Спосіб збагачення посівного матеріалу при бактеріологічній діагностиці туберкульозу тварин і птахів

Пропонуємий винахід відноситься до ветеринарної медицини і може бути використаний для діагностики туберкульозу сільськогосподарських тварин (великої рогатої худоби, коней, буйволів, овець, кіз, пушних звірів, собак, котів) і птиці. Він може застосовуватись у науково-дослідних установах, учбових закладах, біофарбиках і виробничих лабораторіях (районних, обласних і республіканських) ветеринарного профілю для бактеріологічної діагностики туберкульозу. Бактеріологічні методи діагностики туберкульозу відомі (Лабораторные исследования в ветеринарии. Под ред. В.Я. Антонова и П.Н. Блинова. М., 1971, с. 85-91; Эпизоотология. Под ред. П.Ф. Сысоева. М., 1974, с. 115; Ф. Гутира и соав. Частная патология и терапия домашних животных. М., 1961. т. 1, кн. 2, с. 164-165). Головним недоліком цих методів є досить тривалий час росту колоній мікобактерій туберкульозу на твердих поживних середовищах. При цьому колонії росту появляються через 10-30 днів після посіву, або через 3-4 тижні, а іноді і через 3 місяці. Відомий також "Способ обогащения посевного материала при бактериологической диагностике туберкулеза крупного рогатого скота" (авт. св. СССР №1367495, з грифом "Т", автор винаходу професор Μ.Φ. Запорожець). Суть даного способу полягає в тому, що у відомий метод збагачення патологічного матеріалу мікобактеріями (метод флотації) введена додаткова стадія фентрифугування осаду при 7000-12000g в присутності розчинів сульфату магнію-калію або пірофосфату калію гідрату на протязі 90-140 хвилин. Після обробки матеріал засівають на поживне середовище. Видимі колонії росту появляються через 4-9 діб після посіву. Одначе даний спосіб має ряд Істотних недоліків: 1) розтягнутий у часі період росту після посіву туберкульозних паличок, що сягає 4-9 днів; 2) крім мікобактерій туберкульозу можуть проростати інші мікроорганізми, які часто-густо перешкоджають вірогідності візуальної діагностики; 3) досить тривалий час центрифугування - 90-140 хвилин; 4) стримування використання способу в прикладних аспектах із-за дефіциту сульфату магнію-калію і пірофосфату калію гідрату. В основу пропонуємого винаходу покладено завдання; створити такий спосіб бактеріологічної діагностики туберкульозу: тварин і птиці, за допомогою якого забезпечується; - скорочення (до 20-36 годин) часу росту мікобактерій туберкульозу; - внесення до осаду таких реагентів, які б згубно діяли на сторонню мікрофлору і одноразово були б індиферентними для туберкульозних паличок, з метою одержання чистої культури мікобактерій туберкульозу; - скоротити термін центрифужної обробки осаду паличок туберкульозу; - замінити дефіцитні реагенти на більш доступні; - різко прискорити "ростові" процеси туберкульозних паличок на поживному середовищі. Ці суттєві ознаки поставленого завдання досягаються тим, що від тварин, які дали позитивну реакцію на туберкулін, загальноприйнятим методом відбирають патологічний матеріал, гомогенізують його і добавляють 5% розчин сірчаної кислоти. Одержану суспензію мікроорганізмів у розчині переносять у центрифужні пробірки і центрифугують для одержання осаду мікобактерій (до цього моменту технічні прийоми взяті Із відомого методу). До цього осаду добавляють 5-8% розчин суміші азотної і соляної кислот у співвідношенні 1:3, перемішують вмістиме пробірки і центрифугують при 2500g на протязі 6-8 хвилин. Такий прийом необхідний для одержання культури туберкульозних паличок чистої від посторонніх домішок інших видів мікроорганізмів. Після центрифугування надосадкову рідину виливають, а осад промивають фізіологічним розчином з послідуючим центрифугуванням при 2500g на протязі 6-8 хвилин. Надосадкову рідину знову видаляють, а до осаду вносять 0,4-0,5% розчини хлориду натрію і 0,45-0.55% розчини хлориду калію у співвідношенні 1:1, перемішують і одержану суспензію центрифугують при 13000 -18000g на протязі 40-80 хвилин при температурі 45°С з послідуючим видаленням надосадкової рідини і посівом мікобактерій осаду на тверде поживне середовище. Вирощування ведуть в термостаті при 38°С. Візуальний облік появи перших колоній росту туберкульозних паличок проводять загальноприйнятим методом. Одержані дані порівнюють з результатами контролю (авт, св. №1367495). Усі технічні операції виконують з додержанням умов стерильності. Спосіб реалізується конкретними прикладами. Приклад 1. Від корів, які дали позитивну реакцію на туберкулін, загальноприйнятим методом відбирають патологічний матеріал, наприклад заглоткові, бронхіальні чи середньо-стінні лімфатичні вузли, або ж беруть, наприклад, проби молока. На вагах зважують 4 наважки, по 1 г в кожній, одного із видів матеріалу. Тканину (1 г) подрібнюють ножицями, потім вносять кожну наважку в 4 фарфорові ступки, куди добавляють по 4 мл 5% розчину сірчаної кислоти і ретельно розтирають пестиком. Одержану суспензію тканини з мікобактеріями туберкульозу кількісно переносять в 4 центрифужні пронумеровані пробірки (ємність кожної по 10 см3) центрифуги ЦЛС-31. Вмістиме пробірок центрифугують на протязі 10 хвилин при 3000 об/хв. Потім надосадкову рідину зливають і в кожну посудину вносять по 8 мл фізіологічного розчину і знову центрифугують при вказаних параметрах. Після промивання гомогенату одержують осад, тобто збагачений посівний матеріал, який містить мікобактерії з можливими домішками мікрофлори Інших видів. Для знешкодження останніх у кожну пробірку наливають по 8 мл 5% розчину суміші азотної і соляної кислот у співвідношенні 1:1 і центрифугують при 2500g на протязі 6 хвилин. Одержаний осад промивають фізіологічним розчином (в кожну пробірку наливають по 8 мл і центрифугують при 2500g 6 хвилин). Одержують осад мікобактерій (перша пробірка для контролю). В подальшому підготовку мікобактерій для контролю проводять згідно способу (авт. св. №1367495). В решту пробірок наливають по 8 мл 0,4% розчинів хлориду натрію і 0,45% хлориду калію у співвідношенні 1:1. Вмістиме посудин перемішують скляними паличками. Пробірки нумерують 1 вмістиме центрифугують при різнойменному відносному центрифужному прискоренні (ВЦП) і постійному часі при 45°С(температуру підтримують терморегуляторами центрифуги). Після центрифугування надосадкову рідину Із пробірок виливають. Одержані осади з кожної посудини, в тому числі і першої контрольної, загальноприйнятими методами засівають в 10 пробірок Із поживним середовищем Петраньяні. Засіяні середовища в пробірках вносять в термостат при 38°С. Візуальний облік появи перших колоній росту мікобактерій на поживному середовищі в пробірках проводять загальноприйнятим методом. По 10 пробірках визначають середню кількість колоній. Усі технічні операції виконують з додержанням стерильності. Порівнювальні дані прискореного росту мікобактерій наведені в табл. 1. Приклад 2. Спосіб виконується аналогічно прикладу 1, але до осаду вносять суміш розчинів хлориду натрію 0,5% і хлориду калію 0,55% в тому ж співвідношенні і в тих же кількостях, але вмістиме 2,3 і 4 пробірок центрифугують при постійному значенні ВЦП (15500g) і різних термінах (40, 60 і 80 хв). Підготовку матеріалу в контрольній пробірці ведуть згідно авт. св. №1367495. Порівнювальні дані по прискореному рості мікобактерій наведені в табл. 2. Приклад 3. Спосіб виконується аналогічно прикладу 1 за виключенням того, що тут замість лімфатичних вузлів великої рогатої худоби беруть наважки печінки курей (шляхом проведення патологічного розтину трупу птиці після смерті або після вимушеного забою при підозрюванні у захворюванності на туберкульоз) хворих туберкульозом (як правило, у курей при туберкульозі першочерговою патолого-анатомічною ознакою після розтину є генералізована форма враження печінки мікобактеріями туберкульозу пташиного виду), і друге виключення до прикладу 1 - до осаду в другу, третю і четверту пробірок вносять по 8 мл суміші розчинів 0,45% хлориду натрію і 0,5% хлориду калію у співвідношенні 1:1. Параметри центрифугування аналогічні прикладу 2 (табл. 2). Порівнювальні дані прискореного росту туберкульозних паличок птиці наведені в табл. 3. Таким чином, використання способу дає можливість різко скоротити термін росту посівного матеріалу - до 20-36 годин (згідно авт. св. № 1367495 - 4-9 діб; згідно Іншим відомим способам - 29-36 діб).