Спосіб визначення життєздатності клітин

Спосіб визначення життєздатності клітин, який включає прижиттєве забарвлення тканин трипановим синім з оцінкою результату за здатністю дифузного забарвлення клітин, який відрізняється тим, що попередньо проводять ферментативне розщеплення МІЖКЛІТИННИХ контактів і відділення окремих клітин із ізольованого тканинного субстрату з наступним виготовленням і дослідженням мікропрепарату Винахід стосується медико-бюлопчних дисциплін, зокрема, цитології і гістологи, і може бути використаний у лабораторній діагностиці Відомий спосіб визначення життєздатності клітин, який включає прижиттєве забарвлення тканин трипановим синім з оцінкою результату за здатністю дифузного забарвлення [1] За відомим способом розчин барвника проникає в тканини організму експериментальної тварини, після чого з бюптату готують мікропрепарат, який досліджують у полі зору світлового мікроскопу, а висновок про рівень життєздатності клітин здійснюють за ступенем їх забарвлення Недоліком відомого способу є недостатній рівень технологічності, точності, а отже — інформативності Технологічна складність цього способу полягає втому, що в експерименті використовують живих тварин, що обумовлює низку технологічних незручностей У відомому способі недостатньо високий рівень точності, який зумовлений дослідженням сукупності клітин в межах тканинного субстрату, а не окремих клітин, що з однієї сторони затруднює дослідження клітин, а з іншої — знижує точність остаточного результату В основу винаходу поставлено завдання вдосконалити відомий спосіб, в якому шляхом попереднього виділення окремих клітин із тканин організму та наступним їх забарвленням досягають підвищення технологічності і точності, а отже — інформативності лабораторного дослідження як такого Поставлене завдання вирішують тим, що у відомому способі визначення життєздатності клітин, який включає прижиттєве забарвлення тканин трипановим синім з оцінкою результату за здатністю дифузного забарвлення клітин, у ВІДПОВІДНОСТІ до винаходу попередньо проводять ферментативне розщеплення МІЖКЛІТИННИХ контактів і відділення окремих клітин із ізольованого тканинного субстрату з наступним виготовленням і дослідженням мікропрепарату Конкретно спосіб здійснюють таким чином Ізольований тканинний клапоть поміщають в 0,25% розчин трипсину з рН 1,2-1,А і витримують у термостаті при 37°С протягом 2,5 — 3 год Після цього отриману суспензію центрифугують при 1000 о б 1 протягом 5 хв, а з осаду готують мазок на предметному склі з наступним фарбуванням 0,4% розчином трипанового синього на буферному розчині з рН 7,2-7,4 протягом 3 — 5 хв Готовий мікропрепарат досліджують у світловому мікроскопі при збільшенні 900 (ок х 15, об'єктив х 60) шляхом визначення процентного співвідношення забарвлених (нежиттєздатних) і незабарвлених (життєздатних) клітин Приклад 1 Свіжовзятий клапоть шкіри помістили в 0,25% розчин трипсину на фосфатному буфері з рН 7,4 в термостаті при температурі 37°С на 2,5 год Через ЗО хв ВІДДІЛИЛИ дерму від епідермісу, який подрібнювали на частинки розміром 1 х 1 мм Промиту фосфатним буфером суспензію окремо виділених епідермоцитів центрифугували в сироватці при 1000 об 1 протягом 5 хв, а з осаду готували мазки на предметному склі, які фарбували 0,4% розчином трипанового синього , Готовий мікропрепарат досліджували у світловому мікроскопі при збільшенні 900 (ок х 15, об'єктив х 60) і визначали про О о 44040 центне співвідношення забарвлених (А) і незабарвлених (Б) клітин Показник 98% не зафарбованих епідермоцитів свідчить про життєздатність шкіри (Фіг) Приклад 2 Крюконсервований аутодермотрансплантат промивали фосфатним буфером та шкубували в 0,25% в розчині трипсину на фосфатному буфері з рН 7,4 в термостаті при температурі 37 °С протягом 2,5 год Після відокремлення дерми епідерміс розрізали на дрібні частинки розміром 1x1 мм Суспензію окремо розділених епідермоцитів промивали буферним розчином і центрифугували в сироватці при 1000 об"1 протягом 5 хв 3 нижньої фракції виготовляли мазки, які зафарбовували 0,4% розчином трипанового синього і фіксували в 96% спирті Мікропрепарат досліджували у світловому мікроскопі при збільшенні 900 (ок х 15, об'єктив х 60) та підраховували КІЛЬКІСТЬ зафарбованих і не зафарбованих епідермоцитів Високий показник — 82% незабарвлених живих клітин — свідчить про високу життєздатність клітин даного аутодермотрансплантату Як видно з наведених прикладів, запропонований спосіб з достатньо високим рівнем точності та інформативності дозволяє визначити життєздатність клітин Він суттєво переважає спосібпрототип за рівнем технологічності і точності, а отже — інформативності Джерело інформації, яке слід взяти до уваги 1 Кисели Дьердь Практическая микротехника и гистохимия Будапешт -1962 г-400 с ФІГ. 1 ДП «Український інститут промислової власності» (Укрпатент) вул Сім'ї Хохлових, 15, м Київ, 04119, Україна (044) 456 - 20 - 90