Спосіб лабораторної діагностики туберкульозу тварин

Изобретение относится к области ветеринарной микробиологии, в частности к лабораторной диагностике туберкулеза животных, и может быть использовано в ветеринарных и медицинских бактериологических лабораториях для обнаружения возбудителя туберкулеза. Известен способ диагностики туберкулеза, который вошел в лабораторную практику как метод Левенштейна-Гона [1]. Данный способ выбран в качестве прототипа, Он заключается в том, что ткань измельчают в стерильной ступке ножницами, растирают со стерильным песком или битым стеклом и заливают 3-6% раствором серной кислоты в соотношении 1 ;4, затем центрифугируют 10-15 минут при 3000 мин-1 (общая экспозиция воздействия кислотой не должна превышать 20-30 мин). Жидкость сливают, осадок несколько раз отмывают стерильным раствором 0,85% хлористого натрия и используют для посева и приготовления мазков. В последние годы стараются использовать наиболее щадящие методы обработки материала, т.е. применять растворы кислот, щелочей и других химических веществ как можно в меньших концентрациях, воздействовать менее продолжительное время. Это объясняется тем, что химические вещества в определенной мере оказывают отрицательное воздействие на жизнеспособность микобактерий. Доказательством служат данные различных авторов о повреждающем действии кислот и щелочей на микобактерии туберкулеза, для наглядности сведенные в таблицу 1, заимствованную из монографии Майснер и Шмиделя. Из материалов, приведенных в таблице, видно, что кислоты и щелочи оказывают значительное повреждающее воздействие на микобактерии. Использование же более низких концентраций или меньшая экспозиция не всегда возможны, так как не обеспечивается уничтожение посторонней микрофлоры, которой может быть контаминирован материал по своей природе или в процессе его отбора и транспортировки. Задача предлагаемого способа лабораторной диагностики туберкулеза животных - упрощение методики исследования и повышение результативности бактериологической диагностики туберкулеза за счет более щадящего метода обработки материала. Эта задача становится особенно актуальной в связи с наличием большого количества хозяйств, где животные инфицированы атипичными микобактериями. Обусловленные общностью антигенного строения микобактерии перекрестные иммунологические реакции, вызванные атипичными микобактериями с одной стороны затрудняют интерпретацию результатов аллергической диагностики туберкулеза, с другой стороны выделение атипичных микобактерии существующими методами бактериологических исследований не всегда надежно. Поданным Engbek, 1964 по сравнению с микобактериями туберкулеза, атипичные микобактерии обладают несколько пониженной кислото- и щелочеустойчивостью, что приводит их к гибели при обработке материала классическими методами. Использование предлагаемого способа лабораторной диагностики туберкулеза животных обеспечивает по сравнению с существующими следующие преимущества: - значительное упрощение методики исследования, т.к. не требуется дополнительное отмывание исследуемого материала от кислот и щелочей; - повышение результативности бактериологической диагностики туберкулеза и сокращение сроков исследований за счет более щадящего метода обработки материала; - улучшение условий техники безопасности за счет уменьшения манипуляции с патологическим материалом при его обработке и исключения использования высоких концентраций кислот и щелочей. В способе лабораторной диагностики туберкулеза животных, включающем гомогенизацию патологического материала, центрифугирование, посев на питательные среды и приготовление мазков для бактериоскопии, обработку материала проводят более щадящим методом с использованием раствора, которому мы дали специальное название "Одессоль", содержащим в своей основе неионогенное поверхностно-активное вещество, например, твин 80 в концентрации 0,03-0,07%, приготовленном на 0,5% едком натре. Раствор способствует освобождению микобактерии из тканей и отделению их от некислотоупорных микроорганизмов. Посев и приготовление мазков проводят бактериологической петлей с поверхностной пленки надосадочной жидкости, образующейся после центрифугирования суспензии материала, Сущность способа заключается в том, что раствор едкого натра в 0,5% концентрации, не оказывая существенного влияния на жизнеспособность микобактерии, способствует хорошей гомогенизации материала. Поверхностно-активные вещества, каким является твин 80, способны адсорбироваться на поверхностях раздела фаз дисперсных систем и понижать поверхностное натяжение. Ткани животного организма являются гетерогенной системой, обладающей большим количеством поверхностей раздела. Поверхностное натяжение цитоплазмы клеток на границе с окружающей их жидкой средой имеют низкие значения, равные в среднем от 0,2 до 2,0 · 10-7 Дж/см2. Чем меньше поверхностное натяжение на границе соприкосновения клеток, тем легче они изолируются друг от друга. Таким образом, твин 80, понижая поверхностное натяжение, способствует освобождению микобактерии из тканей. В физико-химическом отношении, в отличие от большинства бактерий, которыми может быть контаминирован материал, микобактерии, вследствие наличия в них жировосковых веществ (20-40%), обладают гидрофобными свойствами и аффинитетом к поверхностно-активным веществам. Из-за высокого содержания жировосковых веществ в микробной клетке удельный вес микобактерии меньше удельного веса жидкости, используемой для обработки материала. Под действием центробежных сил при центрифугировании микобактерии концентрируются в поверхностном слое надосадочной жидкости в виде пленки, Другие микробы и клеточные элементы тканей, имеющие больший удельный вес, выпадают в осадок. Таким образом в поверхностной пленке надосадочной жидкости происходит накопление микобактерии, свободных от других некислотоупорных микроорганизмов. Использование этой пленки для посева на питательные среды и приготовления мазков делает результаты бактериологических исследований более эффективными в сравнении с существующими методами исследований. Для определения оптимальных концентраций нами испытаны 0,01 %, 0,03%, 0,05%, 0,07% и 0,1% растворы твина 80, приготовленные на дистиллированной воде, полупроцентном и однопроцентном едком натре. Материалом для исследования служили пораженные туберкулезом лимфатические узлы и органы от 12-ти голов крупного рогатого скота. Исследуемый материал измельчали ножницами и помещали в ступку, тщательно растирали с песком, делили на 15 равных частей и обрабатывали вышеуказанными жидкостями. Из поверхностной пленки надосадочной жидкости бактериологической петлей производили посев и готовили мазки. В мазках сосчитывали количество микобактерий в 100 полях зрения микроскопа, рост оценивали путем подсчета выросших колоний на питательных средах. Результаты исследований обработаны статистически и представлены в табл.2. Для более наглядной интерпретации полученных результатов исследований цифровые данные табл.2 представлены графически на рис.1. Наилучшие результаты бактериоскопических и культуральных исследований были получены при использовании щелочного раствора твина 80 в концентрации 0,05%. При этом отмечено статистически недостоверное различие результатов при обработке твином 80 в пределах от 0,03% до 0,07%. Более низкие концентрации твина 80 отрицательно сказывались на результативности как бактериоскопических, так и культуральных исследований. Концентрации выше указанного предела достоверно снижали результаты культуральных исследований. Оптимальная концентрация едкого натра составила 0,5%. Таким образом установлена причинно-следственная связь количеств реактивов с техническим результатом исследований. Для осуществления способа исследуемый материал в количестве 10-12 г измельчают ножницами, тщательно растирают в ступке пестиком со стерильным песком, добавляют равное по объему количество раствора для обработки материала и снова растирают. Добавляют 15-20 мл стерильной дистиллированой воды и тщательно перемешивают пестиком. Полученную суспензию пастеровской пипеткой переносят в стерильные центрифужные пробирки с ватными пробками, уравновешивают и центрифугируют в течение 20 мин при 3000 мин-1 В результате центрифугирования на поверхности надосадочной жидкости образуется тонкая пленка. Бактериологической петлей диаметром 2 мм пленку снимают и засевают на питательные среды {по 1-2 петли на пробирку) и готовят мазки для бактериоскопии. Для обработки материала используют 0,05% раствор твина 80, приготовленный на 0,5% растворе едкого натра. Твин 80 или моноолеат - производное ангидросорбита, является полиэтилендериватом моноангидросорбита. Это маслянистая жидкость плотностью 1,08, ее растворимость в воде обусловлена окислением боковых цепей этилена. Гидрофобную часть молекулы составляют жирные кислоты. Твин 80 применяют в качестве индифферентного эмульгатора и стабилизатора при изготовлении некоторых питательных сред для культивирования тканей, некоторых жидких питательных сред для культивирования микобактерий (например, среда Дубоса), он входит в состав растворителя туберкулина. Пример. Материалом для исследования служили заглоточные, подчелюстные, средостенные и бронхиальные лимфоузлы, отобранные на конвейере Одесского мясокомбината при уборе 31-й головы реагирующего на туберкулин крупного рогатого скота, принадлежащего неблагополучным по туберкулезу хозяйствам. Для сравнения способов бактериологической диагностики исследуемый материал от каждого животного делили на две равные части. Одну из них обрабатывали методом Левенштейна-Гона, вторую - предлагаемым способом. После обработки материала готовили мазки и производили посевы на питательные среды. Мазки окрашивали по Цилю-Нильсену и определяли среднее количество микобактерий в 100 полях зрения. Для посева использовали среду Гельберга с глицерином и без глицерина, Левенштейна-Йенсена и среду Дорожковой. После парафинирования пробок пробирки с посевами помещали в термостат при температуре 37,5-38°С. Учет роста культур осуществляли еженедельно. Результаты исследований представлены в табл. 3, 4. Как видно из представленных в табл.3 данных, при исследовании 31 пробы материала предлагаемым способом выделено 14 культур микобактерий, в то время как методом Левенштейна-Гона только 7. Начало первичного роста микобактерий туберкулеза на плотной среде при обработке материала по ЛевенштейнуГону составило в среднем 44,0±6,15 дней, предлагаемым способом - 34,5 ± 4,97 дней. Из 14 выделенных культур 12 отнесены к микобактериям туберкулеза бычьего вида, 2 - к атипичным микобактериям. Последние выделены только предложенным способом из материала, не имевшего изменений, свойственных туберкулезу. Преимущества предлагаемого способа вы явлены и по результатам бактериоскопических исследований, представленных в табл. 4. В среднем число микобактерий, обнаруживаемых при бактериоскопии материала, обработанного предлагаемым способом, в несколько десятков раз выше, чем при обработке материала методом Левенштейна-Гона. Мазки, приготовленные из поверхностной пленки надосадочной жидкости, почти лишены посторонних примесей в сравнении с седиментацией, так как на дно пробирки оседает большое количество балластных веществ, затрудняющих бактериоскопию.