Спосіб визначення специфічної сенсибілізації організму

Спосіб визначення специфічної сенсибілізації організму, що включає забір крові, який відрізняється тим, що кров забирають у кількості 0,51,0мл в пробірки, оброблені 5% розчином цитрату натрію, розводять 0,15М розчином NaCl у співвідношенні 1:3, відбирають 5мкл крові для контрольного та 5мкл крові для дослідного зразків і помі 3 16867 4 В.М., Катрушова О.В. -Полтава, 1997.– 271с.] шлясибілізацію організму до конкретного алергену. хом забору крові. Проведення реакції антигенспеНовим є те, що кров забирають у кількості 0,5 цифічного пошкодження гранулоцитів виконують 1,0 мл в пробірки, оброблені 5% розчином цитрату шляхом відстоювання гепарінізованої крові протянатрію, розводять 0,15М розчином NaCl у співвідгом 45 хвилин при кімнатній температурі, збирають ношенні 1:3, відбирають 5мкл крові для контрольверхній шар плазми, переносять в центрифужну ного та 5мкл крові для дослідного зразка і вносять пробірку з рівним об'ємом розчину Хенкса, їх у ємності для дослідження, до контрольного центрифугують 7хв. при 1000об/хв., видаляють зразка крові додають 10мкл 0,15М розчину NaCl, а супернатант, процедуру повторюють тричі, осад до дослідного зразка крові - 10мкл алергену, до клітин ресуспендують у розчині Хенкса, доводять якого визначається сенсибілізація, струшують, інкубують 30хв в термостаті при 37°С, додають в концентрацію до 2 106, в пробірки вносять по ємності з дослідним та контрольним зразками по 0,2мл суспензії клітин і рівний об'єм контрольного 400мкл 3% розчину оцтової кислоти з барвником, та дослідного алергенів, інкубують при 37°С 30 струшують ємності, інкубують 15хв. при 18-25°С, хвилин, всі проби виконують в 2-х паралелях, підраховують вміст лейкоцитів у дослідній та контцентрифугують 5хв. при 1000об/хв., супернатант рольній ємностях, визначають рівень сенсибілізавидаляють, додають 0,05мл барвника (суміш триції організму як відношення різниці (контрольпанового синього з еозином), ресуспендують, судослід) до контролю, і при результатах обчисленспензію вносять в камеру Горяєва, підраховують ня більших за 0,09, встановлюють сенсибілізацію відсоток живих (незабарвлених) і мертвих (забарорганізму до конкретного алергену. влених) лейкоцитів на 200 клітин, обчислюють Спосіб здійснюють таким чином: у хворого з цитотоксичний індекс за формулою - відношення наявністю алергічного стану з пальця або ліктьової різниці відсотка живих клітин в контролі без алервени натщесерце або через 3 години після їжі в гену та живих клітин з алергеном до різниці відсотпробірку, оброблену 5% розчином цитрату натрію ку полінуклеарів у суспензії лейкоцитів за мазком, забирають 0,5-1,0мл крові. Зібрану кров розводять забарвленим за Романовським, та відсотку живих 0,15М розчином NaСl у співвідношенні 1:3 за доклітин в контролі без алергену, помноженого на помогою автоматичних піпеток, відбирають 5мкл відношення 100 відсотків до відсотку полінуклеарів крові для контрольного та 5мкл крові для дослідсуспензії лейкоцитів, що забарвлені за Романовсьного зразка і вносять їх у ємності для дослідження. ким. Додають у ємність з контрольним зразком крові Недоліком способу є його порівняно низька 10мкл 0,15М розчину NaCl, а у ємність з дослідним ефективність за рахунок значної втрати клітин при зразком крові - 10мкл алергену, до якого визначабагатократному відмиванні, видаленні плазми, що ється сенсибілізація. Струшують пробірки і інкубузнижує чутливість метода і спотворює результати, ють 30хв. в термостаті при 37° С. Після інкубації в неможливість одночасного визначення сенсибіліємності з дослідним та контрольним зразком дозації організму до більш ніж 5-6 причиннодають по 400мкл 3% розчину оцтової кислоти з значущих алергенів із-за необхідності значних та барвником (Романовським-Гімза). Струшують ємподвійних витрат об'ємів крові, значна витрата ності та інкубують 15хв. при 18-25°С. Підраховучасу, складність виконання та обрахунку. ють вміст лейкоцитів у дослідній та контрольній В основу способу, що заявляється, поставлеємностях за допомогою камер Горяєва та імерсійна задача створення способу визначення специного мікроскопу. Визначають рівень сенсибілізації фічної сенсибілізації організму шляхом забору організму як відношення різниці (контроль-дослід) порівняно малої кількості крові, розведення її фізідо контролю, і при результатах обчислення, більологічним розчином, інкубації зразків крові з алерших за 0,09, встановлюють сенсибілізацію органігенами та підрахування кількості лейкоцитів, що зму до конкретного алергену. дає можливість підвищення ефективності оцінки Приклад 1 специфічної сенсибілізації організму. Для оцінки сенсибілізації до 10 алергенів ( куСуть способу визначення специфічної сенсикурудзи, яблука, яловичини, риби, картоплі, цукру, білізації організму полягає в тому, що виконується моркви, помаранчів, гороху), які ймовірно могли шляхом забору крові, кров забирають у кількості викликати гіперсенсибілізацію організму у хворого 0,5-1,0мл в пробірки, оброблені 5% розчином цитА. з вираженими клінічними проявами атопічного рату натрію, розводять 0,15М розчином NaCl у дерматиту, з вени забрали 10,0мл крові й стабіліспіввідношенні 1:3, відбирають 5мкл крові для конзували додаванням розчину гепарину. Кров відстрольного та 5мкл крові для дослідного зразків і тоювали на протязі 45 хвилин при кімнатній темпоміщають їх у ємності для дослідження, до контпературі. Збирали верхній шар плазми, рольного зразка крові додають 10мкл 0,15М розпереносили в центрифужну пробірку з рівним чину NaCl, а до дослідного зразка крові - 10мкл об'ємом розчину Хенкса, центрифугували 7хв. при алергену, до якого визначається сенсибілізація, 1000об/хв. Після центрифугування крові, видаляли струшують, інкубують 30хв. в термостаті при 37°С, супернатант. Процедуру повторювали тричі. Після додають в ємності з дослідним та контрольним цього осад клітин ресуспендували у розчині Хенкзразками по 400мкл 3% розчину оцтової кислоти з барвником, струшують ємності, інкубують 15хв. са, доводили концентрацію до 2 106. Всі подальші при 18-25°С, підраховують вміст лейкоцитів у досдослідження виконували в 2-х паралелях для чого лідній та контрольній ємностях, визначають рівень в 4 пробірки вносили по 0,2мл суспензії клітин. сенсибілізації організму як відношення різниці (коДодавали в дві з пробірок 0,2мл контрольного нтроль-дослід) до контролю, і при результатах алергену, а в дві інші - 0,2мл алергену відносно обчислення, більших за 0,09, встановлюють сенякого провадилось дослідження сенсибілізації. 5 16867 6 Інкубували пробірки при 37°С 30хвилин. Після цьоПісля інкубації в контрольну та дослідні пробірки го пробірки з контрольним та дослідними зразками автоматичною піпеткою внесли по 400мкл 3% розцентрифугували 5хв. при 1000об/хв. Після чину оцтової кислоти з барвником (Романовськимцентрифугування з пробірок видаляли супернаГімза). Струсили пробірки й інкубували 15хв. при тант і в них додавали 0,05мл барвника (суміш три18-25°С. Підраховували вміст лейкоцитів у дослідпанового синього з еозином). Отриману суспензію ній та контрольній пробірках за допомогою мікросчастково ресуспендували й вносили порцію сукопу в камері Горяєва. Визначали рівень сенсибіспензії з кожної з 4 -х пробірок для дослідження в лізації організму до дослідних алергенів як камеру Горяєва, а частково для виготовлення мазвідношення різниці (контроль-дослід) до контролю. ків, які фарбували за Романовським. ПідраховуваПісля обчислення, встановили, що рівень сенсибіли в кожній з пробірок відсоток живих (незабарвлізації до алергенів ківі, свинини, молока, пшеничлених) і мертвих (забарвлених) лейкоцитів на 200 ного борошна, яєць курки, відповідно становив: клітин в камері Горяєва. Підраховували кількість 0,30; 0,27; 0,50; 0,19; 0,10; 0,32, а до інших алергелейкоцитів в мазку, фарбованому за Романовсьнів, відповідно 0; 0,08; 0,07; 0,09. Таким чином ким. Вираховували цитотоксичний індекс за форпричинно-значущими алергенами визначені ті, що мулою відношення різниці відсотка живих клітин в були вищі за 0,09, тобто алергени ківі, свинини, контролі без алергену та живих клітин з алергеном молока, пшеничного борошна, яєць курки. На видо різниці відсотку полінуклеарів у суспензії лейзначення 10 причинно-значущих алергенів витракоцитів за мазком, забарвленим за Романовським тили 1 годину 37 хвилин. Через 2 тижня після ввета відсотку живих клітин в контролі без алергену, дення гіпоалергенної дієти з виключенням помноженого на відношення 100 відсотків до відпричинно-значущих алергенів, стан хворого норсотку полінуклеарів суспензії лейкоцитів, що забамалізувався. рвлені за Романовським. На визначення 10 приВикористання способу, що заявляється дає чинно-значущих алергенів витратили 5 годин 35 можливість провадити дослідження специфічної хвилин. Встановили, що серед 10 алергенів, до сенсибілізації організму в незначному об'ємі крові. яких визначалась сенсибілізація, причинноКров може бути відібрана з пальця, при цьому значимими були алергени: кукурудзи, картоплі, можливо визначення сенсибілізації одномоментно цукру, моркви. Призначення гіпоалергенної дієти, до 100 й більше причинно-значущих алергенів. що виключала причинно-значимі алергени не зміВідсутність етапу відмивання суспензії лейкоцитів нили вираженість клінічної карти атонічного дерзменшує втрати клітин та прискорює виконання матиту у хворого на протязі місяця, що свідчило реакції, що особливо важливе в термінових випадпро невідповідність способу виявлення специфічках та при визначенні значної кількості причинноної сенсибілізації організму до ймовірних алергенів значущих алергенів. Розведення крові дає можлияк причинно-значущих. вість відбирати у досліджуваного меншу кількість Приклад 2 крові та не виконувати досить тривалий та травДля оцінки сенсибілізації організму до 10 алематичний для клітин етап відмивання, проте дає ргенів (молока, курки, яєць, свинини, ківі, вишень, можливість залишити суміш лейкоцитів в аутоплалимонів, пшеничного борошна, бананів), які ймовізмі, що створює значно фізіологічніші умови досрно могли викликати гіперсенсибілізацію організліду. Використання цитрату натрію нівелює ймовіму, у хворого Б. з діагнозом: „Обструктивний бронрне пошкодження гепарином нейтрафілоцитів. хіт”, з пальця через 3 години після їжі забрали Література 0,5мл крові в пробірку, що оброблена 5% розчи1. Скрипкин Ю.К., Сомов Б.А., Бутов Ю.С. Алном цитрату натрію. Зібрану кров розвели розчилергические дерматозы, М.: Медицина, 1975. ном 0,15М NaCl у співвідношенні 1:3. За допомос.54. гою автоматичних піпеток відібрали 5мкл крові й 2. Клиническая иммунология и алергология. помістили в пробірку для контролю. По 5мкл крові T.1: /Под ред. Л.Йегера. -2-изд., переработанное и помістили в кожну з пробірок для дослідження седополненное. -М.: Медицина, 1990. -528с. нсибілізації до 10 конкретних ймовірних причинно3. Посібник з експериментально-клінічних досзначущих алергенів. У пробірку з контрольним ліджень в фармакології, біології та медицині зразком крові внесли 10мкл 0,15М розчину NaCl. В /Беркало Л.В., Бобович О.В., Боброва М.О. та інші; кожну з дослідних пробірок внесли 10мкл алергеПід ред. Кайдашева І.П., Соколенко В.М., Катруну, до якого визначалася сенсибілізація. Пробірки шова О.В. -Полтава, 1997.- 271с. струсили й інкубували 30хв в термостаті при 37°С. Комп’ютерна верстка Л.Литвиненко Підписне Тираж 26 прим. Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601