Спосіб реєстрації сортів жита за днк-типуванням

Спосіб реєстрації сортів жита за ДНКтипуванням, що включає мікросателітний аналіз геномної ДНК, виділеної із зернівок, паростків або інших тканин, обрахування частоти зустрічальності алелів мікросателітних локусів в сортах жита та запис у вигляді формули генотипу сорту, який відрізняється тим, що використовують систему мікросателітних ДНК-маркерів та аналіз частоти зустрічальності алелів мікросателітних локусів у сорті-популяції. Корисна модель належить до біотехнології і може бути використаним для реєстрації сортів жита. Спосіб базується на ДНК-типуванні сортів жита за мікросателітними локусами, установленні алельних характеристик цих локусів та визначенні частот зустрічальності алелів мікросателітних локусів у сорті-популяції. Запропонований спосіб дасть можливість підвищити ефективність реєстрації нових сортів у держсортовипробуванні, проводити сертифікацію комерційних сортів жита, вирішувати проблему захисту авторських прав. Жито (Secale cereale L.) - вид з перехрестним запиленням, тому сорт жита є комбінацією генотипів, тобто сорт-популяція. Генотипи рослин можуть бути охарактеризовані набором алелів мікросателітних локусів [Rongwen et al., 1995; Сиволап та інш. 2000; Чеботарь та ін. 2001]. Існуюча система ідентифікації сортів жита базується на фенотипових ознаках, для опису яких потрібно вирощувати рослини до повної стиглості. Агроекологічні умови вирощування рослин в Україні можуть варіювати залежно від певних погодних умов року, що позначається на прояві фенотипових ознак. Тому диференціація та реєстрація сортів рослин, які перехресне запилюються є складною задачею. Найбільш близьким до запропонованого технічного рішення є спосіб використання для характеристики сортів жита електрофоретичних спектрів запасних спирторозчинних білків ендосперма -проламінів, який був розроблений Пеневою Т.І. та Конаревим В.Г. [Пенева Т.И. та Конарев В.Г. "Выявление внутрисортового полиморфизма у ржи по спектру глиадина" Доклады ВАСХНИЛ , №4, 1978. С.12-14.] Запасні білки ендосперму виділяють з окремих зернівок, проводять електрофорез в 7,5% ПААГ. Гелі фарбують та визначають зустрічальність типів спектру по кожному сорту. Сорти відрізняються один від одного співвідношенням типів спектра проламінів, а саме секалінів. Даний спосіб обрано як прототип. До недоліків прототипу слід віднести те, що запасні білки відбивають мінливість геному жита тільки у секалінкодуючих локусах хромосом. З метою усунення вказаних недоліків пропонується спосіб реєстрації сортів жита за даними електрофоретичних спектрів ДНК, отриманих в результаті ампліфікації мікросателітних локусів, що розташовані по усіх хромосомах геному жита. Праймери до мікросателітних локусів жита відомі і опубліковані [Saal, Wricke, 1999]. Можливе також використання праймерів до мікросателітних локусів пшениці: WMS247 (6RL), WMS269 (7RS), WMS299 (3RS), WMS6 (5RL), WMS2 про що відомо з досліджень С. Малишева з співавторами (Малишев та ін. 2003). В основу корисної моделі закладено завдання реєстрації сортів жита, які направляються до держсортовипробування, шляхом установлення алельних характеристик мікросателітних локусів, визначення частот зустрічальності алелів МС-локусів у генотипі сорту. CO CM О) 10230 центному секвенаторі (Pharmacia) з використанням коротких гель-касет. Використовувати денатуровані 6% поліакриламідні гелі завтовшки 0,35мм (для приготування яких брати SequaGelTM (Biozym). Електрофорез одержувати в 1хТВЕ буфері при 600В, 50мА и 50Вт, застосувати потужність лазера 2м Вт с тест інтервалом 0,84с. Розмір фрагментів обчислювати порівнючи продукти ПЛР зі стандартами молекулярної ваги за допомогою програми Fragment Manager 1/2 (Pharmacia/ Приклад конкретного використання способу реєстрації сорту жита за ДНК-типуванням ДНК виділяють експрес-методом з кожної зі 100 зернівок сорту, що є претендентом на реєстрацію. Проводять мікросателітний аналіз за локусами, встановлюють розмір алелів тестуємих локусів індивідуальних рослин у парах нуклеотидів (п.н.). Обчислюють частоти зустрічальності досліджених алелів мікросателітних локусів тестуємої популяції Характеристики частоти зустрічальності мікросателітних локусів використовують для реєстрації генотипу сорту жита. Прикладом використання аналізу мікросателітних локусів для ДНК-типування сорту жита можут слугувати дані представлені в роботі Чеботар з співавторами (Chebotar et al., 2002). Як показано в роботі, сорт жита має унікальні характеристики частот зустрічальності алелів МС-локусів, тобто для зразка жита Ассі/1998, ці характеристики виглядатимуть так: -113пн-(0,364); 115п.н.-(0,227); 117п.н.(0,152), 119п.н.-(0,167), 127п.н.-(0,09) - по першому МС-локусу. -154п.н.-(0,014), 164п.н.-(0,028); 170п н.(0,194); 172п.н.-(0,097); 176п н-(0,347); 178пн(0,083), 180п н.-(0,167); 182п.н.-(0,069) - по другому МС-локусу. - нуль алель-(0,029), 147п.н.-(0,071); 149п.н.(0,129); 153п.н-(0,114); 155п.н.-(0,186), 157п.н.(0,100); 159п.н-(0,086), 161п.н.-(0,029); 169п.н.(0,257)- по третьому МС-локусу. - 240пн-(0,139); 244п.н.-(0,278); 246п.н.(0,236); 254п н -(0,111), 256п.н.-(0,236) -по четвертому МС-локусу. -123пн-(0,014); 128п.н.-(0,243); 134п.н2. Проведення полімеразної ланцюгової ре(0,157), 146п.н -(0,543) - по п'ятому МС-локусу акції (ПЛР) Реакційна суміш для проведення ПЛР - 111п.н.-(0,389); 180п.н.-(0,014); 182п.н.об'ємом 20мкл містить: 50 mM KC1, 20 т М тріс(0,014), 186п.н.-(0,333); 200п.н.-(0,181); 208п.н.НСІ рН 8 4 (25°С), 1,5 mM MgCI2, 0 0 1 % ТВІН-20, по (0,014); 210п.н.-(0,056) - по шостому МС-локусу і 0.2 т М кожного dATP, dCTP, dTTP, dGTP, no 0.25 т.Д mkM прямого і зворотнього праймерів, 20нг ДНК і 1 Таким чином, частоти зустрічальності алелів одиницю ДНК-полімерази Taq. Поверх реакційного МС-локусів можуть бути використані для розчину нашарувати 20мкл мінеральної оли Темреєстрації сортів жита у держсортовипробу ванні, пературний режим ампліфікації такий: 94°С 1 хв., в як унікальні характеристики генотипу сортузалежності від нуклеотидної ПОСЛІДОВНОСТІ прайпопуляцм жита посівного мерів 50°С, 55°С, 60°С 1 хв.; 72°С 2 хв., фінальна Список літератури: елонгація -10 хв Кількість циклів - 35. 1 Малышев СВ., Корзун В.Н., Забенькова Для аналізу мікросателітних локусів, викориК.И., Войлоков А.В., Бернер А., Картель Н.А. стовувати праймерні пари: SCM2 (6RL), SCM5 Сравнительное молекулярно-генетическое карти(3RL), SCM 9 (1RS); SCM75 (2RL); SCM 86 (7R); рование генома ржи (Secale cereale L.) и других SCM138 (5RS) (інформація з ПОСЛІДОВНОСТІ прайзлаков// Цитология и генетика -2003. -№5 - С.9-20 мерів опублікована Saal, Wncke, 1999); WMS269 2 Пенева Т.И , Конарев В.Г. Выявление внут(7RS); WMS299 (3RS), WMS6 (5RL) (Roder et al, рисортового полиморфизма у ржи по спектру 1998) глиадина //Доклады ВАСХНИЛ - 1978. - №4 - С 123. Електрофоретичний розподіл продуктів 14 ампліфікації. Аналіз отриманих ПЛР-продуктів виконувати на автоматичному лазерному флюорисЗавдання вирішується тим, що дослідження проводять методом ампліфікації ДНК тестуємих зразків за допомогою полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР) та праймерів, які специфічно фланкують мікросателітні локуси, електрофорезом ампліфікованих фрагментів ДНК в денатуруючому поліакриламідному гелі, визначенням розмірів алелів микросателітних локусів, обчисленням частот зустрічальності кожного алелю в генотипі сорту, записом характеристики сорту за частотами алелів МС-локусів. ВІДМІННИМИ ВІД прототипу ознаками у корисній моделі, що заявляється, є: - спосіб підготовки зразків до аналізу; - показники, за якими ідентифікують генотип сорту жита. Спосіб забезпечує унікальну характеристику сорту жита, що буде використана у реєстрації сортів. Спосіб здійснюється таким чином. 1. Виділення ДНК. Сто зернівок сорту жита або сегментів паростків, або коріння розміром 1см індивідуально гомогенізувати до повної мацерації тканин та залити лізуючим буфером -500мкл (0 1 М EDTA, 0.1 М тріс-НСІ рН 8.5, 0.1 М NaCI, 1.0% ДСН, 0.1% трітон Х-100). Лізат інкубувати 40 хв. при 65°С. Додати рівний об'єм суміші хлороформізоаміловий спирт (24:1 за об'ємом), перемішати до утворення білої емульсії. Отриману суміш центрифугувати 5 хв при 14000 об./хв. на мікрофузі "Eppendorf 5415", водну фазу перенести в чисту пробірку "епендорф". До водної фази додати 0.6 обсягу ізопропілового спирту, перемішати Нуклеїнові кислоти (НК) осадити центрифугуванням при 10000 об./хв протягом 3 хв. на мікрофузі "Eppendorf 5415". Осад промити ДВІЧІ 70%-НИМ етанолом, підсушити за кімнатної температури 15-20 хв. і розчинити в 400мкл ТЕ-буферу (10 т М тріс-НСІ, 1 т М ЕДТА). Після ПОВНОГО розчинення НК провести РНКазну обробку: до розчину НК додати РНКазу-А до кінцевої концентрації 1мкг/мл і інкубувати 30хв. при 37°С. Препарат отриманої ДНК розбавити в 40 разів Для ПЛР аналізу використовувати 2мкл розчину 10230 3. Сиволап Ю.М., Е.А. Топчиева, Чеботарь С В . Идентификация и паспортизация сортов мягкой пшеницы методами RAPD- и SSRP-анализаУ/ Генетика - 2000 -№1 - С.44-51. 4. Чеботарь С В., Сиволап Ю.М. Дифференциация, идентификация к создание базы данных сортов Т. aestivum L. украинской селекции на основе STMS-анализа/Щитология и генетика-2001. №6-С. 18-27. 5. Chebotar S.V., Roder M.S., Korzun V., Bomer A Genetic integrity of ex situ genebank collections// Cellular and molecular biology letters- 2002. - 7. - P. 437-444. Комп'ютерна верстка Г Паяльніков 6. Rongwen J., Akkaya M.S., Bhagwat A.A., Lavi U., Cregan P.B. The use of microsatelhte DNA markers for soybean genotype identification// Theor Appi Genet - 1995. - 90. - P. 43-48. 7. Roder M.S., Korzun V., Wendehake K., Plaschke J., Tixier M -H., Leroy P., Ganal W. A microsatelhte map of wheaV/Genetics- 1998. - 149-P. 2007-2023. 8. Saal В , Wncke G. Development of simple sequence repeat markers in rye (Secale cereale L.)//Genome -1999. - 42. - P. 964-972. Підписне Тираж 26 прим Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, вул Урицького, 45, м Київ, МСП, 03680, Україна ДП "Український інститут промислової власності", вул Глазунова, 1, м. Київ - 4 2 , 01601