Спосіб одержання експрес-моделі по випробовуванню антимутагенних препаратів при вірусних пошкодженнях геномів клітин свиней

Изобретение относится к области ветеринарной медицины, вирусологии, биотехнологии и может быть использовано при оценке антимутагенных ве ществ. Известны методы повреждения структур наследственности факторами физической, химической и биологической природы, которые относятся к мощным мутагенам: ионизирующие излучения, ультрафиолетовый свет, фотодинамическое действие органических красителей, алкилирующие соединения, гидроксиламин и гидразин, азотистая кислота, аналоги оснований, производные актидина, некоторые антибиотики (даунамицин) и другие. Ионизирующие излучения, например рентгеновские лучи, индуцируют изменения, касающиеся в первую очередь однонитевых разрывов ДНК, затем появление дицентриков, парных концевых делений, хроматидных перестроек, симметрических транслокаций хромосомного типа, колец [1]. Ионизирующие излучения индуцируют мутации рандомизированно как по отдельным хромосомам, так и по их длине. Известно, что количество перестроек хромосомного типа при ионизирующем облучении зависит от многих факторов: фазы клеточного цикла, особенности и состояния объекта исследований, длительности, дозы и мощности облучения, типа излучения, температуры и т.д. Недостатками при индуцировании мутаций с помощью ионизирующи х излучений является необходимость наличия дорогостоящего оборудования, выполнение таких работ связано с вредными условиями труда, возможно облучение персонала, ионизирующие облучения вызывают несколько иной спектр хромосомных аберраций, нежели при вирусном мутагенезе, так, что данные, полученные при облучениях нельзя полностью экстраполировать на процессы, происходящие при повреждении хромосом вирусами. Известно, что химические мутагены, такие как алкилирующие соединения вызывают хромосомные и хроматидные перестройки [2]. Химические мутагены чаще повреждают гетерохроматиновые участки хромосом. Однако строго обоснованных закономерностей пока не выявлено. Недостатком метода индукции мутаций химическими соединениями является неопределенность судьбы мутагена, введенного в клетку, поскольку как в клетке, так и в водном растворе они подвергаются гидролизу. Продукты гидролиза могут быть не мутагенны, но в то же время токсичными для клеток, что приводит их к гибели. Гибель отравленных клеток снижает число мутаций после обработки высокой концентрацией мутагена. Важным моментом при изучении химического мутагенеза является учет реакционных способностей каждого из конкретных мута генов, а количество перестроек зависит от многих факторов: концентрации мутагена, величину его pH и pH объекта, продолжительность и доза мутагена, состояние объекта, воздействия модифицирующих факторов и т.д. Известно, что выбор объекта исследований и учет его физиологического состояния играет большую роль. Проверку мутагенных свойств химических веществ проводили на растениях, дрозофиле, лабораторных животных (мышах). Наиболее широко используемыми объектами для изучения хромосомных аберраций, возникших в результате действия факторов внешней среды ин витро являются культуры лимфоцитов периферической крови человека или эмбриональных фибробластов, иногда клеток костного мозга. Однако при проведении исследований по концентрационным и экспозиционным зависимостям на животных (мышах) требуется большое их количество, а также большое число клеток требуется анализировать. Одним из недостатков при использовании метода учета хромосомных аберраций в костном мозге является выбор линии мышей, из-за генотипических различий разных линий при воздействии химических мутагенов. Ме таболизм химических веществ в организме животных специфичен из-за генетического полиморфизма популяций по ферментным и белковым системам. Метод из учения мутагенности веществ с использованием дрозофилы основан на учете рецессивных летальных мутаций, возникающих в зародышевых клетках. Однако, при воздействии некоторых химических соединений (например, иприт) на спермии дрозофилы мутации возникали только в отцовских хромосомах. Недостатками опытов, проведенных на поколениях дрозофилы являются значительные затраты времени (экспозиции мутагена 2 - 3 суток, затем время на получение потомства) по сравнению с получением ответа на культурах клеток. Используя насекомых и животных возможны погрешности экспериментов, выражающиеся в неправильном объеме выборки, стандартизации дозировки факторов и т.д., существование межиндивидуальных различий лабораторных животных по чувствительности к мутагенам. Визучении мутагенности факторов в условиях культуры лимфоцитов является возможность изменений метаболизма соединений и проницаемости клеточных мембран под влиянием фитогемагглютинина (который обязательно вводят в качестве мутагена по методике культивирования). Известно, что при проверке антимутагенного средства в качестве мутагенного агента используют сточные воды химического предприятия, вводимые беспородным мышам перорально [3]. Недостатком этого метода является то, что животные генетически разнообразны, не указан объем выборки животных. Наиболее близким к предлагаемому способу получения экспресс-модели по испытанию антимутагенных препаратов при вирусных повреждениях геномов клеток свиней является использование штаммов вирусов ТГС и РВБС [4]. Однако, не все штаммы вызывают мутацию хромосом, что сказывается на точности результатов сложности и длительности технологического процесса по созданию мутагенной экспресс-модели. Использование соматических клеток свиней (лимфоцитов) связано с применением дорогостоящих и редких реактивов и у животных-доноров существует межиндивидуальные (генетические) различия по ответу на введение мутагена (существуют различные генетически детерминированные репаративные системы), что приводит к различной элиминации повреждений из организма, а также изменяет метаболизм клеток и их мембран под влиянием фитогемагглютанина, а также усложняет технологию получения экспресс-модели. Задачей изобретения является поиск семейств вирусов животных, индуцирующи х мутации хромосом их клеток и выявление этих мутаций для проведения поисковых работ по антимутагенным веществам, упрощение и сокращение технологического процесса получения экспресс-модели. Поставленная задача решается тем, что в способе получения экспресс-модели по испытанию антимутагенных препаратов при вирусных повреждениях геномов клеток свиней, включающем культивирование клеток свиней, инкубирование с мутагеном, повреждение хромосомного аппарата, культивирование проводят перевиваемыми клетками свиней, а для повреждения хромосомного аппарата используют штаммы коронавируса трансмиссивного гастроэнтерита и ротавируса свиней. Предложенный способ осуществляется следующим образом. Выращивают перевиваемую культуру клеток почек поросенка СПЭВ в 50см 3 витаминных флакончиках. Для этого необходимо применять в качестве ростовой среду, состоящую из смеси следующего состава: среда 199 - 30% и пятипроцентного гемагидролизата лактальбумина - 60% с добавлением инактивированной (при 56°C в течение 60мин) сыворотки КРС-10% и раствора бикарбоната натрия для установления pH 7,2 - 7,4, а также антибиотиков бензилпенициллина натриевой соли - 100ЕД/см 3, стрептомицина сульфата - 100мг/см 3. Культуру клеток выращивают при +37°C до образования монослоя, который обычно сформировывался на 2 - е сутки (при посевной дозе 200тыс. клеток/мл), а митотический индекс культуры клеток составил 10 - 16%. Предварительными исследованиями установили, что культуры клеток СПЭВ пригодна для проведения работ по изучению мутагенного действия вирусов на генетическую структур у клеток (имеет довольно низкий процент уровня спонтанных аберраций хромосом - 5,14%, наибольшее количество клеток представлено клетками с модальным классом, содержащим 38 хромосом, что соответствует диплоидному набору хромосом соматических клеток свиней). Для роста культуры клеток ПТП (перевиваемая линия клеток тестикул поросят) применяли смеси сред среда 199 (45%) и гемогидролизат лактальбумина 5% (45%) с добавлением 10% сыворотки крупного рогатого скота и также антибиотиков, как и для СПЭВ. Культура клеток ПТП также пригодна для проведения работ по вирусному мутагенезу, так как имеет низкий уровень спонтанных аберраций хромосом 9,8% (клеток с повреждениями), и большинство клеток имеет модальный класс 38 хромосом, что соответствует диплоидному набору хромосом вида. Для осуществления способа с применением культуры клеток СПЭВ используют следующие штаммы коронавируса трансмиссивного гастроэнтерита свиней: референтный штамм "Пурдью-115", эпизоотический штамм "П1439/81". При использовании культуры клеток ПТП применяют штамм коронавируса свиней "П1439/81" и вакцинный штамм "K" ротавируса свиней. Все штаммы до применения адаптируют в соответствующи х культура х клеток. Подготовку вирусного сырья для осуществления способа проводят следующим образом: готовят расплодку вируса в той же культуре клеток, в какой проводят исследования. Для этого из флаконов со сформированным монослоем клеток сливаютростовую среду и инфицируют культуру клеток вируссодержащей жидкостью, равномерно распределяя ее по клеточному монослою. Затем оставляют для адсорбции на 1час при комнатной температуре, после чего вируссодержащий материал сливают, а к клеточному монослою прибавляют поддерживающую среду и инкубируют при +37°C до проявления цитопатического действия вируса (ЦПД). При поражении клеточного монослоя вирусом на 50 - 75% флаконы с инфицированным монослоем подвергают трехкратноому замораживанию-оттаиванию для дезинтеграции клеток и полному выходу вир уса в поддерживающую среду. После этого проводят центрифугирование при 5000об/30мин для полного осаждения разрушенных частей клеток. Надосадочную жидкость отбирают в стерильных условиях, определяют титр вируса любым из известных методов титрования, расфасовывают по флакончикам приблизительно в количестве 5мл и замораживают для проведения дальнейших исследований. Для получения метафазных пластинок хромосом указанных культур клеток за час до фиксации добавляли раствор колхицина в концентрации 0,25мкг/см 3 во флаконы с культурой клеток, емкостью 50см 3. Фиксацию проводили через 72 - 74 часа от момента посева культуры клеток смесью этанол-ледяная уксусная кислота (3 : 1). Гипотоническую обработку клеток проводили 0,55% раствором KCl в течение 20 - 30 минут при +37°C. Окраску метафазных пластинок хромосом осуществляли по методу Романовского-Гимза (5 - 10мин). При использовании дифференциальной окраски с помощью метода использовали 0,25% раствор трипсина с экспозицией в 30 секунд, а затем окраска проводилась по Романовскому - Гимза в течение 5 - 10мин. Пример 1. Сформированный клеточный монослой СПЗС инфицировали вируссодержащей суспензией коронавируса свиней штамма "Пурдью-115". Затем за час до окончания культивирования добавляли в каждый флакон раствор колхицина в концентрации 0,25мкг/см 3 и культирование продолжалось в прежнем режиме (при +37°C). После чего клеточный монослой отмывали раствором Хенкса или Эрла 3 - 5 раз. Промывали подогретым до 37°C 0,2% раствором версена 1раз. Вносили этот же раствор в объеме 5см во флаконы и инкубировали при 37°C в течение 10 - 20мин, покачивая 20 - 30 раз до момента, когда связь клеток с веществом подложки ослабевает и они отстают от стекла. Часть раствора сливали, оставляя по 1см 3 во флаконе. В оставшийся объем жидкости быстро извлекали все клетки, имеющиеся во флаконе. Клеточную взвесь осторожно собирали в центрифужные пробирки, куда быстро добавляли предварительно подогретый до 37°C гипотонический раствор - 0,56% KCl, доводя им общий объем жидкости до 9 - 10 см 3. Суспензию клеток осторожно перемешивали с гипотоническим раствором, инкубировали в течение 20 - 30мин при 37°C, что зависело от партии клеток и подбирали эмпирически. После гипотонической обработки, суспензию клеток осаждали центрифугированием при 1000об/мин в течение 10мин. Надосадочную жидкость сливали, оставляя около 0,5см 3 гипотонического раствора над осадком, который осторожно ресуспендировали до однородного состояния. Добавляли свежеприготовленный предварительно охлажденный до минус 4°C фиксатор (8 10см 3), состоящий из ледяной уксусной кислоты и метилового спирта (1 : 3). Клеточную взвесь тщательно перемешивали в фиксаторе. Процедуру смены фиксатора и осаждения клеток в прежнем режиме проводили трижды. На предварительно обезжиренные предметные стекла, охлажденные и содержащиеся в бидистиллированной воде при 4°C наносили с высоты 15 - 20см каплю клеточной суспензии из капилляра пастеровской пипетки. Высушивали стекло на воздухе, и оценивали качество метафазных пластинок хромосом под микроскопом с малым увеличением. Если клеток было много в поле зрения, суспензию разбавляли фиксатором, если мало - снова осаждали клетки путем центрифугирования с частотой вращения 1000об/мин в течение 5мин и перемешивали в меньшем объеме фиксатора. После высушивания препараты окрашивали. При анализе повреждений хромосом штаммом "Пурдью-115" происходит достоверное повышение количества клеток с аберрациями хромосом (P < 0,001) по сравнению с контролем и составляет 39,6% (что выше цифр в контроле почти в 8 раз). Из них - 22% составляют хроматидные пробелы двойные и одиночные фрагменты, 10% - неравномерная конденсация хроматина) утолщение одного или обоих гомологических плеч хромосом), 4% - составляют дицентрики и 4% - поликлоиды. Клеток, содержащих набор хромосом меньше нормы, было 75%; а 8,33% имело число хромосом больше, чем 38. Этот штамм в 4,2% случаев вызывал фрагментацию хромосом. Пример 2. Получение повреждений хромосом клеток с помощью ротавируса свиней. Применяемая культура клеток ПТП. Используемый штамм "K" ротавирусной болезни свиней. Выращивание клеток, их инфицирование, получение метафазных пластинок хромосом, их окраска проведена, как указано и в примере №1. В инфицированной культуре клеток уровень метафазных пластинок хромосом достоверно выше по сравнению с контролем (P < 0,001). Получен широкий спектр повреждений хромосом: парные и одиночные разрывы, "гены", образование полиплоидов. Наибольший процент приходится на клетки с одиночными и парными разрывами хромосом с образованием фрагментов (26,1%). Положительный результат достигается выбором перевиваемых культур клеток свиней СПЭВ и ПТП, так как мутагенная чувствительность этих клеток ин витро более высокая (культура клеток более однородная система), чем у культур лимфоцитов или при использовании свиней. При осуществлении заявляемого способа не нужны животные-доноры крови, не нужно вести отбор крови, достигается повторяемость результата и эффективность повреждения хромосом клеток свиней. Применение штаммов вируса ТГС "Пурдью-115" и "П1439/81", а также штамма "K" ротавируса свиней приводит к повреждению хромосомного аппарата клеток. При осуществлении данного способа происходит экономия затрат, расходуемых на материалы: не нужно применение дорогостоящих реактивов - фитогемаглютинина (импортного производства), а также экономится культуральная среда, так как для выращивания указанных клеток подходят менее обогащенные среды, в состав которых входит только 30% и 45% среды 199, также импортируемой и дорогой (т.к. на Украине она не производится), а выращивание лимфоцитов производят на 100% среде 199 или зарубежном дорогом аналоге PM1. При выращивании культуры лимфоцитов применяют эмбриональную сыворотку телят (также дорогую и не производящую на Украине), а при применении указанных в способе культур клеток применяют отечественную сыворотку КРС, более дешевую и производимую в Украине.