Спосіб виготовлення біологічного імуностимулюючого препарату для птиці “цитосол-аві” (“cythosol-avi”)

Спосіб виготовлення біологічного імуностимулюючого препарату для птиці, що включає збір, активацію, культивування лімфоцитів та звільнення від клітинного детриту, який відрізняється тим, що трипсинізують селезінки інтактної птиці, стимулюють спленоцитарні лімфоцити конканаваліном А у дозі 5-10 мкг/мл, культивують від 8 до 12 годин та стерилізують фільтруванням. (19) (21) u200604239 (22) 17.04.2006 (24) 15.01.2007 (46) 15.01.2007, Бюл. № 1, 2007 р. (72) Герілович Антон Павлович, Білокінь Віктор Степанович, Заремба Олександр Васильович, Мороз Оксана Євгенівна (73) НАЦІОН АЛЬНИЙ НАУКОВИЙ ЦЕНТР "ІНСТИТУТ ЕКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЇ І КЛІНІЧНОЇ ВЕТЕРИНАРНОЇ МЕДИЦИНИ" 3 19923 4 рилізації фільтруванням, щоб забезпечити спосіб Ефективність способу розкривається в привиготовлення біологічного імуностимулюючого кладах. препарату для птиці "Цитосол-АВІ" ("CythosolПриклад 1. AVI"). Підбір субстрату для вилучення лімфоцитів. В Спосіб виконується таким чином. дослід було взято чотири різновиди лімфоїдної Від клінічно здорової птиці віком 2-4 місяці при тканини: кров, зразки тимусу, селезінки та фабризабої відбирають матеріал у вигляді селезінок, цієвої бурси. триразово відмивають у розчині Хенксу з антибіоЗ гепаринізованої крові лімфоцити видаляли тиками та фунгіста тиками: канаміцин сульфат та методом диференційного центрифугування. Їх стрептоміцин (500ОД/мл), а також ністатин концентрація склала 3,1±0,4млн./мл, в той час, як (50мкг/мл). Селезінки звільняють від капсул та в крові вона сягала 7,4±0,25млн./мл. Ефективність подрібнюють на шматки розміром 5x5x5мм, які ще виділення лімфоцитів з тимусу та селезінки склала раз промивають розчином Хенксу з аналогічними 70,62 та 86,53%, а їх вихід склав 19-22млн. клітин концентраціями антибіотичних речовин, після чого з 1г селезінкової тканини. З фабрицієвої сумки до них додають 0,3% розчин трипсину, підігрітий встановлено дуже малий вихід життєздатних лімдо температури 37°С з розрахунку 1:10 до об'єму фоцитів, що можна пояснити особливостями бутканини. Шляхом подальшого перемішування за дови цього органу. допомогою магнітної мішалки отримують суспенПриклад 2. зію спленоцитів. Після диспергування спленоцитів Підбір концентрації мітогену та умов стимулядо стану гомогенної суспензії додають 2% сировації лімфоцитів. В якості мітогенів використано фітки крові великої рогатої худоби для нейтралізації тогемаглютинін із зародків пшениці (ФГА, виробактивності трипсину. Отриману суспензію центриництва фірми «Sigma-Aldrich Ltd», США), фугують при 1500g впродовж 30 хвилин. Супернаконканавалін А (КонА, виробництва фірми «ПанЄтант зливають, вносять приблизно 1/3 від початкоко», Росія) та гемаглютинін зі шкаралупи волоськового об'єму живильного середовища 199. З го горіху (PNG, Lohman Animal Health GmbH & Co. поверхневої частини осаду обертовими рухами KG, Німеччина). змивають шар лейкоцитів (має сіро-жовте забарвЗа умов дії на культури клітин CEF та Vero пелення). релічені мітогени активують їх проліферативні Лейкоцитарну фракцію ретельно перемішують, процеси на 50% та 72% на 8 та 12 годину інкубації після чого визначають концентрацію клітин в су(за методом прямого підрахунку концентрацій у спензії. Вона повинна дорівнювати 70000порівнянні до неактивованого контролю) при за100000кл/мл. При необхідності її можна сконцентстосуванні в концентраціях 1мкг/мл середовища рувати центрифугуванням, або розвести. для ФГА, 10мкг/мл середовища для Кон А та До суспензії клітин у живильному середовищі 5мкг/мл - для PNG. додають конканавалін А у концентрації 5-10мкг/мл Вибір Кон А обумовлений його більш м'якою середовища. Суспензію інкубують впродовж 8-12 дією на мітотичний апарат клітин та порівняльно годин при 37,5-39°С, після чого центрифугують, дешевою собівартістю. відбирають супернатант та стерилізують за метоПри аналогічній стимуляції суспензії лейкоцидом ультрафільтрації [фільтр типу Мsllіроrе, діатів (100000 клітин/мл) після 8-12-добової інкубації метр пор 10нм або пропускна здатність 40кДа]. показник приросту клітинної концентрації становив Активність препарату визначають за інтерфевід 48% до-56%, активність інтерферону у звільнероном в реакції блокування ЦПД вірусу ньюкаслному від клітин середовищі зареєстрована на рівні ської хвороби на культурі фібробластів ембріонів 40000МО/мл. курей. Мінімальна активність має дорівнювати Сукупність цих те хнологічних вимог значно 100000МО/мл. При необхідності препарат розвоздешевлює передбачуваний кінцевий продукт. дять живильним середовищем 199. Спосіб виготовлення біологічного імуностимуРідка препаративна форма зберігається при люючого препарату для птиці "Цитосол-АВІ" 4°С від 6 до 8 місяців та більше 2 років після ліо("Cythosol-AVI") є економічним та ефективним для фільного висушування. виробництва птахівничої продукції. Таблиця 1 РЗГА Група 14 Фонові антитіла Контроль Аерозольна обробка Внутрішньо-м'язова обробка Пероральна обробка РНГА Доба дослідження 21 14 2,20±0,51 log2 4,6±0,24 log2 4,0±0,55 log2 6,4±0,24 log2*** 6,4±0,51 log2** 6,6±0,24 log2*** 7,0±0,45 log2*** 5,8±0,37** 6,2±0,32** 21 1,56±0,32 log2 4,6±0,40 log2 4,2±0,20 log2 6,4±0,40 log2** 6,2±0,37 log2** 6,0±0,32** 6,S±0,45 log2*** 5,6±0,37** 5,S±0,42*** Примітка: ** - Р