Спосіб визначення цитотоксичної активності природних кілерних клітин

Завантажити PDF файл.

Формула / Реферат

Спосіб визначення цитотоксичної активності природних кілерних клітин, що включає виділення природних кілерних клітин, інкубацію їх з культурою клітин-мішеней К-562 та обробку цих клітин флуорохромом з доданням до живильного середовища пропідію йодиду та подальшим аналізом проб на проточному цитофлуориметрі, який відрізняється тим, що як флуорохром використовують флуоресцеїнізотіоціанат у дозі 0,45-0,55 мкг/мл, а досліджувані проби фіксують за допомогою 70% етилового спирту.

Текст

Винахід стосується медицини, а саме імунології, і може застосовуватись для визначення цитотоксичної активності природних кілерних клітин (ПКК) з метою оцінки функціонального стану імунної системи людини. Спосіб визначення активності ПКК необхідний для виявлення або моніторингу порушень ПКК - одного з основних показників природної резистентності організму людини при різних патологіях. Відомі способи визначення активності ПКК полягають в одержанні ПКК та дослідженні їх цитотоксичної активності проти пухлинних клітин К-562 із застосуванням цитофлуориметричного методу (Пат. №2109288 RU, МПК G01N33/52. Способ определения естественной киллерной активности лимфоцитов человека в условиях гипербарии, 1998; Аточина О.В., Неустроев А.П. Изучение активности естественных киллеров периферической крови человека радиоиммунным методом и с помощью проточной цитофлуориметрии // Цитология. - 1995. - Т.37, № 9/10. - С. 853-858). Однак, ці способи не є оптимальними та зручними в роботі, не дозволяють тривалий час зберігати проби. Також відомий і спосіб визначення активності ПКК, що полягає у традиційному виділенні цих клітин, інкубації їх з культурою клітин-мішеней К-562. Культура клітин К-562 окремо обробляється флуорохромом 3,3'dioktadecyloxacarbocianine perchlorate (DIO), розчиненим в диметил сульфоксиді ( 10ml 3mM DIO), який дає зелене забарвлення. В живильне середовище для інкубації клітин-мішеней і ПКК додають другий флуорохром пропідій йодид, який проникає тільки у мертві клітини і дає червоне світіння. Проводять інкубацію клітин-мішеней К-562 і ПКК протягом 2год. Після закінчення реакції проби аналізують на проточному цитофлуориметрі (FACScan, Becton Dickinson), визначаючи кількість живих та мертвих клітин-мішеней і вираховують індекс цитотоксичності, який і є показником цитотоксичної активності ПКК (Chang L., Gusewitch G. A, Chritton D.B.W. at all. Rapid Flow cytometric assay for the assessment of natural killer cell activity // J. Immunol. Method. - 1993. - Vol.166. - P.45-54). Однак, цей спосіб є малодоступним через застосування дорогого реактиву (DIO), неможливості застосовувати його для фіксованих клітин та необхідності проведення цитофлуориметрії проб відразу після постановки реакції. Разом з тим, такі проби не можуть довго зберігатись, оскільки знижується їх інтенсивність флуоресценції та життєздатність клітин-мішеней. В основу даного винаходу поставлена задача розробити такий спосіб визначення цитотоксичної активності ПКК, в якому обробка клітин-мішеней К-562 здійснюється флуорохромом флуоресцеїнізотіоцианатом (ФІТЦ) при певних умовах, що дозволяє зберігати проби у фіксованому стані без зниження інтенсивності флуоресценції та життєздатності клітин-мішеней. Поставлена задача досягається тим, що у способі визначення активності природних кілерних клітин, що включає виділення природних кілерних клітин, інкубацію їх з культурою клітин-мішеней К-562 та обробку цих клітин флуорохромом з доданням до живильного середовища пропідія йодиду та подальшим аналізом проб на проточному цитофлуориметрі, згідно винаходу, в якості флуорохрому використовують флуоресцеїнізотіоцианат у дозі 0,45-0,55мкг/мл, а досліджувані проби фіксують за допомогою 70% етилового спирту. До такого рішення автори прийшли після проведення серії контрольних експериментів з виявлення можливості тривалого збереження проб та ефективності зв'язування флуорохромів з цитоплазматичними білками фіксованих клітин. Виявлено, що ФІТЦ дає достатню інтенсивність флуоресценції для фіксованих клітин К-562. Підібрана концентрація 0,45-0,55мкг/мл є оптимальною, нетоксичною для клітин-мішеней та не впливає на їх життєздатність. Менша ж доза знижує інтенсивність флуоресценції, а більша погіршує життєздатність клітин або негативно впливає на якість та чутливість аналізу на проточному цитофлуориметрі. Фіксація клітин 70% етиловим спиртом дозволяє зберігати їх без втрати інтенсивності флуоресценції протягом 4 тижнів за температури 4°С. Запропонований авторами флуорохром є доступним як за ціною, так і наявністю в продажу та дозволяє зберігати проби протягом 4 тижнів без зниження інтенсивності флуоресценції. Спосіб здійснюється таким чином. Виділення ПКК проводили традиційним методом. Для визначення активності ПКК користувались методом з використанням 2-ох флуорохромів: ФІТЦ ("Sigma", США), яким мітяться клітини-мішені та пропідіум йодид ("Sigma", США), який забарвлює мертві клітини. Як мішені для ПКК використовували клітини мієлолейкозу людини К-562, які культивували in vitro в повному живильному середовищі RPMI-1640 за температури 37°С шляхом періодичного пасажу у поновлене повне живильне середовище. До клітин-мішеней був доданий розчин флуорохрома ФІТЦ в кінцевому розведенні 0,5мкг/мл. Після цього клітини інкубували протягом 1год у термостаті за температури 37°С. Робочий розчин пропідіум йодиду був доданий до повного живильного середовища в кінцевій концентрації 0,5мкг/мл. Лімфоцити та клітини-мішені К-562 були змішані у співвідношенні 20:1. Проби були поставлені у триплетах. Для утворення кон'югатів пробірки центрифугували при 1500об/хв. протягом 7хв. за кімнатної температури та витримували протягом 10хв. в термостаті за температури 37°С і обережно ресуспендували. Проби інкубували протягом 4 годин за температури 37°С в атмосфері 5% CO2. Помічені флуорохромом ФІТЦ контрольні клітини-мішені інкубували в концентрації 1.105/мл робочого середовища, що містив пропідіум йодид для перевірки на наявність спонтанного їх цитолізу в культурі. Після закінчення інкубації в пробірки додавали розчин Генкса і центрифугували протягом 7хв при 1500об/хв. Осад на дні пробірки ресуспендували в 0,1мл розчині Генкса з ЕДТА. Для фіксації клітин використовували етиловий спирт 70°. Перед проведенням проточної цитофлуориметрії клітини відмивали розчином Генкса і до осаду додавали 1 мл цього розчину. Цитофлуориметричний аналіз проводили за допомогою приладу FACStar ("Becton Dickinson", США), обладнаний аргоновим лазером за довжини хвилі 488нм. Інтенсивність флуоресценції від двох флуорохромів реєстрували, використовуючи квадрантичну систему dot/plot. Цито токсичну активність ПКК визначали як різницю числа мертвих клітин-мішеней К-562 у дослідній та контрольній пробах, виражену у відсотках від числа цих клітин в дослідній пробі. Приклад. У пацієнта проводять забір периферичної крові, виділяють ПКК та інкубують їх у живильному середовищі, який містить пропідій йодид, з попередньо обробленими флуорохромом ФІТЦ у дозі 0,5мкг/мл клітинамимішенями К-562. Після сумісної інкубації ПКК і клітин-мішеней проби фіксують 70% етиловим спиртом. Проби зберігають протягом 4 тижнів за температури 4°С та в подальшому аналізують за допомогою проточної цитофлуориметрії. Після фіксації та зберігання проби не втратили інтенсивності флуоресценції. Це дало змогу достовірно оцінити функціональний стан імунної системи пацієнта. Таким чином, спосіб простий у виконанні, доступний, безпечний, дає змогу фіксувати клітини та зберігати їх протягом 4 тижнів без зниження якості та чутливості аналізу за допомогою проточної цитофлуориметрії.

Дивитися

Додаткова інформація

Назва патенту англійською

Method of determining cytotoxic activity of natural killer cells

Автори англійською

Zamotaieva Halyna Anatoliivna, Zakharchenko Tamara Fedorivna, Zak Kostiantyn Petrovych

Назва патенту російською

Способ определения цитотоксической активности естественных подавляющих клеток

Автори російською

Замотаева Галина Анатольевна, Захарченко Тамара Федоровна, Зак Константин Петрович

МПК / Мітки

МПК: C12N 5/08, G01N 33/48, G01N 21/64

Мітки: клітин, активності, природних, цитотоксичної, спосіб, кілерних, визначення

Код посилання

<a href="https://ua.patents.su/2-66082-sposib-viznachennya-citotoksichno-aktivnosti-prirodnikh-kilernikh-klitin.html" target="_blank" rel="follow" title="База патентів України">Спосіб визначення цитотоксичної активності природних кілерних клітин</a>

Подібні патенти