Спосіб визначення інсулінпродукуючих клітин

Спосіб визначення інсулінпродукуючих клітин, що полягає у фіксації шматочків підшлункової за 3 17837 4 блакитну (специфічну) зернистість інсулінпродузволяє підвищити чутливість цитохімічної реакції куючих клітин. альдегідфуксину та отримувати стабільні, у висоВідомий спосіб визначення інсулінпродукуюкому ступені порівняльні результати. чих клітин [Гольдберг Е.Д., Ещенко В.А., Бовт В.Д. Суттєвими ознаками способу є: Сахарный диабет. Этиологические факторы. - фіксування шматочків підшлункової залози в Томск: из-во Томского ун-та, 1993., С.43-44], який рідині Буена; включає: фіксування шматочків підшлункової за- доведення їх до парафіну (шляхом витримулози протягом 1 доби в рідині Буена, яка містить вання їх послідовно: в спиртах зростаючої концен15мл насиченого розчину пікринової кислоти, 5мл трації (70°-; 80°-; 90°-; 96°-ний, абсолютний), у нейтрального формаліну, 1мл льодяної оцтової двох ксилолах, в суміші 50% ксилолу та 50% пакислоти; проведення шматочків залози через: серафіну, у двох рідких парафінах; заливання в парію спиртів зростаючої концентрації (70°-ний, 80°рафін); ний, 90°-ний, 96 -ний, абсолютний по 4год. у кож- готування зрізів; ному), два ксилоли (по 15хв. у кожному, суміш 50% - перенесення зрізів безпосередньо з мікротоксилолу та 50% парафіну (протягом 30хв. при много ножа в пробірку; 37°С); заливання шматочків у парафін, приготу- депарафінування зрізів (шляхом обробки в вання зрізів, їх депарафінування, для чого зрізи пробірці ксилолами, спиртами та промивки дистипроводять через два ксилоли (по 3хв. у кожному) і льованою водою); спирти знижуваної концентрації (абсолютний, - обробка в пробірці окислювачем; 90%-ний, 80%-ний, 70%-ний - по 3хв. в кожному) та - обробка в пробірці відновником; промивають протягом 5хв. у дистильованій воді; - промивка в пробірці дистильованою водою; витримування зрізів до порудіння в окислювачі - обробка в пробірці барвником; (суміші 20мл 2,5%-ного розчину марганцевокисло- обробка зрізів у пробірці спиртом; го калію, 20мл 5%-ного розчину сірчаної кислоти - витримування зрізів у пробірці з водопровідта 80мл дистильованої води) і знебарвлення у ною водою; відновнику (2,5%-ному розчині щавлевої кислоти); - виловлювання зрізів на предметні стекла; промивання зрізів протягом 5хв. дистильованою - заключення зрізів у гліцерин-желатин; водою та забарвлення протягом 6хв. розчином - мікроскопування зрізів (на основі підрахунку у альдегідфуксіну. Для виготовлення барвника у 100 клітинах виводять середнє значення інтенсив25мл 70°-ного спирту розчиняють 250мг альдегідності цитохімічної реакції, синьо-фіолетове забарфуксину, сюди ж добавляють 75мл 70°-ного спирту влення панкреатичних клітин оцінюють за трьохта 1мл льодяної оцтової кислоти. Забарвлення бальною системою: за один бал приймають зрізів проводять у герметично закритому посуді. слабопозитивну; два бали - помірну; три бали Забарвлені зрізи 1хв. обробляють 96°-ним спирвиражену за інтенсивністю реакцію); том, промивають 5 хв. водопровідною водою і заОзнаками, відмінними від прототипу, є: барвлюють протягом 1-2хв. сумішшю Хелмі. - перенесення зрізів безпосередньо з мікротоОстання складається з 250мг ліхттрюна, 1г оранжа много ножа в пробірку; Ж, 0,5г фосфорно-молібденової кислоти, 0,5г хро- депарафінування зрізів (шляхом обробки у мотропа 2Р, 1мл льодяної оцтової кислоти та диспробірці ксилолами, спиртами та промивання дистильованої води, яку добавляють до об'єму 100мл. тильованою водою); Забарвлені сумішшю Хелмі зрізи промивають про- обробка в пробірці окислювачем; тягом 1-2хв. 0,2%-ним розчином оцтової кислоти. - обробка в пробірці відновником; Потім їх проводять через 96°-ний та абсолютний - промивка в пробірці дистильованою водою; спирти, два ксилоли (по 1-2хв. в кожному з них) та - обробка в пробірці барвником; занурюють у бальзам, диференціюють під мікрос- обробка зрізів у пробірці спиртом; копом. На препаратах зернистість острівцевих - витримування зрізів у пробірці з водопровідклітин А оранжевого, а клітин В - синьоною водою; фіолетового кольору. - виловлювання зрізів на предметні стекла; Однак цей спосіб складний (передбачає двох- заключення зрізів у гліцерин-желатин. ступеневе забарвлення), має низьку чутливість і Обробка зрізів у пробірці дозволяє: уникнути не дозволяє з високою точністю проводити дослірозправлення зрізів у воді, їх фіксування на преддження інсулінпродукуючих клітин. метному склі і підсушування на повітрі; чітко виявОзнаками, спільними з запропонованим ріляти сіро-блакитну (специфічну) зернистість і прошенням, є: фіксування шматочків підшлункової водити з високою точністю дослідження залози та доведення їх до парафіну, готування інсулінпродукуючих клітин. зрізів, депарафінування зрізів, обробка в окислюСпосіб здійснюють таким чином: вачі та відновнику, промивання дистильованою - шматочки підшлункової залози фіксують проводою, забарвлення розчином альдегідфуксину, тягом 24±5год. у рідині Буена; обробка спиртом, промивання водопровідною во- доводять їх до парафіну / шляхом витримудою, заключення у середовище та мікроскопічне їх вання послідовно: в спиртах зростаючої концентдослідження. рації (70°-; 80°-; 90°-; 96° -ний, абсолютний протяВ основу корисної моделі поставлено задачу гом 4±0,5год у кожному), у двох ксилолах (по 15хв. розробити спосіб визначення інсулінпродукуючих у кожному), в суміші 50% ксилолу та 50% парафіну клітин, який шляхом почергової обробки зрізів піпри 40±2°С протягом 30±2хв., у двох рідких парадшлункової залози в пробірці ксилолами, спиртафінах по 2±0,5год. у кожному при температурі ми, окислювачем, відновником та барвником до60±3°С, занурювання в парафін; 5 17837 6 - готують зрізи товщиною 5±1мкм і безпосереобробки у пробірці двома ксилолами (по 3±0,5хв у дньо з мікротомного ножа переносять їх у кожному), спиртами концентрації, що знижується пробірку; (абсолютний; 90°-ний; 80°-ний; 70°-ний протягом - депарафінують зрізи (шляхом послідовної 3±0,5хв. у кожному, промивання дистильованою обробки у пробірці двома ксилолами (по 3±0,5хв у водою 5±0,5хв); витримували у пробірці до порукожному), спиртами концентрації, що знижується діння в окислювачі (суміш 20мл 2,5%-ного розчину (абсолютний; 90°-ний; 80°-ний; 70°-ний протягом марганцевокислого калію, 20мл 5%-ного розчину 3±0,5хв. у кожному), промивання дистильованою сірчаної кислоти та 80мл дистильованої води); водою 5±0,5хв); знебарвлювали у пробірці у відновнику (2,5%-ному - витримують у пробірці до порудіння в окисрозчині щавлевої кислоти); промивали у пробірці лювачі (суміш 20мл 2,5%-ного розчину марганцедистильованою водою 5±0,5хв.; зрізи у пробірці вокислого калію, 20мл 5%-ного розчину сірчаної забарвлювали розчином альдегідфуксину протякислоти та 80мл дистильованої води); гом 6±0,5хв., для виготовлення якого у 25мл 70°- знебарвлюють у пробірці у відновнику (2,5%ного спирту розчиняли 250мг альдегідфуксину, ному розчині щавлевої кислоти); сюди ж добавляли 75мл 70°-ного спирту та 1мл - промивають у пробірці дистильованою водою льодяної оцтової кислоти; обробляли у пробірці 5±0,5хв.; протягом 1±0,2хв. 96°-ним спиртом; витримували у - зрізи у пробірці забарвлюють розчином альпробірці 5±0,5хв. у водопровідній воді; виловлюдегідфуксину протягом 6±0,5хв., для виготовлення вали зрізи на предметні стекла, для чого спочатку якого у 25мл 70°-ного спирту розчиняють 250мг вміст пробірки виливали в чашку Петрі з водопроальдегідфуксину, сюди ж добавляють 75мл 70°відною водою; зрізи заключали в гліцеринного спирту та 1мл льодяної оцтової кислоти; желатин. - обробляють у пробірці протягом 1±0,2хв. 96°У контрольної (інтактної) миши на препаратах ним спиртом; інсулінпродукуючі клітини забарвлювалися в си- витримують у пробірці 5±0,5хв. у водопровідньо-фіолетовий колір. Середня інтенсивність циній воді; тохімічної реакції складала 1,4±0,11 умовних оди- виловлюють зрізи на предметні стекла, для ниць (р