Спосіб визначення новизни сортів та ліній м’якої пшениці за днк-типуванням

Спосіб визначення новизни сортів та ліній м'якої пшениці за ДНК-типуванням, що включає 3 19828 мих зернівок, проводять електрофорез в крохмальному гелі та порівнюють електрофоретичні спектри екстрактів і встановлюють сортову приналежність та/або гомозиготність зразків. Використання для ідентифікації сортів і генотипів блоків компонентів запасних білків можливо завдяки детальному вивченню генетичного контролю білкових систем та складанню достатньо повного каталогу зустрічаючихся алельних варіантів блоків по кожному кластеру генів, які контролюють біосинтез цих білків. При реєстрації генотипу отримані компоненти спектру записують у вигляді формул. Даний спосіб вибрано як найближчий аналог. До недоліків найближчого аналога слід віднести те, що запасні білки відбивають мінливість геному м'якої пшениці тільки у гліадинкодуючих локусах хромосом 1AS, 1BS, 1DS, 6AS, 6BS, 6DS та в локусах, які кодують низько- та високомолекулярні глютеніни, та розташовані в першій групі хромосом. З метою усунення вказаних недоліків пропонується спосіб ідентифікації генотипів та встановлення новизни за даними електрофоретичних спектрів ДНК, отриманих в результаті ампліфікації мікросателітних локусів, що розташовані на хромосомах: 1А, 1В, 2 А, 2D, 3А, 3D, 3В, 4 А, 5 А, 5В, 5D, 6D, 7А, 7В, 7D. В основу корисної моделі поставлено задачу ідентифікації та встановлення новизни сортів м'я кої пшениці, які подаються на держсортовипробування, шляхом порівняння алельних характеристик мікросателітних локусів, визначених для заявлених сортів з даними бази алельних характеристик сортів, яки зареєстровані в Реєстрі сортів рослин України. Поставлена задача вирішується тим, що дослідження проводять методом ампліфікації ДНК тестуємих зразків за допомогою полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР) та праймерами, які специфічно фланкують мікросателітні локуси, електрофорезу ампліфікованих фрагментів ДНК в денатуруючому поліакриламідному гелі, визначенню молекулярних розмірів алелів мікросателітних локусів, запису спектра ДНК у вигляді формули та порівнянню алельних характеристик сорту претендента на реєстрацію та зареєстрованих сортів. Відмінними від найближчого аналога ознаками є: спосіб підготовки зразків до аналізу; показник, по якому ідентифікують генотипи; наявність достатньо повної бази даних - каталогу алелів мікросателітних локусів сортів зареєстрованих в Україні. Спосіб забезпечує високу ефективність встановлення новизни та ідентифікації генотипів сортів м'якої пшениці. Спосіб здійснюється таким чином. 1. Виділення ДНК. Зерно пшениці або 1см сегмент паростка гомогенізувати до повної мацерації тканин та залити лізуючим буфером - 500мкл (0,1М EDTA, 0,1 М Тріс-НСl рН 8,5, 0,1М Nad, 1,0% ДСН, 0,1% Трітон Х-100). Лізат інкубувати 40хв. при 65°С. Додати рівний об'єм суміші хлороформ-ізоаміловий спирт (24:1 за об'ємом), перемішати до утворення білої ему 4 льсії. Отриману суміш центрифугувати 5хв. при 14000об./хв на мікрофузі "Eppendorf 5415", водну фазу перенести в чисту пробірку "епендорф". До водної фази додати 0.6 обсягу ізопропілового спирту, перемішати. Нуклеїнові кислоти (НК) осадити центрифугуванням при 10000об./хв. протягом 3хв. на мікрофузі "Eppendorf 5415". Осад промити двічі 70%-ним етанолом, підсушити за кімнатної температури 15-20хв. і розчинити в 400мкл ТЕбуферу (10mM Тріс-НСl, 1mM ЕДТА). Після повного розчинення НК провести РНКазну обробку: до розчину НК додати РНКазу-А до кінцевої концентрації 1мкг/мл і інкубувати 30хв. при 37°C. 2. Флюорометричне визначення концентрації ДНК. Концентрацію виділеної ДНК визначити на флюориметрі "ТКО 100 Dedicated mini Fluorometer" ("Hoefer Scientific Instruments", США) у TNE-буфері (3M NaCl, 50mM Nа2НРО4) у присутності флюорисцентного барвника Hoechst 33258. 3. Проведення полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР). Реакційна суміш для проведення ПЛР об'ємом 20мкл містить: 50mM KCl, 20mM Тріс-НСl рН 8,4 (25°С), 1,5mM MgCl2 0,01% Твін-20, по 0,2mM кожного dATP, dCTP, dTTP, dGTP, по 0,25mkM прямого і зворотного праймерів, 20нг ДНК і 1од. ДНК-полімерази Taq. Поверх реакційного розчину нашарувати 50мкл мінеральної олії. Температурний режим ампліфікації наступний: 94°С 1хв.; 50°С, 55°С, 60°С 1хв. (в залежності від праймерів, інформація з нуклеотидної послідовності праймерів надана Roder et al. (1998)); 72°С 2хв., фінальна елонгація - 10хв. Кількість циклів 35. Аналізувати мікросателітні локуси м'якої пшениці Xgwm 3 (3D), Xgwm 18 (1В), Xgwm 155 (3А), Xgwm 165 (4А), Xgwm 190 (5D), Xgwm 261 (2D), Xgwm 325 (6D), Xgwm 357 (1A), Xgwm 408 (5B), Xgwm 437 (7D), Xgwm 577 (7B), Taglgap (1B), Xgwm 186 (5A), Xgwm 513 (4B), Xgwm 533 (3В). 4. Електрофоретичний розподіл продуктів ампліфікації. Продукти ПЛР-ампліфікації (5мкл - аліквоту ПЛР-суміші) фракціонувати в 10% денатуруючому (8М сечовина) поліакріламідному гелі в 1 х ТВЕ-буфері (89mM тріс, 89mM борна кислота, 2mM EDTA) при постійній напрузі 500В та температурі 60°С 1-2 години залежно від довжини фрагментів ампліфікації. 5. Візуалізація продуктів ампліфікації. Гель помістити на 5хв. у 10% етанол, перенести у 1% НNО3 на 3хв. Гель промити дистильованою водою 2-3 рази та помістити на 20хв. у 0,012М AgNO3 у темряві. Гель знову промити дистильованою водою 2-3 рази та інкубувати у відновлюючому розчині (0,28М Na2CO3 (безводний), 0,019% формалін), змінюючи розчин у кожному разі його потемнення, до появи забарвлення фрагментів ампліфікації. Гель промити дистильованою водою 2-3 рази та помістити в 10% оцтову кислоту на 2 хв. Гель промити дистильованою водою 2хв. 6. Обчислювання розмірів фрагментів ампліфікації - алелів мікросателітних локусів. Відеозображення електрофоретичних спектрів ампліфікованої мікросателітної ДНК і підрахунок розмірів фрагментів ампліфікації - алелів мікро сателітних локусів здійснювати за допомогою системи доку 5 19828 ментування і аналізу електрофорезних гелів Image Master VDS ("Amersham Pharmacia Biotech", Великобританія). 7. Визначення новизни сорту шля хом порівняння даних алельних характеристик сорту з базою даних алельних характеристик зареєстрованих в Україні сортів м'яких пшениць. Визначення новизни сорту проводити за допомогою спеціальної програми 1D Database, яка є складовою частиною програмного пакета Image Master, яка дозволяє проводити різноманітні порівняння та отримувати необхідну інформацію стосовно вже проаналізованих генотипів. База даних включає алельні характеристики 14 мікросателітних локусів, що розташовані на різних хромосомах геному пшениці для 56 сортів м'якої пшениці, які зареєстровані в Держреєстрі України у 2001 і 2002 pp. Сумарна кількість алелів, що детектована у досліджуваних сортів складає - 87. Приклад конкретного використання способу Визначення новизни сорту за ДНКтипуванням. ДНК виділяли експрес-методом з десяти зернівок сорту претенденту на реєстрацію. Проводили мікросателітний аналіз за локусами: Xgwm 3, Xgwm 18, Xgwm 15, Xgwm 165, Xgwm 190, Xgwm 261, Xgwm 325, Xgwm 357, Xgwm 408, Xgwm 437, Xgwm 577, Taglgap, Xgwm 533, Xgwm 186, Xgwm 513. Комп’ютерна в ерстка А. Крулевський 6 Встановлювали розмір алелів тестуємих локусів у парах н уклеотидів (п.н.). Визначення новизни сорту проводиться на основі порівняння результатів мікросателітного аналізу сорту претенденту на реєстрацію та бази даних, яка включає алельні характеристики зареєстрованих в Україні сортів м'якої пшениці. Наприклад, за аналізом мікросателітних локусів сорт Панна, який подано до Державної служби з сортовипробування має алельні характеристики: за локусом Xgwm 3 - 79 п.н., за локусом Xgwm 75 188 п.н., за локусом Xgwm 155 - 141 п.н., 149 п.н., за локусом Xgwm 165 - 191 п.н., за локусом Xgwm 190 - 210 п.н., за локусом Xgwm 261 - 192 п.н., за локусом Xgwm 325 - 140 п.н., за локусом Xgwm 357 - 122 п.н., за локусом Xgwm 408 - 170 п.н., 178 п.н., за локусом Xgwm 437 - 117 п.н., за локусом Xgwm 577 - 163 п.н., за локусом Taglgap - 227 п.н., за локусом Xgwm 533 - 0 п.н., за локусом Xgwm 186 - 125 п.н., 135 п.н., за локусом Xgwm 513 - 143 п.н. подібне сполучення алелів не має в базі даних ні один з зареєстрованих сортів, тому сорт Панна є новим. Список літератури: 1. Roder MS, Korzun V, Wendehake К, Plaschke J, Tixier M-H, Leroy P, Ganal M (1998) A microsatellite map of wheat. Genetics 149:2007-2023. Підписне Тираж 26 прим. Міністерство осв іт и і науки України Держав ний департамент інтелектуальної в ласності, вул. Урицького, 45, м. Київ , МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислов ої в ласності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601