Застосування il-18 зв’язуючого білка для лікування і/або запобігання атеросклерозу

Даний винахід відноситься до області захворювань судин. Більш конкретно, винахід відноситься до застосування інгібіторів IL-18 для лікування і/або запобігання атеросклерозу. Атеросклероз є широко поширеним і найбільш важливим захворюванням судин, але відома множина інших захворювань судин. Атеросклероз в основному вражає великі і середні артерії, і пошкодження включають смужки жиру, фіброзні бляшки і ускладнені ураження. Атеросклероз являє собою хронічне запальне захворювання артеріальної стінки, що характеризується прогресивним накопиченням ліпідів, таких як холестерин, клітин, таких як макрофаги, Т-лімфоцити або гладком'язові клітини, і екстрацелюлярного матриксу [1]. Найбільш великі скупчення називають атеромами або бляшками, які часто містять кальцій. Жирова тканина може роз'їдати стінку артерії, знижувати еластичність артерії і перешкоджати току крові. У результаті, навколо бляшкоподібних відкладень можуть утворюватися тромби, додатково перешкоджаючи току крові, що може привести до повної оклюзії кровоносної судини. Звичайно атеросклероз пов'язаний з підвищеними рівнями LDLхолестерину, Lp(a) фібриногену і фактора VII, так само як і зі зниженим рівнем HDL-холестерину. Фактори ризику включають більш старший вік, чоловічу стать, куріння, діабет, ожиріння, високий рівень холестерину в крові, дієту, бага ту жирами, і наявність індивідуального або сімейного анамнезу хвороби серця. Він є головною причиною органічної ішемії, такої як, наприклад, інфаркту міокарда. Атерома є найбільш поширеним пошкодженням артерій, яке далі може ускладнюватись тромбоемболією. Атероматозні бляшки часто звужують просвіт артерій, приводячи до ішемії і іноді до атрофії тканин в області з поганим кровопостачанням. Серйозні наслідки включають симптом стенокардії внаслідок ішемії міокарда, серцеву недостатність внаслідок ішемії або неішемічних причин, і гіпертензію внаслідок звуження ниркової артерії і поганого кровопостачання нирок, яке фізіологічно приводить до збільшення секреції реніну. Іноді атеросклероз і артеріосклероз відносять до окремих патологічних станів і, в цьому випадку, атеросклероз має на увазі ущільнення (склероз) або втрату еластичності артерій конкретно в результаті атероми, хоча атеросклероз являє собою ущільнення або втрату еластичності артерій внаслідок будь-яких причин. Ускладнення або наслідки атеросклерозу включають захворювання коронарних артерій (атеросклероз коронарних артерій), недостатність кровопостачання в результаті обструкції (ішемія/стенокардія), гострий ІМ (інфаркт міокарда, серцевий приступ), транзиторну ішемічну атаку (ТІА) або інсульт і пошкодження кровоносних судин, м'язової тканини або органів. Аневризми, які являють собою постійні аномальні розширення кровоносних судин, також є широко поширеними наслідками атеросклерозу. Атеросклеротичні аневризми черевної аорти звичайно розвиваються у немолодих пацієнтів. Вони можуть розриватися в зачеревинний простір. В атеросклеротичних аневризмах звичайно присутні різко виражена втрата еластичної тканини і фіброз середньої оболонки, в основному внаслідок ішемії м'язової тканини середньої оболонки аорти, що супроводжується вивільненням макрофагальних ферментів, що приводить до фрагментації еластичних волокон. Лікарські засоби, рекомендовані для лікування або запобігання атеросклерозу, направлені на зниження рівня ліпідів/холестерину в крові. Зокрема, широко застосовується терапія, направлена на зниження LDLхолестерину. У цей час найбільш широко застосовуються статини, специфічні інгібітори HMG СоА-редуктази. Інші засоби, що знижують рівень ліпідів, включають такі лікарські засоби, як холестирамін, колестипол, нікотинова кислота, гемфіброзил, пробукол, ловастатин і інші. Іншим підходом є мінімізація ризику утворення тромбу на сталому атероматозному пошкодженні. Аспірин, який являє собою специфічний інгібітор тромбоксану А2, який опосередковує агрегацію тромбоцитів, або антикоагулянти можуть застосовуватися для зниження ризику утворення тромбу. У черезшкірній «балонній ангіопластиці» застосовується катетер з балоном на кінці для сплющення бляшки і збільшення току крові після оклюзії. Технологія подібна технології, що застосовується для відкриття артерій серця, але вона може застосовуватися відносно багатьох інших артерій організму. Стеноз коронарних артерій шунтують за допомогою сегментів підшкірної вени, вшитої в проксимальну частину аорти, або за допомогою відсікання внутрішньої грудної артерії з боку грудної стінки і створення анастомозу її дистального кінця з артерією на передній поверхні серця. Хірургічне видалення відкладення (ендартеректомія) може бути рекомендоване в деяких випадках (наприклад: ендартеректомія сонної артерії). Однак основною рекомендацією залишається вплив або контроль над факторами ризику, подібно підтримці дієти з низьким вмістом жиру, низьким вмістом холестерину і низьким вмістом солі і з подальшими направленими на підтримку здорового стану рекомендаціями відносно лікування і контролю за гіпертонією, діабетом і іншими захворюваннями, зниження маси тіла і припинення куріння, так само як і регулярні фізичні вправи для поліпшення стану серця і кровообігу. Запальний процес присутній на різних стадіях атеросклерозу [1]. Активація ендотелію за допомогою ряду факторів, що включають невелике дотичне напруження, модифіковані ліпопротеїни і прозапальні цитокіни, вважається першою стадією атеросклерозу і знаходиться під запальним контролем [1]. Багато нещодавніх досліджень показали, що взаємодії між клітинами судини і клітинами запалення є вирішальними в атерогенезі [1]. Зокрема, інгібування окремих прозапальних шляхів уповільнює розвиток атеросклерозу [1]. Запалення також грає головну роль в розпаді атеросклеротичної бляшки і тромбозі [2-5], і тому впливає на появу гострих ішемічних синдромів і пов'язану з ними летальність [6]. Дійсно важкі клінічні вияви атеросклерозу, що включають інфаркти серця, мозку і будь-яких інших органів, ураженого атеросклерозом, в основному є результатом оклюзії просвіту судини тромбом, утвореним при взаємодії із зруйнованою атеросклеротичною бляшкою [3, 4]. Патологічні дослідження показали, що вразливі або нестабільні бляшки, тобто бляшки, схильні до розпаду або які розпадаються, сильно відрізняються за клітинним і матриксним складом в порівнянні зі стабільними бляшками, не схильними до розпаду [7]. Вразливі бляшки багаті клітинами запалення (макрофаги і Т-лімфоцити), містять тромбогенне ліпідне ядро і характеризуються тонким фіброзним верхнім шаром з істотним недоліком позаклітинного матриксу [7]. Зниження синтезу колагену, опосередковане прозапальним цитокіном IFN-g, і підвищення активності макрофагальних металопротеаз, що руйн ують матрикс, є причинами потоншення і крихкості фіброзного верхнього шару [7]. Руйнування крихкого фіброзного верхнього шару відкриває високо тромбогенне ліпідне ядро для контакту з циркулюючою кров'ю і приводить до утворення оклюзивного тромбу [1, 7 ]. Тому вважають, що щільність клітин запалення в певному атеросклеротичному пошкодженні є хорошим показником його нестабільності. Клінічний прогноз для пацієнта з атеросклерозом тільки частково залежить від розміру пошкодження [19, 20]. У цей час широко визнано, що якість (склад бляшки), швидше, ніж розмір пошкодження, може бути навіть кращим показником розвитку ішемічних випадків. Дійсно, важкі клінічні вияви атеросклерозу (інфаркти серця або мозку) в основному є результатом оклюзії просвіту судини тромбом, утвореному на поверхні атеросклеротичної бляшки, що розпадається [19]. Патологічні дослідження показали, що вразливі або нестабільні бляшки, які схильні до розпаду або які розпалися, багаті клітинами запалення і характеризуються істотним недоліком вмісту гладком'язових клітин і колагену [20, 21]. Більш того, в подібних бляшках виявлене збільшення апоптотичної загибелі клітин, що веде до утворення високо тромбогенного ліпідного ядра [13, 22]. Прозапальні цитокіни беруть участь у запаленні. Цитокін інтерлейкін 18 (IL-18) спочатку був описаний як фактор, що індукує інтерферон-g (IFN-g) [8]. Він являє собою ранній сигнал розвитку відповіді лімфоцитів Тхелперів типу 1 (Th1). IL-18 діє разом з IL-12, IL-2, антигенами, мітогенами і можливо іншими факторами, індукуючи продукцію IFN-g. IL-18 також посилює продукцію GM-CSF і IL-2, посилює проліферацію Т-клітин, викликану анти-CD3, і підвищує Fas-опосередковану загибель природних кілерів. Зріла форма IL-18 утворюється з його попередника за допомогою IL-1b-перетворюючого ферменту (ICE, каспаза-1). Рецептор IL-18 складається, принаймні, з двох компонентів, що бер уть участь в скріпленні ліганду. Високо- і низькоафінні сайти скріплення IL-18 були знайдені на мишачих Т-клітинах, стимульованих IL-12 [9], передбачаючи існування багатоланцюгового рецепторного комплексу. Дві рецепторні субодиниці ідентифіковані в даний момент, які обидві належать до сімейства рецептора IL-1 [10]. Передача сигналу IL-18 включає активацію NF-kB [11]. Нещодавно був виділений розчинний білок, що володіє високою афінністю до IL-18, з сечі людини і були клоновані кДНК миші і людини, так само як і ген людини [12; WO 99/09063]. Білок був названий IL-18зв'язуючий білок (IL-18BP). IL-18BP не є позаклітинним доменом одного з відомих рецепторів IL-18, a секретованим природно циркулюючим білком. Він належить до нового сімейства секретованих білків, крім того, включає різні білки, що кодуються Poxvirus [12]. IL-18BP постійно експресується в селезінці [12]. Сечовий IL-18BP, так само як і рекомбінантний, специфічно зв'язує IL-18 з високою афінністю і модулює біологічну афінність IL-18. Ген IL-18BP розташований на хромосомі людини 11q13, і в геномній послідовності розміром 8,3т.п.н. не було знайдено екзону, що кодує трансмембранний домен. Чотири варіанти сплайсингу або ізоформи IL-18BP були знайдені у людини і позначені як IL-18BP a, b, c і d, які всі несуть однакові N-кінцеві послідовності і відмінні С-кінцевими послідовностями [12]. Чотири ізоформи IL-18BP людини і дві мишачі ізоформи, одержані в результаті сплайсингу мРНК і знайдені в різних бібліотеках кДНК, експресували, очищали і оцінювали на скріплення і нейтралізацію біологічної активності IL-18 [23]. Ізоформа IL-18BP людини (IL-18BPa) виявила найбільшу а фінність до IL-18 з швидкою активацією (rapid on-rate), повільною інактивацією (slow off-rate) і константою дисоціації (K(d)) 399пМ. IL-18BPC містить Ig-домен IL-18BPa за винятком 29 С-кінцевих амінокислот; K(d) для IL-18BPC в 10 разів менше (2,94нМ). Проте, IL-18BPa і IL-18BPC нейтралізують IL-18 >95% при подвійному мольному надлишку. В ізоформах IL-18BPb і IL-18BPd відсутній повний Ig-домен і відсутня здатність зв'язувати або нейтралізувати IL-18. Мишачі ізоформи IL-lSBPc і IL-18BPd, що володіють ідентичним Ig-доменом, також нейтралізують >95% мишачого 1L-18 при подвійному мольному надлишку. Однак мишачий IL-18BPd, що містить загальну С-кінцеву послідовність з IL-18BPa людини, також нейтралізує IL-18 людини. Молекулярне моделювання виявило великий змішаний електростатичний і гідрофобний сайт скріплення на Ig-домені IL-18BP, який може бути поясненням його високою афінністю скріплення ліганду [23]. Винахід заснований на даних, що інгібітор IL-18 володіє вираженим благотворним впливом на утворення бляшки, розвиток бляшки і стабільність бляшки на мишачій моделі атеросклерозу. Інгібітор IL-18 не тільки запобігає утворенню ураження грудної аорти, але також і індукує перемикання на фенотип стабільної бляшки для атеросклеротичних бляшок, що вже сформувалися. Тому, винахід відноситься до застосування інгібітору IL-18 для одержання лікарських засобів для запобігання і/або лікування атеросклерозу. Винахід, крім того, відноситься до способів лікування з генним терапевтичним підходом лікування і/або запобігання атеросклерозу. Короткий опис фігур На Фіг.1 представлена гістограма, що відображає процентне значення виживаності ендотеліальних клітин пупкової вени людини після інкубації тільки з окисленими ліпопротеїнами або інкубації разом з комбінацією окислених ліпопротеїнів з антитілами до IL-18 або IL-18BP відповідно. На Фіг.2 представлений Вестерн-блот, проведений для білкових екстрактів з атеросклеротичних артерій в порівнянні з контрольними артеріями. У Вестерн-блоті застосовували антитіла проти IL-18BP (hIL-18BP), aсубодиницю рецептора IL-18 (hlL-18BPa), IL-18 (hIL-18) і каспазу-1 (Caspase-1 p10). На Фіг.3 представлений агарозний гель, забарвлений бромистий етидієм, що показує результат ОТ-ПЛРаналізу мРНК IL-18 і IL-18BP в клітинах атеросклеротичної бляшки. На Фіг.4 представлені результати ОТ-ПЛР для IL-18BP і IL-18 в атеросклеротичній бляшці в порівнянні з експресією ha-актину (контроль) в симптоматичних і асимптоматичних бляшках. На Фіг.5 представлена карта експресувального вектора, використаного для внутрішньом'язового електроперенесення у мишей. На Фіг.6 представлена гістограма, що відображає площу ліпідних плям в атеросклеротичних артеріях. Кількісний комп'ютерний аналіз зображення ліпідного відкладення. Дані представлені у вигляді середніх величин зі станд. помилкою, (n=19 для вільної плазміди, n=14 для плазміди, що містить IL418BP). Чотирма зірочками відмічене р