Спосіб отримання пухлиноспецифічного фактора переносу

Спосіб отримання пухлиноспецифічного препарату фактора переносу, що включає використання низькомолекулярного екстракту лімфоцитів селезінки (спленоцитів) тварин, який відрізняється тим, що джерелом для отримання фактора переносу є неуражені клітини щурячої селезінки, в яку попередньо за 7 діб трансплантовано пухлину. (19) (21) a200504315 (22) 06.05.2005 (24) 15.09.2006 (46) 15.09.2006, Бюл. № 9, 2006 р. (72) Фільчаков Феодосій Вікторович, Бобро Леонід Іванович, Шуміліна Катерина Станіславівна, Гріневич Юрій Якимович (73) ІНСТИТУТ ОНКОЛОГІЇ АКАДЕМІЇ МЕДИЧНИХ НАУК УКРАЇНИ 3 16938 4 Недоліком найближчого аналогу є неможлитягом 25 хвилин при 400g. Після ультрафільтрації вість отримання з клітин селезінки інтактних мивміст загального білку складав: ФП-7 - 2мкг/мл; шей ФП із пухлиноспецифічними властивостями. ФП, отриманий на 14 добу росту пухлини, (ФП-14) В основу корисної моделі покладено задачу - 9мкг/мл; ФП, отриманий на 25 добу росту пухлистворення способу отримання пухлиноспецифічни, (ФП-25) - 0,5мкг/мл. Отриману низькомолекуного ФП шляхом його виділення з нетрадиційного лярну фракцію стерилізували за допомогою мікджерела - неуражених клітин щурячої селезінки, в рофільтрації через мембрану з діаметром пор яку трансплантовано пухлину, що в перспективі 0,22мкм ("Millipor", США). розфасовували в стеридасть можливість отримати препарат, який може льні ампули і зберігали при -20°С для подальшого бути використаний в імунотерапії онкологічних тестування. хворих. Підтвердження пухлиноспецифічної активності Поставлена задача вирішується наступним препаратів ФП по відношенню до алогенних клітин чином. КГ в системі in vitro отримано в тесті інгібіції приВ селезінку інтактним щурам трансплантують липання макрофагів (ІПМ) в присутності тестпухлину об'ємом 1мм3. На 7-25 добу після транспантигену -пухлинних клітин КГ [13]. В системі in лантації під ефірним наркозом тварин умертвляvitro проведено скринінг зразків ФП, отриманих від ють та видаляють неушкоджені пухлинним процетварин-пухлиноносіїв в різні строки росту КГ в сесом частини селезінки. Їх піддають механічній лезінці, в залежності від концентрації загального дезінтеграції та фільтрації крізь капронове сито. білку в цих препаратах. Показано, що стабільно позитивний результат в тесті ІПМ (гальмування Стандартну кількість лімфоцитів (5 108 клітин) в адгезії більш, як на 20%) реєструється при оцінці 0,5мл ізотонічного розчину NaCl піддають п'ятиразразків ФП-7 та ФП-14 (індекс прилипання (ІП) в зовому замороженню-відтаненню відповідно при – присутності пухлинних антигенів складає 75% та 20°С/+37°С. В'язкість екстрактів клітин зменшують 70% відповідно). Такий характер реакції є антигенза допомогою інкубації з ДНК-азою, активованою залежним, оскільки ці препарати за відсутності іонами магнію на протязі 30хв при 37°С, після чого тест-антигену не впливають на рівень адгезії резразки центрифугують при 5000g 20 хвилин і ультзидентних макрофагів. В той же час, макрофаги рафільтрують. Ультрафільтрацію проводять на перитонеального ексудату (МФПЕ), оброблені ФПконічних фільтрах "Centriflo-25" з номінальною 25, проявляли стійку тенденцію до посилення адвідсічною молекулярною вагою 25кД ("Amicon", гезії в присутності тест-антигену (ІП склав 130Нідерланди) за допомогою центрифугування про135%). тягом 25 хвилин при 400g. Після ультрафільтрації Ці результати свідчать про те, що зразки ФП, в кожній з фракцій визначають вміст загального отримані до початку активного росту КГ в селезінці білку за методом Бредфорда [12] для їх стандарнелінійних щурів (до 14-ї доби), володіють імуностизації. Отриману низькомолекулярну фракцію пецифічною активністю, яка проявляється в здатстерилізують за допомогою мікрофільтрації крізь ності переносити імунну реакцію на пухлинні антимембрану з діаметром пор 0,22мкм ("Millipor", гени in vitro, на відміну від препаратів, що отримані США), розфасовують в стерильні ампули і зберіна стадії генералізації пухлинного процесу, які гають при -20°С для подальшого тестування. такою здатністю не володіють. За допомогою ФП, отриманого на 7 добу росту На підтвердження цього також свідчать репухлини в селезінці (ФП-7), вдається перенести зультати порівняльного аналізу імуноспецифічної імунну реакцію на пухлинні клітини в системі in активності ФП-7 та ФП-препарата, отриманого із vitro та in vivo. селезінки інтактних щурів (ФП-Н). В системі in vitro Прикладами реалізації заявленої корисної мопоказано, що в групі, де резиденти! МФПЕ були делі можуть вважатися результати отримання ФП оброблені ФП-7, в 100% випадків зареєстровані з клітин неураженої частини селезінки,в яку транпозитивні відповіді (ІП склав 72-80%). Такі резульсплантовано пухлину, та експериментальне підттати вірогідно відрізняються від групи, де резиденвердження пухлиноспецифічності отриманого ФП. тні МФПЕ були оброблені ФП-Н: ІП складає 77І. В селезінку інтактним щурам під ефірним 95%, а частка позитивних відповідей дорівнює наркозом трансплантували шматочок пухлини ка15%. рциноми Герена (КГ) об'ємом 1мм3. На 7, 14, 25-у В експерименті на лабораторних щурах отридобу після трансплантації під ефірним наркозом мано підтвердження можливості переносу імунної тварин умертвляли та видаляли неушкоджені пухреакції на пухлинні антигени КГ за допомогою ФП линним процесом частини селезінки (Протоколи в системі in vivo. Інтактним тваринам внутрішньо№12-24). Їх піддавали механічній дезінтеграції та венно введено ФП, отриманий окремо від тварин фільтрації крізь капронове сито. Стандартну кільіз сильною та слабкою імунною відповіддю на пухкість лімфоцитів (5 108 клітин) в 0,5мл ізотонічного линні антигени КГ за тестом ІПМ, в дозі 1пг на 1г розчину NaCI піддавали п'ятиразовому заморомаси тварини. Дослідження показали, що в тесті женню-відтаненню відповідно при -20°С/+37°С. ІПМ позитивна відповідь на пухлинні антигени В'язкість екстрактів клітин зменшували за допомо(ІП=73-78%) реєструється у тих тварин, які отригою інкубації з ДНК-азою, активованою іонами мамували ФП від щурів із сильною імунною відповідгнію протягом 30 хвилин при 37°С, після чого зраздю, і вона відсутня (ІП=95-105%) у тварин, що ки центрифугували при 5000g 20 хвилин і отримували ФП від щурів зі слабкою імунною відультрафільтрували. Ультрафільтрацію проводили повіддю. на конічних фільтрах "Centriflo-25" з номінальною Таким чином, у описаному способі джерелом відсічною молекулярною вагою 25кД ("Amicon", ТФ-поліпептидів є клітини неураженої частини сеНідерланди) за допомогою центрифугування про 5 16938 6 лезінки щура, в яку трансплантована пухлина. Ріст 6. Hana I., Vrubel J., Pekarek J., Cech K. The пухлини в імунокомпетентному органі створює influence of age on transfer factor treatment of оптимальні умови для сенсибілізації спленоцитів і cellular immunodeficiency, chronic fatigue syndrome найбільш повної реалізації продуктивної імунної and/or chronic viral infections //Biotherapy. -1996.відповіді, що надає можливість на початковій ста№9. -p.91 -95. дії пухлинного процесу отримати фактор, здатний 7. Pilotti V., Mastrorilli M., Pizza Y., De Vinci C. et переносити імунну реакцію на пухлинні антигени в al. Transfer factor as an adjuvant to non-small cell системі in vitro. Це дає підставу стверджувати, що lung cancer (NSCLC) therapy // Biotherapy. -1996. отримано пухлиноспецифічний ФП. Подальше №9. -p.117-121. дослідження властивостей пухлиноспецифічного 8. Whyte R.J., Schork M.A., Hoan A. et al. ФП дозволить отримувати препарати для імунотеAdjuvant treatment using transfer factor for рапії в післяопераційному періоді з метою профіbronchpgenic carcinoma: long-term follow-up //Ann. лактики рецидивів та метастазів у хворих онколоThorac. -1992. -V.53. -№3. -p.391-396. гічного профілю. 9. Fujisawa Т., Yamaguchi Y., Kimura Н. et al. Джерела інформації. Adjuvant immunotherapy of primary resected lung 1. Lawrence H.S., Borkowsky W. Transfer cancer with transfer factor //Cancer. -1984.- V.54. Factor - current status and future prospects p.663-669. //Biotherapy. -1996.- №9. -p.1-5. 10. Petersen E.A., Yrunberg L.E., Manzara Т., 2. Dwyer J.M. Transfer factor in the age of Kirpatrick С.Н. Murine transfer factor. 1. Discripting of molecular biology: A review //Biotherapy. -1996.the model and evidence for specificity //J. Immunol. №9.- p.7-11. 1981. -V.126. -p.2480-2484. 3. Kirkpatrick С.Н. Transfer factor //J. Allergy clin. 11. Alvarez-Thull L., Kirkpatrick CH. Profiles of Immunol. -1988.- V.81. -№5. -р.803-813. cytokine production in recipients of transfer factors 4. Viza D. AIDS and transfer factor: Myths, //Biotherapy. -1996.- №9. -p.5 5-59 (найближчий certainties and realities //Biotherapy. -1996.- №9.аналог). p.17-26. 12. Практическая химия белка: Пер. с англ. 5. Estrada - Parra S., Nagaya A., Serrano E. et /Под ред. А. Дарбре. -М.: Мир, 1989.- 623с. al. Comparative study of transfer factor and acyclovir 13. Хаитов Р.М., Пинегин Б.В., Истамов X.И. in the treatment of herpes zoster //Int. J. Экологическая иммунология. -М.: ВНИРО, -1995.Immunopharmacol. -1998.- V.20. -p.521-535. 219с. Комп’ютерна верстка Л.Литвиненко Підписне Тираж 26 прим. Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601