацієнта, коли клітини-мішені експресують поліпептид, який вміщує амінокислотну послідовність винаходу. 21 Інший аспект винаходу пропонує метод утворення активованих цитотоксичних Т-лімфоцитів (ЦТЛ) in vitro, причому метод включає контакт ЦТЛ in vitro з антиген-завантаженими МНС-молекулами класу І людини, експресованими на поверхні відповідної антиген-презентуючої клітини протягом періоду часу, достатнього для активації даного ЦТЛ антиген-специфічним способом, коли антиген являє собою пептид згідно із винаходом. + Відповідно, ЦТЛ є СD8 клітинами-хелперами. МНС-молекули класу І можуть експресуватися на поверхні будь-якої прийнятної клітини, та переважно, якщо клітина є такою, що природно не експресує МНС-молекули класу І (в цьому випадку виконується трансфекція клітини для експресії такої молекули) або, якщо експресує, вона є дефектною в шляхах процесінгу чи презентації ангигену. Таким чином, для клітини, що експресує МНС-молекулу класу І, можливо прямування, по суті, повністю, обраним пептидним антигеном до активації ЦТЛ. Антиген-презентуюча клітина (чи клітинастимулятор), як правило, має на своїй поверхні МНС-молекулу класу І та переважно не здатна, сама по собі, завантажувати зазначену МНСмолекулу класу І обраним антигеном. Як описується більш детально нижче, МНС-молекула класу І може легко завантажуватись обраним антигеном in vitro. Переважно, клітина ссавців не має пептидного транспортера ТАР, чи має його знижений рівень або зменшену функцію. Відповідні клітини, в яких немає пептидного транспортера ТАР, включають Т2, RMA-S та клітини дрозофіли. ТАР - це Транспортер, асоційований з процесінгом антигенів. Дефектна клітинна лінія Т2, що завантажує пептид людини, доступна для придбання в American Type Culture Collection, 12301 Парклоун Драйв, Роквілль, Меріленд 20852, США, номер за каталогом CRL 1992; посилання на цю компанію наведене в цьому документі. Простіше кажучи, клітина хазяїна перед трансфекцією практично не експресує МНС-молекул класу І. Також бажано, щоб клітина-стимулятор експресувала молекулу, важливу для костимуляції Т-клітини, наприклад, будь-яку з В7.1, В7.2, ІСАМ-1 та LFA 3. Послідовності нуклеїнових кислот різних МНСмолекул класу І та молекул ко-стимуляторів широко доступні в базах даних GenBank та EMBL. Ще в одному втіленні винаходу також можуть використовуватись комбінації HLA-молекул, такі як, наприклад, МНС-молекули класу II, як описано в Таблицях А і В. Використання рекомбінантних + поліепітопних вакцин для доставки ряду CD8 ЦТЛ-епітопів описано в роботах Thomson et al (1996) J. Immunol. 157, 822-826 та WO 96/03144, посилання на які включені в цей документ. Відносно цього винаходу, може бути бажано включити в єдину вакцину пептид (чи нуклеїнову кислоту, що кодує пептид), причому пептид включає в будьякому порядку амінокислотну послідовність цього + винаходу та інший епітоп, який стимулює CD8 Тклітину. Ця вакцина була б особливо корисна для лікування ракових захворювань. Такі "нанизані" 97092 22 вакцини є типово ДНК-вакцинами. Одночасний запуск імунної реакції, що залежить від МНС класу II, разом з імунною реакцією, яка залежить від МНС класу І, має перевагу у тому, що це призводить до локальної ТНі-подібної Т-клітинної реакції СD4-позитивних Т-клітин, шляхом якої підтримуються СD4-позитивні Т-клітини, які залежать від МНС класу І. Для генерації ЦТЛ in vitro може використовуватись ряд інших методів. Наприклад, методи, описані в роботах Peoples et al (1995) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92,432-436 та Kawakami et al (1992) J. Immunol. 148,638643 використовують аутологічні лімфоцити з популяцій пухлинних клітин в генерації ЦТЛ. В роботі Plebanski et al (1995) Eur. J. Immunol. 25,1783-1787 описується використання аутологічних лімфоцитів периферичної крові (ЛПК) для отримання ЦТЛ. Робота Jochmus et al (1997) J. Gen. Virol. 78, 1689-1695 стосується створення аутологічних ЦТЛ шляхом імпульсного введення пептиду чи поліпептиду до дендритних клітин або інфікування рекомбінантним вірусом. Автори роботи Hill et al (1995) J. Exp. Med. 181, 2221-2228 та Jerome et al (1993) J. Immunol. 151, 1654-1662 використовують В-клітини у формуванні аутологічних ЦТЛ. Крім того, макрофаги, завантажені пептидом чи поліпептидом імпульсним методом або інфіковані рекомбінантним вірусом, можуть використовуватись для отримання аутологічних ЦТЛ. Автори S. Walter et al. (Walter S, Herrgen L, Schoor O, Jung G, Wernet D, Buhring HJ, Rammensee HG, Stevanovic S. Cutting edge: predetermined avidity of human CD8 Τ cells expanded on calibrated MHC/antiCD28-coated microspheres. J Immunol. 2003 Nov 15;171(10):4974-8) описують праймінг Т-клітин in vitro шляхом використання штучних антигенпрезентуючих клітин, що також представляє прийнятний спосіб для генерації Т-клітин проти обраного пептиду. Алогенні клітини також можуть використовуватись у підготовці ЦТЛ, і цей спосіб детально описаний в патенті WO 97/26328, який включено в цей документ шляхом посилання. Наприклад, на додаток до клітин дрозофіли та клітин Т2, можуть застосовуватись інші клітини для представлення антигенів, такі як клітини СНО, клітини комах, інфіковані бакуловірусом, клітини бактерій, дріжджів та клітини-мішені, інфіковані коров'ячою віспою. Крім того, можуть використовуватись віруси рослин (див., наприклад, роботу Porta et al (1994) Virology 202, 449-955, в якій описується розробка мозаїчного вірусу вігни як високопродуктивної системи для презентації чужорідних пептидів). Активовані ЦТЛ, коли вони спрямовуються проти пептидів винаходу, є корисними в терапії. Отже, ще один аспект винаходу пропонує активовані ЦТЛ, що одержуються за допомогою згаданих вище методів винаходу. Ще один аспект винаходу пропонує активовані ЦТЛ, котрі селективно розпізнають клітину, що експресує поліпептид, вміщуючий амінокислотну послідовність винаходу. Переважно, ЦТЛ розпізнає цю клітину шляхом взаємодії з комплексом HLA/пептид (наприклад, зв'язування). ЦТЛ є корисними у методі знищення клітин-мішеней у пацієн 23 та, клітини-мішені якого експресують поліпептид, що вміщує амінокислотну послідовність винаходу, причому пацієнту вводиться ефективна кількість активованих ЦТЛ. Ті ЦТЛ, які вводяться пацієнту, можуть виділятися з пацієнта та активуватись, як описано вище (тобто, вони є аутологічними ЦТЛ). Альтернативно, ЦТЛ одержуються не від пацієнта, а від іншої людини. Безумовно, переважно, якщо людина є здоровою людиною. Під терміном "здорова людина" автори винаходу мають на увазі, що людина взагалі має добре здоров'я, переважно має адекватну імунну систему та, ще більш переважно, не страждає від якогось захворювання, що може бути легко перевірено та виявлено. Активовані ЦТЛ експресують рецептор Тклітини (РТК), що включається в розпізнавання клітин, які експресують поліпептид. Корисно, якщо кДНК, що кодує РТК, клонується з активованих ЦТЛ та передається в подальші ЦТЛ для експресії. + In vivo, клітини-мішені для CD8 ЦТЛ, відповідно до цього винаходу, можуть бути клітинами пухлини, уражені клітини при лейкемії чи клітини лімфоми (що експресують МНС класу І) та/або клітинами строми, що оточують пухлину (клітинами пухлини) (які іноді також експресують МНС класу І). РТК клонів ЦТЛ винаходу, специфічні для пептидів винаходу, є клонованими. Використання РТК в клонах ЦТЛ визначається із використанням (і) РТК- варійованих моноклональних антитіл, які є регіонально специфічними, та (іі) RT PCR з праймерами, специфічними для генних сімейств Va та Vp. Бібліотека кДНК формується з полі-А-мРНК, що екстрагується з клонів ЦТЛ. Використовуються праймери, специфічні для С-термінальної частини ланцюгів а та Π РТК та для N-термінальної частини ідентифікованих сегментів Va та П. Повна кДНК для ланцюгу а та b РТК примножується ДНКполімеразою високої точності, та примножені продукти клонуються в належний вектор клонування. Клоновані гени ланцюгу а та Π можуть бути зібрані в РТК з одним ланцюгом за методом, описаним в роботі Chung et al (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91, 12654-12658. В цій одноланцюговій конструкції за сегментом VaJ йде сегмент V DJ, після чого слідує сегмент Ср, за яким йде трансмембранний і цитоплазматичний сегмент ланцюгу CD3. Цей одноланцюговий РТК потім вводиться у ретровірусний вектор експресії (може використовуватись панель векторів, на основі їхньої здатності інфіку+ вати зрілі CD8 Т-лімфоцити людини та бути посередником в генній експресії: ретровірусна векторна система Kat є одною з переважних можливостей (див. Finer et al (1994) Blood 83, 43). Амфотропний ретровірус високого титру викорис+ товується для інфікування очищених CD8 або + CD4 T-лімфоцитів, виділених з периферичної крові у пацієнтів з пухлинами (за протоколом, опублікованим в роботі Roberts et al (1994) Blood 84, 2878-2889, яка включена в цей документ шляхом посилання). Антитіла проти CD3 використовуються + для ініціації проліферації очищених CD8 Т-клітин, що полегшує ретровірусну інтеграцію та стабільну експресію одноланцюгових РТК. Ефективність ретровірусної трансдукції визначається шляхом ви 97092 24 + крашування інфікованих CD8 Т-клітин антитілами, специфічними для РТК з одним ланцюгом. Аналіз + трансдукованих CD8 Т-клітин in vitro підтверджує, що вони демонструють те ж саме пухлиноспецифічне знищення, що спостерігається аллорестрикційним ЦТЛ-клоном, з якого первісно були клоновані ланцюги РТК. Популяції трансдукованих + CD8 Т-клітин з очікуваною специфічністю можуть використовуватись для адоптивної імунотерапії пацієнтів з пухлинами. Пацієнти можуть одержува8 11 ти від 10 до 10 аутологічних трансдукованих ЦТЛ. Інші прийнятні системи для введення генів у ЦТЛ описані в роботі Moritz et al (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91, 4318-4322, яка включена в цей документ шляхом посилання. В роботах Eshhar et al (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 720-724 та Hwu et al (1993) J. Exp. Med. 178, 361-366 також описується трансфекція ЦТЛ. Отже, інший аспект винаходу пропонує РТК, який розпізнає клітину, що експресує поліпептид, вміщуючий амінокислотну послідовність винаходу, причому РТК одержується з активованого ЦТЛ. На додаток до РТК, у винахід включені молекули, функціонально еквівалентні РТК. Вони включають будь-яку молекулу, яка функціонально еквівалентна РТК, котра може виконувати ту ж функцію, що й РТК. Зокрема, такі молекули включають генетично розроблені тридоменні одноланцюгові РТК, які створюються за методом, описаним в роботі Chung et al (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91, 12654-12658, яка включена в цей документ шляхом посилання та згадана вище. Винахід також включає полінуклеотид, що кодує РТК чи функціонально еквівалентну молекулу, та вектор експресії, який кодує РТК чи його функціонально еквівалентну молекулу. Вектори експресії, які є прийнятними для експресування РТК винаходу, включають описані вище, стосовно експресування пептидів винаходу. Однак, бажано, щоб вектори експресії були векторами, які здатні експресувати РТК в ЦТЛ після трансфекції. Ще один аспект винаходу пропонує метод знищення клітин-мішеней у пацієнта, коли ці клітини-мішені експресують поліпептид, що вміщує амінокислотну послідовність винаходу, і цей метод включає етапи (1) одержання ЦТП від пацієнта; (2) введення в зазначені клітини полінуклеотиду, який кодує РТК, або функціонально еквівалентної молекули, як зазначено вище; та (3) введення клітин, утворених в етапі (2), пацієнту. Інший аспект винаходу пропонує метод знищення клітин-мішеней у пацієнта, коли ці клітинимішені експресують поліпептид, який вміщує амінокислотну послідовність, як визначено у першому чи другому або третьому аспектах винаходу, і цей метод включає етапи (1) отримання антигенпрезентуючих клітин, таких як дендритні клітини, від зазначеного пацієнта; (2) контакту антигенпрезентуючих клітин з пептидом, як визначено в першому чи другому або третьому аспектах винаходу, або з полінуклеотидом, що кодує такий пептид, ex vivo; та (3) повторного введення таким чи 25 ном оброблених антиген-презентуючих клітин пацієнту. Переважно, антиген-презентуючі клітини є дендритними клітинами. Відповідно, дендритні клітини є аутологічними дендритними клітинами, які імпульсним методом завантажуються антигенним пептидом. Антигенний пептид може бути належним антигенним пептидом, який викликає відповідну Т-клітинну реакцію. Т-клітинна терапія із використанням аутологічних дендритних клітин, в які імпульсним методом завантажуються пептиди з пухлино-асоційованого антигену, розкривається в роботі Murphy et al (1996) The Prostate 29,371-380 and Tjua et al (1997) The Prostate 32, 272-278. В іншому втіленні винаходу антигенпрезентуючі клітини, такі як дендритні клітини, контактують з полінуклеотидом, котрий кодує пептид винаходу. Полінуклеотид може бути будь-яким відповідним полінуклеотидом, та переважно, щоб він був здатний трансдукувати дендритні клітини, таким чином забезпечуючи презентування пептиду та стимуляцію імунітету. Зручним є те, що полінуклеотид може включати в себе вірусний полінуклеотид чи вірус. Наприклад, показано, що дендритні клітини, трансдуковані аденовірусом, стимулюють антигенспецифічний протипухлинний імунітет відносно MUC1 (див. Gong et al (1997) Gene Ther. 4, 10231028). Подібним чином, можуть використовуватись системи на основі аденовірусів (див., наприклад, роботу Wan et al (1997) Hum. Gene Ther. 8,13551363); ретровірусні системи (Specht et al (1997) J. Exp. Med. 186, 1213-1221 та Szabolcs et al (1997). Крім того, можна використовувати перенос в дендритні клітини за допомогою кров'яних часток (Turing et al (1997) Eur. J. Immunol. 27, 2702-2707); та можна використовувати РНК (Ashley et al (1997) J. Exp. Med. 186, 1177 1182). Роз'яснюється, що відносно методів знищення клітин-мішеней у пацієнта особливо бажано, щоб клітинами-мішенями були ракові клітини, ще більш переважно - уражені клітини при лейкемії чи ракові клітини лімфоми. Особливо переважно, щоб пацієнти, які лікуються за методами винаходу, мали тип HLA-A2. Отже, в переважному втіленні винаходу перед лікуванням визначається HLA-гаплотип пацієнта. Визначення HLA-гаплотипу може проводитись із використанням будь-якого прийнятного методу; такі методи добре відомі фахівцям. Винахід включає, зокрема, використання пептидів винаходу (чи полінуклеотидів, що кодують їх) для активної вакцинації in vivo; для обробки аутологічних дендритних клітин in vitro із подальшим введенням таким чином оброблених дендритних клітин in vivo для активації ЦТЛ-реакцій; для активації аутологічних ЦТЛ in vitro із подальшою адоптивною терапією (тобто, оброблені ЦТЛ вводяться пацієнту); та для активації ЦТЛ від здорових донорів (з відповідними чи невідповідними МНС) in vitro із подальшою адоптивною терапією. Вакцини цього винаходу, в його переважному втіленні, вводяться в організм-хазяїн окремо чи разом із іншими засобами протиракової терапії 97092 26 для сповільнення чи припинення формування пухлин. Пептидна вакцина може вводитися без ад'юванта. Вакцина з нуклеїновою кислотою може також вводитись з ад'ювантом, таким як BCG чи галун. Інші прийнятні ад'юванти включають стимулон Aquila's QS21 (Aquila Biotech, Ворчестер, Масачусетс, США), який виділяється з сапоніну, мікробактеріальні екстракти та синтетичні імітатори стінок бактеріальних клітин, а також патентовані ад'юванти, наприклад Ribi's Detox. Інший ад'ювант, похідний з сапоніну, Quil А, також може використовуватись (Superfos, Данія). Інші ад'юванти, такі як олігонукеотиди CpG, стабілізована РНК, Imiquimod (є в продажу під торговою маркою Aldara™ в компанії 3М Pharma, U.S.A.), неповний ад'ювант Фрейнда (комерційна назва Montanide ISA-51, можна придбати в Seppic S.A., Париж, Франція), ліпосомні композиції чи GM-CSF також можуть бути корисними. Також може бути зручним введення пептиду, зв'язаного з гемоцианіном лімфи равлика, переважно також з ад'ювантом. Пептиди, відповідно до винаходу, також можуть використовуватись як діагностичні реактиви. Використовуючи пептиди, можна проаналізувати, чи присутні в ЦТЛ-популяції ті ЦТЛ, які специфічно направлені проти пептиду або індукуються терапією. Крім того, збільшення прекурсорних Т-клітин може бути перевірено з тими пептидами, які мають реактивність проти визначеного пептиду. Пептид також може використовуватись як маркер для моніторингу розвитку пухлини, що експресує зазначений антиген, з якого виділяється пептид. В доданій Таблиці 1 перелічені пептиди в тому виді, як вони використовуються та ідентифікуються. До того ж, в таблиці дається відповідне положення пептиду в належному білку. Номер за каталогом OFA/iLR миші в генному банку (Genbank) "Національного Центру Інформації з Біотехнології" Національного Інституту Здоров'я (див. http://www.ncbi.nlm.nih.gov) - AAD26866. Номери за каталогом of OFA/iLR людини в генному банку (Genbank) "Національного Центру Інформації з Біотехнології" Національного Інституту Здоров'я (див. http://www.ncbi.nlm.nih.gov) - це, наприклад, ААС50652 або ААР35883. В іншому переважному втіленні пептиди використовуються для викрашування лейкоцитів, зокрема, Т-лімфоцитів. Це використання має особливу перевагу, якщо доказується, чи присутні в ЦТЛпопуляції специфічні ЦТЛ, які спрямовані проти пептиду. Крім того, пептид можна використовувати як маркер для визначення ходу лікування пухлинної хвороби чи розладу. В іншому переважному втіленні цього винаходу пептиди використовуються для виробництва антитіла. Поліклональні антитіла можна одержати стандартним шляхом, за допомогою імунізації тварин, вводячи їм пептид, та подальшої очистки імунного глобуліну. Моноклональні антитіла можуть бути одержані за стандартними протоколами, такими як описані, наприклад, в роботі Methods Enzymol. (1986), 121, Hybridoma technology and monoclonal antibodies. 27 Винахід в своєму іншому аспекті відноситься до фармацевтичної композиції, яка вміщує один чи кілька зазначених пептидів, згідно із винаходом. Ця композиція використовується для парентерального введення, наприклад, підшкірного, інтрадермального, внутрішньом'язового чи перорального введення. Для цього пептиди розчиняються або суспендуються у фармацевтично прийнятному, переважно водному, носії. Крім того, композиція може вміщувати наповнювачі, такі як буферні елементи, зв'язувальні речовини, очисники, розчинники, ароматизатори, мастильні речовини та ін. Пептиди також можуть вводитись разом з імуностимулюючими речовинами, такими як цитокіни. Вичерпний перелік наповнювачів, які можуть використовуватись у такій композиції, наведений, наприклад, в книзі A. Kibbe, Handbook of Pharmaceutical Excipients, 3. Ed., 2000, American Pharmaceutical Association and pharmaceutical press. Композиція може використовуватись для попередження, профілактики та/або лікування пухлинних захворювань. Фармацевтичний препарат, який вміщує принаймні один з пептидів цього винаходу, що включає будь-яку з послідовностей SEQ ID No. 1 або SEQ ID No. 2, вводиться пацієнту, який страждає на пухлинне захворювання, асоційоване з відповідним пептидом чи антигеном. Зокрема, захворювання, які можуть лікуватися, - це злоякісні утворення, що експресують OFA/iLRP, такі як лейкемії (наприклад, ГМЛ чи ХЛЛ) чи мієломи (наприклад, MM). Таким чином, можна викликати ЦТЛспецифічну імунну реакцію. В іншому аспекті цього винаходу, комбінація з двох чи декількох пептидів, згідно із винаходом, може використовуватись як вакцина, в прямому поєднанні чи в межах однієї схеми лікування. Крім того, можуть використовуватись комбінації з іншими пептидами, наприклад, МНС-ІІ- специфічними пептидами. Досвідчений фахівець зможе обрати бажані комбінації імуногенних пептидів шляхом тестування, наприклад, генерації Т-клітин in vitro, а також їхньої ефективності та загальної присутності, проліферації, спорідненості та розширення окремих Т-клітин для певних пептидів, та функціональності Т-клітин, наприклад, аналізуючи утворення IFN-γ (див. також приклади нижче), IL-12 чи Перфоріну. Зазвичай, найбільш ефективні пептиди згодом комбінуються як вакцина в цілях, описаних вище. Належна вакцина буде вміщувати 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 або 15 різних пептидів, переважно 4, 5, 6 або 7 різних пептидів, і, найбільш переважно, 6 різних пептидів. Нарешті, вакцина може залежати від специфічного виду раку, яким хворіє пацієнт, що проходить лікування, а також стану захворювання, попередньої схеми лікування, імунного статусу пацієнта та, звичайно, від HLA-гаплотипу пацієнта. Ідентифікація епітопів Т-хелперів пухлиноасоційованих антигенів залишається важливою задачею в протипухлинній імунотерапії. Щоб ідентифікувати Т-клітинно-з'єднані епітопи, виведені з білку OFA-iLR, було синтезовано 14 пептидів (див. нижче), які прогнозовані комп'ютерними програ 97092 28 мами РАРrоС (http://www.uni-tuebingen.de/uni/kxi/) та SYFPEITHY (http://www.syfpeithi.de) як такі, що зв'язуються з молекулою HLА-А* 0201. У реконструкційному аналізі in vitro із використанням клітинної лінії Т2 без ТАР (транспортер, асоційований з процесінгом антигенів), тільки два пептиди (iLR1, iLR2) показали сильну спорідненість до зв'язування з HLA-A*0201 (Малюнки 11А та В), якщо порівнювати з нуклеопротеїном58-66 грипу. В присутності повністю зрілих дендритних клітин (ДК), імпульсним шляхом завантажених пептидом iLR1 чи iLR2, можуть генеруватися ЦТЛ-лінії, одержані від здо+ рових донорів HLA-А*0201 . Криві пептидної титрації показують, що iLR1та iLR2-специфічні ЦТЛ мають високу спорідненість з комплексом пептид/МНС (Малюнки 5 та 10). Обидві ЦТЛ-лінії, специфічні для iLR1 (Малюнок 1) або iLR2 (Малюнок 6), проявляли сильну цитолітичну активність проти гематологічних пухлинних + ліній HLA-A*0201 , первинних злоякісних ГМЛбластів (Малюнки 4А, В, та 8А, В, відповідно) та ХЛЛ-клітин (Малюнки 3А, В, та 9А, В, відповідно), але не мали HLA-A2-негативних мішеней та нормальних гематопоетичних клітин (там же). Експерименті з блокуванням антитіл (Малюнки 2 та 7) виявили рестрикційне знищення МНС класу І, інду+ коване пептидно-специфічними CD8 Тлімфоцитами. Для визначення частоти iLR1- та iLR2-специфічних Т-клітин у пацієнтів з HLAA*0201 , які хворіють на ГМЛ, ХЛЛ та множинну мієлому, був проведений імуноферментний спотаналіз (ELISPOT) із виділенням IFN-γ (Таблиці 3 + 5). У 25/50 (50%) та 20/50 (40%) HLA-A*0201 пацієнтів з гематологічними злоякісними новоутвореннями можна було визначити значні рівні iLR1- або iLR2- пептидо-специфічних Т-клітин, в той час як в зразках периферичної крові здорових людей ніяких спонтанних Т-клітинних реакцій проти ILR1 чи ILR2 не відбулося (Таблиця 2). У одного пацієнта з ХЛЛ та у іншого пацієнта з ГМЛ можна було генерувати аутологічні ЦТЛ-лінії, специфічні для iLR1- та iLR2-пептидного епітопу, що демонстрували дієву цитотоксичну активність проти HLA-A2-відповідних аутологічних та алогенних клітин-мішеней. Автори винаходу раніше показали, що + OFA/iLR-специфічні регуляторні CD8 T-клітинні клони, виділяючі Інтерлейкін-10, можна ідентифі+ кувати як у мишей, які мають пухлину OFA/iLR (Rohrer JW, Rohrer SD, Barsoum A, Coggin JH Jr. Differential recognition of murine tumor-associated oncofoetal transplantation antigen and individually specific tumor transplantation antigens by syngeneic cloned Balb/c and RFM mouse Τ cells. J Immunol. 1994; 152: 745-764), так і у пацієнтів з прогресуючою карциномою грудей (Rohrer JW, Barsoum AL, Dyess DL et al. Human breast carcinoma patients develop clonable oncofoetal antigen-specific effector and regulatory Τ lymphocytes. J Immunol. 1999; 162: 6880-6892. 11. Rohrer JW, Coggin JH Jr. CD8 Τ cell clones inhibit antitumor Τ cell function by secreting IL10. J. Immunol. 1995; 155: 5719.). Автори Su et al. (Su Ζ et al. Immunological and Clinical responses in metastatic renal cancer patients vaccinated with tumor RNA-transfected dendritic cells. Cancer Res. 29 2003; 63: 2127-2133) інформують про Т-клітини, реактивні проти рестрикційних епітопів МНС класу І з OFA/iLR у пацієнтів з метастатичним раком нирок. В цьому дослідженні автори також доповідають про несподівано низький рівень смертності пацієнтів, котрі пройшли терапевтичну вакцинацію аутологічними дендритними клітинами, що були трансфековані РНК, яка кодує OFA/iLR та інші очікувані пухлинні антигени. Однак, кількість, HLAрестрикція та хімічна ідентичність епітопів з OFA/iLR не була розкрита групою авторів Su et al. В роботі авторів Höltl et al. (Höltl L et al. Immunotherapy of metastatic renal cell carcinoma with tumor lysate-pulsed autologous dendritic cells. Clin. Cancer Res. 2002; 8: 3369-3376) були надані додаткові докази того, що OFA/iLR може бути дуже корисним для імунотерапії раку на основі терапевтичних вакцин, стимулюючих специфічні клітинні імунні реакції. Автори виявили, що 5 з 6 пацієнтів, хворих на метастатичний гіпернефроїдний рак (RCC), які були вакциновані аутологічними дендритними клітинами, завантаженими аутологічними або алогенними лізатами пухлинних клітин, продемонстрували посилені імунні реакції проти OFA/iLR. Але ніякі епітопи з OFA/iLR також не були розкриті групою авторів Höltl et al. Цікаво, що пацієнти з найсильнішими імунними реакціями проти OFA/iLR мали повну та часткову клінічну відповідь. В невеликій групі пацієнтів, хворих на ХЛЛ на ранній стадії захворювання (Binet A), що досліджувались авторами винаходу, не були визначені ніякі релевантні IL-10-виділяючі Т-клітини, специфічні для пептиду iLR1 або iLR2 (дані не показані). Автори винаходу в даний час зайняті експериментами, що допоможуть роз'яснити більш детально можливий зв'язок між появою aнті-OFAALRPспецифічних Т-клітин, які виділяють IFN-γ або IL10, та стадією захворювання у пацієнтів, хворих на ХЛЛ та множинну мієлому. Підводячи підсумок наведеному вище, автори винаходу вперше ідентифікували два окремих HLA-A*0201-специфічних пептидних епітопи, які одержані з білку OFA/iLR. Ці пептиди представляють корисні засоби для проведення імунологічних досліджень пухлин та стратегій вакцинації в OFA/iLRP-експресуючих злоякісних утвореннях. Винахід в своєму іншому аспекті відноситься до методу знищення клітин-мішеней у пацієнта, клітини-мішені якого експресують поліпептид, що вміщує амінокислотну послідовність, яка наведена в цьому документі, причому метод передбачає введення пацієнту ефективної кількості пептиду, згідно із цим винаходом, або нуклеїнової кислоти за цим винаходом, чи вектору експресії відповідно до цього винаходу, коли кількість зазначеного пептиду чи нуклеїнової кислоти, або кількість вектору експресії є ефективною для викликання імунної реакції проти клітин-мішеней у цього пацієнта. Винахід в своєму іншому аспекті відноситься до методу знищення клітин-мішеней у пацієнта, коли клітини-мішені експресують поліпептид, що вміщує амінокислотну послідовність, надану згідно із цим винаходом, і цей метод передбачає введення пацієнту ефективної кількості цитотоксичних Т 97092 30 лімфоцитів (ЦТЛ), як визначено згідно із цим винаходом. Винахід в своєму додатковому аспекті відноситься до методу знищення клітин-мішеней у пацієнта, коли клітини-мішені експресують поліпептид, що вміщує амінокислотну послідовність, надану згідно із цим винаходом, і цей метод включає етапи (1) отримання цитотоксичних Т-лімфоцитів (ЦТЛ) у пацієнта; (2) введення в зазначені клітини нуклеїнової кислоти, що кодує рецептор Т-клітини (РТК), або функціонально еквівалентну молекулу, як визначено згідно із цим винаходом; та (3) введення клітин, утворених на етапі (2), пацієнту. Переважно, клітини-мішені є раковими клітинами. Більш переважно, зазначений рак має бути лейкемією чи лімфомою, що експресує поліпептид, який вміщує амінокислотну послідовність, що пропонується згідно із цим винаходом . Слід взяти до уваги, що ознаки винаходу, які розкриваються та описуються в цьому документі, можна використовувати тільки у відповідній комбінації, як зазначається, та за єдиною формою, не відходячи від обсягу цього винаходу. Тепер винахід буде описуватися більш детально, із посиланням на наступні малюнки, перелік послідовності та приклади. Наступні приклади даються в ілюстративних цілях та не мають наміру обмежувати винахід. Послідовності SEQ ID-No. 1 та SEQ ID-No. 2 показують пептидні послідовності Т-клітинного епітопа, що вміщує пептиди, які представлені МНС класу І, згідно із цим винаходом. Послідовності з SEQ ID-No. 6 по SEQ ID-No. 17 показують пептидні послідовності, котрі використовуються в прикладах. Малюнок 1 показує розпізнавання різних клітинних ліній ЦТЛ, специфічними для ILR1. Малюнок 2 показує блокування лізису клітинмішеней антитілами, що розпізнають CD8, МНС класу І або РТК для ILR1. Малюнок 3 показує, що ЦТЛ, специфічні для HLA-A*02/ILR1, вбивають клітини пухлин у пацієнтів, хворих на ХЛЛ; (А) 1-й експеримент; (В) 2-й експеримент. Малюнок 4 показує, що ЦТЛ, специфічні для HLA-A*02/ILR1, вбивають клітини пухлин у пацієнтів, хворих на ГМЛ; (А) 1-й експеримент; (В) 2-й експеримент. Малюнок 5 А показує залежність дози лізису клітин-мішеней Т2 із імпульсним завантаженням пептиду ILR1-специфічними ЦТЛ. Малюнок 5А показує інгибування ILR1-специфічних ЦТЛ неміченими ("холодними") мішенями (Аналіз інгибування цитотоксичності неміченими клітинамимішенями). Малюнок 6 показує розпізнавання різних клітинних ліній ЦТЛ, специфічними для ILR2. Малюнок 7 показує блокування лізису клітинмішеней антитілами, що розпізнають CD8, МНС класу І або РТК для ILR2. Малюнок 8 показує, що ЦТЛ, специфічні для HLA-A*02/ILR2, вбивають клітини пухлин у пацієнтів, хворих на ГМЛ. (А) 1-й експеримент; (В) 2-й експеримент. 31 Малюнок 9 показує, що ЦТЛ, специфічні для HLA-A*02/ILR2, вбивають клітини пухлин у пацієнтів, хворих на ХЛЛ. (А) 1-й експеримент; (В) 2-й експеримент. Малюнок 10А показує залежність дози лізису клітин-мішеней Т2 із імпульсним завантаженням пептиду ІLR2-специфічними ЦТЛ. Малюнок 10В показує інгибування of ILR2-специфічних ЦТЛ неміченими ("холодними") мішенями (Аналіз інгибування цитотоксичності неміченими клітинамимішенями). Малюнок 11 показує реконструкційний аналіз in vitro із використанням клітинної лінії Т2 без ТАР (транспортер, асоційований з процесінгом антигенів); тільки два пептиди (iLR1, iLR2) показали сильну спорідненість до зв'язування з HLA-A*0201 (Малюнки 11А та В), якщо порівнювати з нуклеопротеїном58-бб грипу. В порівнянні з ILR3 - ILR14 та контрольним пептидом вірусу грипу (Fluml), пептиди ILR1 та ILR2 показують належну спорідненість до зв'язування для HLA-A*02. Малюнок 12 показує представницький тетрамерний аналіз мікросферного розширення + A2/RPS-001- та А2/RPS-002-специфічних СD8 6 + лімфоцитів з периферичної крові. 1 × 10 CD8 збагачених МПК (моноцитів периферичної крові) + на колодязь НВС-065 здорових НLА-А2 -донорів були стимульовані щотижня в одному колодязі мікросферами, поєднаними з анті-СD28 плюс пухлинний антиген високої щільності A*0201/RPS-001 (верхня панель) або пухлинний антиген високої щільності A*0201/RPS-002 (нижня панель), як показано раніше [Walter, S, et al. Cutting Edge: Predetermined avidity of human CD8 Τ cells expanded on calibrated MHC/anti-CD28-coated microspheres. J. Immunol. 171(10):4974-8, 2003] з невеликими модифікаціями. Після трьох стимуляцій in vitro, клітини обох колодязів були викрашені антитілом CD8 FITC плюс тетрамер A*0201/RPS-001 APC та A*0201/RPS-002 PE. Клітини заповнюються лімфоцитною популяцією (ліва та середня панель) + або CD8 -лімфоцитною популяцією (права панель). Числа представляють відсоток тетрамеру в + СБ8 -лімфоцитах. RPS-001 = LLAARAIVAI (SEQ ID-No. 1); RPS-002 = ALCNTDSPL (SEQ ID-No. 2) ПРИКЛАДИ Абревіатури, які використовуються в тексті цього винаходу: Ab: Антитіло Ag: Антиген АПК: Антиген-презентуюча клітина CD: Кластер диференціації cpm: Кількість імпульсів на хвилину ДК: Дендритна клітина EBV: Вірус Епштайна-Барра ESI: Іонізація електророзпиленням HLA: Антиген на поверхні лейкоцитів людини ВЕРХ: Високоефективна рідинна хроматографія IFN: Інтерферон Іі: Інваріантний ланцюжок (CD74) IL: Інтерлейкін MALDI: Матрична лазерна десорбція/іонізація МНС: Головний комплекс гістосумісності MS: Mac-спектрометрія 97092 32 OD450: Оптична щільність на довжині хвилі 450нм МПК: Моноцити периферичної крові PCR: Ланцюгова полімеразна реакція РНА: Фіто-гемаглютинін SDS-PAGE: Електрофорез в поліакриламідному гелі в присутності додецилсульфату натрію S.І.: Індекс стимуляції TOF: Час прольоту Клітинні лінії, зразки пухлин та моноцити периферичної крові (МПК) Усі клітинні лінії, що використовуються в цьому дослідженні, були одержані в American Type Culture Collection (Manassas, VA, + USA). МПК, клітини-попередники CD34 , клітини кісткового мозку та зразки пухлин були одержані від здорових донорів, пацієнтів з гострою мієлоїдною лейкемією (ГМЛ), хронічною лімфоцитарною лейкемією (ХЛЛ) та множинною мієломою (MM), відповідно, після згоди та ухвали наглядової ради, на основі одержаної інформації. Антитіла Антитіла проти МАМ-6: Alexis Corp., Швейцарія, отримані через AXXORA DEUTSCHLAND GmbH, Gallusstrasse 10, D-35305 Griinberg. Номер продукту SIG-614. Антитіло проти HLA-A*02: клон ВВ7.2 від BD Pharmingen, Номер кат. 551230. Антитіло проти CD8: клон SFCI21Thy2D3 (T8) від Beckman Coulter, Номер продукту 6602139. Антитіло проти РТК: клон ВМА031 від Beckman Coulter, Номер продукту ІМ1466. Антитіло проти CD4: клон SFCI12T4D11 (Т4) від Beckman Coulter, Номер продукту 6602138. Антитіло проти HMFG-1: клон 1.10.F3 від Beckman Coulter, Номер продукту ІМ0271. Пептиди Пептиди FluMl 58-66 (GILGFVFTL), HIV-Pol476484 (ILKEPVHGV, негативний контроль в аналізі ELISPOT) msurv33 (LYLKNYRIA, пептидний епітоп d мишачого сурвівіну, специфічний для H2 , негативний контроль в аналізі зв'язування Т2), 1LRI59-68 (LLAARAIVAI), iLR2146-154 (ALCNTDSPL), iLR360-68 (LAARAIVAI), iLR458-66 (LLLAARAIV), iLR57-15 (VLQMKEEDV), iLR650-58 (NLKRTWEKL), iLR766-74 (VAIENPADV), 1LR8139-147 (YVNLPTIAL), iLR9177-185 (MLAREVLRM), iLR10249-257 (SEGVQVPSV), iLR111826 (FLAAGTHLG), iLR1257-66 (KLLLAARAIV), iLR136776 (AIENPADVSV), iLR14173-182 (LMWWMLAREV) були закуплені в компанії Biosynthan (Берлін, Германія), з чистотою більше 90%, та проаналізовані із використанням високоефективної рідинної хроматографії та мас-спектрометрії. Пептидний синтез та аналіз Пептиди були синтезовані в автоматичному пептидному синтезаторі EPS221 (Abimed, Лангенфельд, Германія) за стратегією Fmoc/tBu. Після видалення від полімеру шляхом обробки ТФК/фенолом/етандітіолом/тіоанізолом/водою (90/3.75/1.25/2.5/2.5 за об'ємом) протягом 1 години чи 3 годин (пептиди, вміщуючі аргінін) пептиди були осаджені з метіл-терт. бутілового ефіру, промиті один раз метіл-терт. бутіловим ефіром та двічі діетиловим ефіром та повторно суспендовані у воді, до ліофілізації. Продукти синтезу були проаналізовані із використанням ВЕРХ (Varian star, 33 97092 Zinsser analytics, Мюнхен, Німеччина) та масспектрометрії MALDI-TOF (в майбутньому, GSG, Брукзал, Німеччина). Пептиди з чистотою менше 80 % були очищені препаративною ВЕРХ. Дослідження зв'язування Т2 Повний клітинно-зв'язувальний аналіз Т2 був виконаний за протоколом, описаним в роботі Casati et al.(Casati C, Dalerba P, Rivoltini L et al. The apoptosis inhibitor protein survivin induces tumorspecific CD8+ and CD4+ Τ cells in colorectal cancer patients. Cancer Res. 2003; 63, 4507-4515.). Генерація ЦТЛ людини ЦТЛ, виділені у здорових людей з HLA+ A*0201 , були генеровані із використанням протоколу, що доступний в багатьох дослідженнях (Zeis Μ, Siegel S, Schmitz Μ et al. Induction of cytotoxic Τ lymphocytes against hematologic neoplasms by survivin RNA-transfected dendritic cells. J Immunol. 2003; 170, 5391-5397.). Для індукування аутологічних OFA/iLR- пептидо-специфічних ЦТЛ, одержа+ них від пацієнтів, хворих на ГМЛ та ХЛЛ, CD8 Тклітини були відділені від МПК із використанням 34 ® імуномагнітних бусин (MACS , Miltenyi, БергішГладбах, Германія), культивованих аутологічними OFA/iLR пептидо-наповненими повністю зрілими ДК та ре-стимульованих аутологічними пептидонаповненими МПК в присутності IL-2 (Інг/мл, CellConcepts, Вайскірх, Германія). Після принаймні чотиритижневих ре-стимуляцій, реактивність ЦТЛ була визначена в умовному тесті з радіоактивним хромом-51 (4 години). Аналізи інгибування неміченими мішенями та експерименти з блокування антитіл були проведені, як описувалося раніше (Zeis Μ, Siegel S, Schmitz Μ et al. Induction of cytotoxic Τ lymphocytes against hematologic neoplasms by survivin RNA-transfected dendritic cells. J Immunol. 2003; 170, 5391-5397.). Аналіз ELISPOT Для визначення частоти OFA/iLR- пептидоспецифічних Т-клітин у пацієнтів, були проведені аналізи ELISPOT із використанням комплекту Interferon-γ-ELISPOT-Kit (Becton Dickinson, Хейдельберг, Германія), згідно із інструкціями виробника. Таблиця 1 Пептиди та пухлино-асоційовані пептидні епітопи Т-хелперів, які ідентифіковані в цьому винаході 1. 2. 3. 4. 5. iLR1 59-68 iLR2146-154 FluMl58-66 HIV-РОІ476-484 msurv33 LLAARAIVAI ALCNTDSPL GILGFVFTL ILKEPVHGV LYLKNYRIA № послідовності SEQ ID-No. SEQ ID-No. 1 SEQ ID-No. 2 SEQ ID-No. 3 SEQ ID-No. 4 SEQ ID-No. 5 6. 7. 8. 9. 10. 11. 12. 13. 14. 15. 16. 17. iLR360-68 iLR458-66 iLR57-15 iLR650-58 iLR766-74 iLR8139-147 iLR9177-185 iLR10249-257 iLR1118-26 iLR1257-66 iLR1367-76 iLR14173-182 LAARAIVAI LLLAARAIV VLQMKEEDV NLKRTWEKL VAIENPADV YVNLPTIAL MLAREVLRM SEGVQVPSV FLAAGTHLG KLLLAARAIV AIENPADVSV LMWWMLAREV SEQ ID-No. 6 SEQ ID-No. 7 SEQ ID-No. 8 SEQ ID-No. 9 SEQ ID-No. 10 SEQ ID-No. 11 SEQ ID-No. 12 SEQ ID-No. 13 SEQ ID-No. 14 SEQ ID-No. 15 SEQ ID-No. 16 SEQ ID-No. 17 Назва Послідовність Результати Пептиди: ILR1 (LLAARAIVAI, SEQ ID No. 1) та ILR2 (ALCNTDSPL, SEQ ID No. 2) В усіх аналізах ELISPOT числа, що даються 5 для IFN-гамма-позитивних точок, наведені для 10 МПК. До аналізу Т-клітини від пацієнтів та здорових донорів були утримувані в культурі протягом Примітка ILR1 ILR2 негативний контроль в аналізі ELISPOT пептидний епітоп мишачого сурвівіну, специфічний для H2d, негативний контроль в аналізах зв'язування Т2 семи днів в присутності Інтерлейкіну-2 (IL-2) (10 6 од./мл) та пептиду (10 мікрограм/10 МПК/міліметр). Усі досліджені здорові донори мали низьке число ЦТЛ, що реагували на ILR1 або ILR2 (Таблиця 2) в аналізі IFN-γ ELISPOT. Таблиця 2 Показання: Пацієнти з позитивною пробою на: Визначення ELISPOT: Пептидна амінокислотна послідовність: Визначення пептиду: Джерело білка: Здорові донори HLA-A*02 Гамма-інтерферон (IFN-γ) LLAARAIVAI ALCNTDSPL ILR1 ILR2 Антиген-незрілий рецепторний Антиген-незрілий білок ламініну білок ламініну GILGFVFTL FluM1 рецепторний Матричний білок грипу М1 35 97092 36 Продовження таблиці 2 Ім'я пацієнта: 001 002 003 004 005 006 007 008 009 010 011 012 013 014 015 Число позитивно викрашених ділянок: 0 0 3 3 2 2 4 4 5 5 4 4 6 6 7 7 0 0 0 0 0 0 0 0 3 3 4 4 5 5 З усіх досліджених зразків пухлин пацієнтів, хворих на ХЛЛ, 12 з 20 (60%) зразків мали значні (>20) ЦТЛ-реакції проти пептиду ILR1, та 9 з 16 (56%) зразків мали реакції проти пептиду ILR2 в аналізі IFN-γ ELISPOT. Середні числа позитивно викрашених ЦТЛ для двох пептидів, одержаних з ILR, порівнювані з 55% (ILR2) та 76% (ILR1) чисел реакцій, що одержані з типовим НLА-А*02рестрикційним діагностичним антигеном матричного білку грипу, проти якого майже кожна доросла людина повинна була мати клітинні імунні реакції раніше (Таблиця 3). Таблиця 3 Показання: Пацієнти з позитивною пробою на: Визначення ELISPOT: Пептидна амінокислотна послідовність: Визначення пептиду: Джерело білка: Ім'я пацієнта: 000, В. 000, Т. 022, Е. 027, W. 033, D. 038, N. 041, Е. 049, G. 052, G. 054, S. 058, Ε. 060, F. 065, В. 070, Μ. 071, G. 082; G. 083, M. 087, N. 090, G. 091, G. 125, F. Пацієнти з ХЛЛ HLA-A*02 Гамма інтерферон (IFN-γ) LLAARAIVAI ALCNTDSPL ILR1 ILR2 Антиген-незрілий рецепторний Антиген-незрілий білок ламініну білок ламініну Число позитивно викрашених ділянок: 4 4 56 45 77 65 88 128 122 67 45 23 35 27 56 78 0 56 0 0 0 0 0 0 1 0 2 2 3 0 68 100 83 121 93 57 GILGFVFTL FluM1 рецепторний Матричний білок грипу М1 15 35 51 35 не визначено 140 65 31 не визначено 47 41 63 58 89 91 28 279 24 30 67 З усіх досліджених зразків пухлин пацієнтів, хворих на ГМЛ, 6 з 15 (40%) зразків мали значні (>20) ЦТЛреакції проти пептиду ILR1, та 7 з 15 (47%) зразків мали реакції проти пептиду ILR2 в аналізі IFN-γELISPOT (Таблиця 4). 37 97092 38 Таблиця 4 Показання: Пацієнти з позитивною пробою на: Визначення ELISPOT: Пептидна амінокислотна послідовність: Визначення пептиду: Джерело білка: Ім'я пацієнта: 000, М. 025, J. 041, G. 055,С. 072, G. 106, K. 107, L. 108, J. ПО, В. 000, М. 026, С 043, L. 056,N. 072, G. 068, G. Пацієнти з ГМЛ HLA-A*02 Гамма інтерферон (IFN-γ) LLAARAIVAI ALCNTDSPL ILR1 ILR2 Антиген-незрілий рецепторний Антиген-незрілий білок ламініну білок ламініну Число позитивно викрашених ділянок: 2 0 3 0 2 0 1 1 3 3 4 0 5 3 56 34 54 27 34 34 34 34 33 23 25 112 1 1 2 32 GILGFVFTL FluM1 рецепторний Матричний білок грипу М1 З усіх досліджених зразків пухлин пацієнтів, хворих на мієлому, 8 з 14 (57%) зразків мали значні (>20) ЦТЛ-реакції проти пептиду ILR1, та 6 з 14 (43%) мали реакції проти пептиду ILR2 в аналізі IFN-γELISPOT (Таблиця 5). Таблиця 5 Показання: Пацієнти з позитивною пробою на: Визначення ELISPOT: Пептидна амінокислотна послідовність: Визначення пептиду: Джерело білка: Ім'я пацієнта: 001 002 003 004 005 006 007 008 009 010 011 012 013 014 Мієлома HLA-A*02 Гамма інтерферон (IFN-γ) LLAARAIVAI ALCNTDSPL GILGFVFTL ILR1 ILR2 FluM1 Антиген-незрілий рецепторний Антиген-незрілий рецепторний Матричний білок ламініну білок ламініну грипу М1 Число позитивно викрашених ділянок: 3 0 4 0 56 0 76 1 56 3 43 0 22 3 23 34 0 27 0 34 34 23 23 112 112 1 1 Підводячи підсумок сказаному вище, потенціал пептидів ILR1 та -2 з OFA-ILRP щодо викликання клітинних імунних реакцій проти ракових клітин, зокрема, уражених клітин при лейкемії та клітин лімфоми, стає чітко видимим. Т-клітини, специфічні для зазначених пептидів, демонструють ефекторні функції (виділення IFN-γ-гамма). Таблиця 6: Сумарні дані тетрамерного аналізу мікросферного розширення A2/RPS-001-та + білок А2/RРS-002-специфічних СD8 -лімфоцитів з пе6 + риферичної крові. 1 × 10 CD8 -збагачених МПК на колодязь були стимульовані, як на малюнку 12, мікросферами, поєднаними з анті-СБ28 плюс пухлинний антиген високої щільності A*0201/RPS-001 або пухлинний антиген високої щільності A*0201/RPS-002. Зазначена кількість оцінюваних + НLА-А2 -донорів, кількість оцінюваних донорів з якнайменш однією чітко позитивною реакцією, 39 кількість оцінюваних стимуляцій між усіма оцінюваними донорами та кількість оцінюваних стимуляцій з чітко позитивними реакціями. RPS-001 = 97092 40 LLAARAIVAI (SEQ ID-No. ALCNTDSPL (SEQ ID-No. 2) 1); RPS-002 = Таблиця 6 Антиген A2/RPS-001 A2/RPS-001 A2/RPS-001 A2/RPS-001 A2/RPS-002 A2/RPS-002 A2/RPS-002 A2/RPS-002 Параметр Оцінювані донори Оцінювані донори з чітко позитивними Т-клітинними реакціями Оцінювані стимуляції між усіма оцінюваними донорами Оцінювані стимуляції з чітко позитивними Т-клітинними реакціями Оцінювані донори Оцінювані донори з чітко позитивними Т-клітинними реакціями Оцінювані стимуляції між усіма оцінюваними донорами Оцінювані стимуляції з чітко позитивними Т-клітинними реакціями Додаткові експерименти відносно ILR1 (LLAARAIVAI) Т-клітини, що розпізнають ILR1-пептид, були перевірені на К562 [клітинна лінія проерітробластної лейкемії людини, що також відома як клітинна лінія хронічної мієломної лейкемії (ХМЛ), що внаслідок надзвичайно низьких рівнів HLA функціонує як контрольний елемент для виключення NK-клітин (клітини - природні кілери) як ефекторних клітин], ІМ9 (клітинна лінія лімфобластоїду В людини), Karpas-422 (B-клітинна лімфома людини), Balm-3 (клітинна лінія В-лімфоми людини, іншої ніж лімфоми Буркітта), U266 (множинна мієлома людини), REH (В-клітинна прекурсорна лейкемія людини), МЕС-1 (хронічна В-клітинна лейкемія людини). Ті ж самі Т-клітини були використані для тестування аутологічних та алогенних МПК від здорових донорів як контрольних елементів. Усі клітинні лінії крім МЕС-1, котрі не експресують HLA-А*02 -алель та K562, та не мають генної експресії HLA класу І в цілому, були розпізнані ILR1-специфічними Т-клітинами (див. Малюнок 1). Алогенні та аутологічні клітини від здорових донорів не були розпізнані, і це означає, що 1. ILR1 в значній мірі експресований на пептидному рівні тільки в клітинах пухлин, але не в моноцитах крові від HLA-відповідних здорових донорів 2. Реакція не спрямована проти алогенних антигенів головного чи неголовного комлексу гістосумісності 3. ILR1-пептид розпізнається за HLAрестрикційним способом; 4. Рестрикція є алель-специфічною (специфічною до А*02) Цільовий об'єкт: ГМЛ Т-клітини, специфічні до НLА-А*02рестрикційного ILR1, були проаналізовані на клітинах пухлин пацієнтів, хворих на ГМЛ (4 пацієнти; зразки ГМЛ-01, -02, -03, -06) (Малюнок 4А). Клітини від А*02-позитивних пацієнтів (3/4) були розпізнані з максимальним лізисом із співвідношенням Е:М (співвідношення клітин-ефекторів та клітинмішеней), що дорівнює 40:1, від 25,9% до 39,8%. ГМЛ-клітини від А*02-негативного пацієнта ГМЛ-06 не були розпізнані. Т-клітини, специфічні до НLА-А*02рестрикційного ILR1 були проаналізовані на клітинах пухлин від пацієнтів, хворих на ГМЛ, вдруге для підтвердження результатів, отриманих в 1-му Значення 5 5 53 29 5 1 54 1 експерименті (9 пацієнтів; зразки ГМЛ-01, -02, -04, -05, -06, -07, -09, -10, -12). Клітини від А*02позитивних пацієнтів (5/9; ГМЛ-02, -04, -05, -09, 10)) були розпізнані в усіх випадках. Клітини від А*02-негативних пацієнтів (4/9; ГМЛ-01, -06, -07, 12) не були розпізнані (4/4) (Малюнок 4В). Малюнок 4В також показує дані по CD34позитивним клітинам-попередникам з кісткового мозку від А*02-позитивних донорів (CD34-01, -02), які не були розпізнані активованими ILR1специфічними Т-клітинами, які були рестимульовані ILR1 в присутності IL-2 in vitro протягом 7 днів. Крім того, клітини кісткового мозку (KМ01, -02) від А*02-позитивних донорів не були розпізнані цими Т-клітинними клонами. Малюнок 2 показує експерименти з блокування антитіл для подальшої характеристики специфічності Т-клітинної реакції. До експериментів з радіоактивним хромом (51Сr) при постійному співвідношенні Е:М, що дорівнювало 40:1, блокуючі моноклональні антитіла були інкубовані клітинною лінією ІМ-9 В-лімфобластоїду людини при концентраціях моноклональніх антитіл, зазначених виробником. Експерименти блокування показали, що розпізнанню ILR1 сприяє наступне: 1. клітини з рецепторами Т-клітин (РТК), 2. розпізнання їхньої мішені в контексті МНС класу І (HLA клас І), 3. механізм взаємодії, в залежності від корецептора CD8, але не CD4. Контрольні моноклональні антитіла, специфічні для нерелевантних білків з муцино-подібною клітинною поверхнею МАМ-6 (синоніми: СА 15-3, DF3) та HMFG-1 не мали впливу на визнання ІМ-9клітин ефекторними Т-клітинами. PBS (фосфатносольовий буфер) був використаний як негативний контроль в цих експериментах з блокування. Підсумовуючи наведене вище, ці дві серії експериментів підтвердили, що 1. ILR1 є пухлино-асоційованим антигеном у 100% (8/8) А*02-позитивних (8/13) пацієнтів з ГМЛ, що були протестовані; 2. ILR1 обмежується HLA-A*02; 3. ILR1-специфічні Т-клітини розпізнають природно модифікований ILR2 на клітинах пухлин, але в той самий час ILR1-пептид, видимо, відсутній в клітинах кісткового мозку та СD34-позитивних клітинах-попередниках; 4. Взаємодія між клітинами-мішенями та ефекторними клітинами може бути специфічно інгибо 41 вана за допомогою моноклональніх антитіл проти МНС класу І, РТК чи CD8. Цільовий об'єкт: ХЛЛ Т-клітини, специфічні до НLА-А*02рестрикційного ILR1, були протестовані на клітинах пухлин пацієнтів з ХЛЛ (5 пацієнтів; зразки ХЛЛ-01, -02, -03, -05, -06). Клітини від А*02позитивних пацієнтів (3/5) були розпізнані в усіх випадках (З/З). Клітини від А*02-негативних пацієнтів не були розпізнані ні в якому випадку (0/2) (Малюнок 3В). Експеримент був повторений (Малюнок 3А) ще з 8 пацієнтами з ХЛЛ, і 3 них 4 пацієнта були А*02-позитивними. Оскільки були розпізнані ХЛЛ-клітини у 4 з 4 А*02-позитивних пацієнтів, в той час як 0/4 А*02-негативних клітинмішеней було розпізнано, ці додаткові експерименти підтверджують наведені вище результати. Можна зробити такий підсумок: 1. ILR1 є пухлино-асоційованим антигеном у 100% (7/7) перевірених А*02-позитивних пацієнтів з ХЛЛ; 2. ILR1 обмежується HLA-A*02. Цільовий об'єкт: Т2 В клітинах Т2 спостерігається дефіцит експресії ТАР, "Транспортера, асоційованого з процесінгом антигенів", що відповідає за переміщення коротких пептидів з цитоплазми до ендоплазматичної мережі (ER), де пептиди завантажуються на порожні МНС-молекули класу І. Як наслідок, МНС-молекули класу І клітин Т2 залишаються порожніми, якщо не додаються ніякі пептиди (зовнішнє завантаження). Отже, клітини Т2, що експресують порожні НІА-А*02-молекули на клітинній поверхні, є оптимальними мішенями для розробки кривих титрації для пептидоспецифічного знищення НLА-А*02-рестрикційними Т-клітинами. В цьому експерименті (Малюнок 5А) Т-клітини, специфічні для ILR1, були перевірені на клітинах Т2, на які імпульсним шляхом був завантажений детально описаний Т-клітинний епітоп від HIV, або ILR1-пептид LLAARAIVAI. Результати: Т-клітини розпізнали тільки клітини Т2, в які імпульсним шляхом завантажений ILR1-пептид. Клітини Т2, в які імпульсним шляхом завантажений HIV-пептид, не були розпізнані. Мішені Т2 з ILR1-пептидом були лізовані дозо-залежним способом. Лізис не досяг насичення в діапазоні перевірених концентрацій. Цільовий об'єкт: Т2 + ILR1 Був виконаний аналіз інгибування цитотоксичності неміченими клітинами-мішенями. Для дослідження того, чи лізують ILR1-специфічні Т-клітини наповнені ILR1 -пептидом клітини Т2 специфічним чином та в контексті HLA-A*02, аналіз інгибування цитотоксичності був проведений в такий спосіб: 51 клітини Т2 із міткою Сr були завантажені пепти6 дом в концентрації 10 мікрограм пептиду/10 клі5 тин Т2/мл. Всього 2×10 немічених клітин Т2, котрі також були завантажені таким же чи контрольним пептидом, були потім додані в об'ємі 50 мікроліт4 ров AIMV до 10 клітин Т2, наповнених пептидом 51 імпульсним способом, з міткою Сr. Були додані ефекторні Т-клітини, специфічні до ILR1, та аналіз 51 з радіоактивним хромом Сr був виконаний, як 97092 42 описано вище. Аналіз показав, що ні пептиди, нерелевантні до ILR1-специфічних ЦТЛ (сурвівін та ILR2), ні завантажені клітини Т2, що несуть порожні НLА-А*02-молекули на своїх клітинних поверхнях, не конкурують за лізис клітин-мішеней, завантажених ILR1-пептидом ILR1-специфічними ЦТЛ. І навпаки, коли клітини-мішені, в які імпульсним шляхом вводиться синтетичний ILR1-пептид, або пухлинні клітини ГМЛ, що природно демонструють ILR1 в контексті HLA-A*02, використовуються як вторинні ("холодні") мішені, тоді вони конкурують з первинними клітинами-мішенями ("гарячими" клітинами Т2, наповненими ILR1-пептидом імпульсним методом) за лізис ILR1-специфічними ЦТЛ (Малюнок 5В). Додаткові експерименти відносно ILR2 (ALCNTDSPL) Т-клітини, що розпізнають ІLR12-пептид (Малюнок 6), були перевірені на К562 [клітинна лінія про-ерітробластної лейкемії людини, що також відома як клітинна лінія хронічної мієломної лейкемії (CML), що внаслідок надзвичайно низьких рівнів HLA функціонує як контрольний елемент для виключення NK-клітин як ефекторних клітин], ІМ9 (клітинна лінія лімфобластоїду В людини), Karpas-422 (В-клітинна лімфома людини), Balm-3 (клітинна лінія В-лімфоми людини, іншої ніж лімфоми Буркітта), U266 (множинна мієлома людини), REH (В-клітинна прекурсорна лейкемія людини), Ramos (синонім RA 1; лімфобласт В-лімфоми людини, лімфоми Буркітта), МЕС-1 (хронічна Вклітинна лейкемія людини). Ті ж самі Т-клітини були використані для тестування аутологічних та алогенних МПК від здорових донорів як контрольних елементів. Усі клітинні лінії крім Ramos та МЕС-1, котрі не експресують HLA-A*02-алель та K562, та не мають генної експресії HLA класу І в цілому, були розпізнані ILR2-специфічними Т-клітинами. Алогенні та аутологічні клітини від здорових донорів не були розпізнані, і це означає, що 1. ILR2 в значній мірі експресований на пептидному рівні тільки в клітинах пухлин, але не в моноцитах крові від HLA-відповідних здорових донорів 2. Реакція не спрямована проти алогенних антигенів головного чи неголовного комлексу гістосумісності 3. ІLR2-пептид розпізнається за HLAрестрикційним способом; 4. Рестрикція є алель-специфічною (специфічною до А*02) Цільовий об'єкт: ГМЛ Т-клітини, специфічні до НLА-А*02рестрикційного ILR2, були проаналізовані на клітинах пухлин пацієнтів, хворих на ГМЛ (8 пацієнтів; зразки ГМЛ-01, -02, -04, -05, -06, -07, -10, -12). Клітини від А*02-позитивних пацієнтів (4/8; ГМЛ-02, 04, -05, -10) були розпізнані в усіх випадках (4/4). Клітини від А*02-негативних пацієнтів (4/8; ГМЛ-01, -06, -07, -12) не були розпізнані (4/4) (Малюнок 8А). Експеримент був проведений вдруге зі зразками від пацієнтів, які не були тестовані раніше. В цьому другому експерименті Т-клітини, специфічні для НLА-А*02-рестрикційного ILR2 були перевірені 43 знов на клітинах пухлин від пацієнтів з ГМЛ (4 пацієнти; зразки ГМЛ-01, -02, -03, -06). Клітини від А*02-позитивних пацієнтів (3/4) були розпізнані в усіх випадках. Клітини від А*02-негативних пацієнтів не були розпізнані (0/1) (Малюнок 8В). На малюнку 8А показані дані по СD34позитивним клітинам-попередникам, виділеним з кісткового мозку, від А*02-позитивних донорів (CD34-01, -02), котрі не були розпізнані активованими ІЬІ12-специфічними Т-клітинами, та були рестимульовані ILR2 в присутності IL-2 in vitro протягом 7 днів. Клітини кісткового мозку (KМ-01, -02) від А*02-позитивних донорів також не були розпізнані цими Т-клітинними клонами. Малюнок 7 показує експерименти з блокування антитіл для подальшої характеристики специфічності Т-клітинної реакції. До експериментів з радіоактивним хромом (51Сr) при постійному співвідношенні Е:М, що дорівнювало 40:1, блокуючі моноклональні антитіла були інкубовані клітинною лінією ІМ-9 В-лімфобластоїду людини при концентраціях моноклональніх антитіл, зазначених виробником. Експерименти блокування показали, що розпізнанню ILR2 сприяють клітки з рецепторами Т-клітин (РТК), розпізнавання їхньої мішені в контексті МНС класу І (HLA класу І) та механізм взаємодії в залежності від ко-рецептора CD8, а не CD4. Контрольні моноклональні антитіла, специфічні для нерелевантних білків з муцино-подібною клітинною поверхнею МАМ-6 (синоніми: СА 15-3, DF3) та HMFG-1 не мали впливу на визнання ІМ-9клітин ефекторними Т-клітинами. PBS (фосфатносольовий буфер) був використаний як негативний контроль в цих експериментах з блокування. Підсумовуючи наведене вище, можна сказати, що ці дві серії експериментів підтверджують, що 1. ILR2 є пухлино-асоційованим антигеном у 100% (7/7) А*02-позитивних пацієнтів з ГМЛ, що бути перевірені; 2. ILR2 обмежується HLA-A*02; 3. ІLR2-специфічні Т-клітини розпізнають природно модифікований ILR2 на своїх клітинних поверхнях, але в той же час ІLR12-пептид, видимо, відсутній на клітинах кісткового мозку та СD34позитивних клітинах-попередниках. 4. Взаємодія між клітинами-мішенями та ефекторними клітинами може бути специфічним чином інгибована моноклональными антитілами проти МНС класу І, TCR або CD8. Цільовий об'єкт: ХЛЛ Т-клітини, специфічні до НLА-А*02рестрикційного ILR2, були протестовані на клітинах пухлин пацієнтів з ХЛЛ (8 пацієнтів; зразки ХЛЛ-01, -02, -03, -04, -05, -06, -07, -08). Клітини від А*02-позитивних пацієнтів (4/8) були розпізнані в усіх випадках (4/4). Клітини від А*02-негативних пацієнтів не були розпізнані ні в якому випадку (0/4) (Малюнок 9А). Експеримент був повторений 97092 44 (Малюнок 9В) ще з 5 пацієнтами з ХЛЛ, і з них 3 пацієнта були А*02-позитивними. Оскільки були розпізнані клітини ХЛЛ у 3 з 3 А*02-позитивних пацієнтів, в той час як 0/2 А*02-негативні клітинимішені були розпізнані, ці додаткові експерименти підтверджують наведені вище результати. Можна зробити такий висновок: 1. ILR2 є пухлино-асоційованим антигеном у 100% (7/7) перевірених А*02-позитивних пацієнтів з ХЛЛ; 2. ILR2 обмежується HLA-A*02. Цільовий об'єкт: Т2 В клітинах Т2 спостерігається дефіцит експресії ТАР, "Транспортера, асоційованого з процесінгом антигенів", що відповідає за переміщення коротких пептидів з цитоплазми до ендоплазматичної мережі (ER), де пептиди завантажуються на порожні МНС-молекули класу І. Як наслідок, МНС-молекули класу І клітин Т2 залишаються порожніми, якщо не додаються ніякі пептиди (зовнішнє завантаження). Отже, клітини Т2, що експресують порожні НLА-А*02-молекули на клітинній поверхні, є оптимальними мішенями для розробки кривих титрації для пептидоспецифічного знищення НLА-А*02-рестрикційними Т-клітинами. В цьому експерименті Т-клітини, специфічні для ILR2, були перевірені на клітинах Т2, на які імпульсним шляхом був завантажений детально описаний Т-клітинний епітоп від HIV, або ІLR2-пептид ALCNTDSPL. Результати: Т-клітини розпізнали тільки клітини Т2, в які імпульсним шляхом завантажений ІLR2-пептид. Клітини Т2, в які імпульсним шляхом завантажений HIV-пептид, не були розпізнані. Мішені Т2 з ІLR2-пептидом були лізовані дозо-залежним способом. Лізис не досяг насичення в діапазоні перевірених концентрацій (Малюнок 10А). Цільовий об'єкт: Т2 + ILR2 Був виконаний аналіз інгибування цитотоксичності неміченими клітинами-мішенями, як описано вище в "Т2 + ILR1". Результати експерименту підтверджують, що ні пептиди, нерелевантні до ІLR2специфічних ЦТЛ (сурвівін та ILR1), ні завантажені клітини Т2, що несуть порожні НLА-А*02-молекули на своїх клітинних поверхнях, не конкурують за лізис клітин-мішеней, завантажених ILR2пептидом ІLR2-специфічними ЦТЛ. І навпаки, коли клітини-мішені, в які імпульсним шляхом вводиться синтетичний ILR2-пептид, або пухлинні клітини ГМЛ, що природно демонструють ILR2 в контексті HLA-A*02, використовуються як вторинні ("холодні") мішені, тоді вони конкурують з первинними клітинами-мішенями ("гарячими" клітинами Т2, наповненими ILR2-пептидом імпульсним методом) за лізис ІLR2-специфічними ЦТЛ (Малюнок 10В). Як висновок, можна сказати, що обидва пептиди винаходу з ILR є кандидатами на розробку основаних на пептидах терапевтичних вакцин для людей, хворих на рак, в цілому. 45 97092 46 47 97092 48 49 97092 50 51 97092 52 53 97092 54 55 97092 56 57 Комп’ютерна верстка Т. Чепелева 97092 Підписне 58 Тираж 23 прим. Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601