Спосіб визначення мононуклеарних фагоцитів

Винахід відноситься до медицини, а саме до морфометрії, і може бути використаний при патологоанатомічному вивченні біопсійного матеріалу, зокрема при дослідженні пухлин. Відомо, що вивчення біопсійного матеріалу часто буває основним фактором при постановці діагнозу. При цьому точність і достовірність діагнозу залежить у тому числі і від вмісту різних популяцій мононуклеарних фагоцитів у тканині, яка вивчається [Суслов А.П. Макрофаги и противоопухолевый иммунитет // Итоги науки и техника ВИНИТИ. Сер. "Онкология", - 1990. -19. - С. 168]. Існує декілька засобів, які дозволяють виявляти мононуклеарні фагоцити у тканинах. Усі ці засоби засновані на ідентифікації гранул нейтральних мукополісахаридів, які містяться у цитоплазмі мононуклеарних фагоцитів. Ці гранули не стійкі до дії амілази і свідчать про напруження процесів гліколізу у цитоплазмі клітин [Серов В.В., Ше хтер А.Б. Соединительная ткань. - М.: Медицина, 1981. - 312 с.]. Це такі засоби, як метод Шабадаша, ШІК-реакція по Мак-Манусу, метод Беста [Кононский А.И. Гистохимия, - К.: Вища школа, 1976. 278 с.]. Одним з класичних гістохімічних методів Ідентифікації мононуклеарних фагоквитів є ШІК-реакція по МакМанусу [Кононский А.И. Гистохимия. - К.: Вища школа, 1976. - 278 с]. Незважаючи на те, що цей метод Ідентифікації мононуклеарних фагоцитів використовується давно, є відносно простим, достатньо точним (при умові використання контроля з амілазою), він не дозволяє виділити серед популяції мононуклеарних фагоцитів клітини, які мають цитотоксичні властивості, рівно як і клітини, які мають супресорні властивості. Виділення цих двох популяцій мононуклеарних фагоцитів має велике значення при патологоанатомічному вивченню біопсійного матеріалу, зокрема при дослідженні пухлин [С услов А.П. Макрофаги и противоопухолевый иммунитет // Итоги науки и техники ВИНИТИ. Сер. "Онкология". - 1990. - 19. 168 с]. Останнім часом для виявлення мононуклеарних фагоцитів використовують прямий засіб Кунса [Пирс Э. Гистохимия теоретическая и прикладная. - М.: Иностр. лит-ра, 1962. - 731 с] з моноклональними антитілами (МКА) проти антигенів мононуклеарних фагоцитів, наприклад МКА серії ІКО. Так ІКО-ГМ І проти антигенів СД 11В дозволяють виявити моноцити, гранулоцити та NK-клітини. Засіб легко виконується, є високоспецифічним та досить Інформативним. Незважаючи на такі переваги, вказаний засіб має суттєвий недолік: він не дозволяє виділити з загально! популяції мононуклеарні фагоцити, які мають цитотоксичні та супресорні властивості. Тому вказаний засіб не може використовуватися для диференційного дослідження різних популяцій мононуклеарних фагоцитів. Завданням цього винаходу є визначення складаючих популяцій мононуклеарних фагоцитів шля хом виділення клітин, що мають цитотоксичну активність та мононуклеарних фагоцитів з супресорною активністю, у підсумку підвищення точності та вірогідності діагнозу. Поставлене завдання реалізується початковою обробкою половини препаратів 0,1% розчином Індометацину протягом 12 гадин до відомого оброблення препаратів по засобу Кунса. Як відомо, Індометацин (Indometacinum) становить собою порошок, випускається у капсулах по 0,025 г. Відомо, що Індометацин інгібує вибірково мононуклеарні фагоцити - супресори [Сохин А.А., Чернушенко Е.Ф. Прикладная иммунология. - К.: "Здоров'я, 1984. - 315 с]. Спроба застосування Індометацину In vitro є у біохімічних дослідженнях [Черкашин И.С., Пелещук А.П., Пятик О.А. Справочник по клинической фармакологии и фармакотерапии. - К.: "Здоров'я", 1986. - 734 с.]. З теорії Arlens [Occupation theory // Маждраков Г., Панхристов П. Лекарственная болезнь. - София: Медицина и культура, 1973. - 605 с.] можна уявити взаємодію Індометацину та клітини-мішені так. Молекула індометацину виявляє спеціальний аффінітет до молекул деяких мононуклеарних фагоцитів (супресорів). Від моменту застосування лікарської речовини до появи цитотоксичного ефекту по відношенню до макрофагів-супресорів відбувається ряд процесів: створення достатньої концентрації у так званій біофазі, тобто у безпосередній близості з рецепторами, далі молекули Індометацину взаємодіють з рецепторами макрофагів та на фоні змін на рівні самого рецептора формується так званий стимул, який веде до виразного фармакологічного ефекту у вигляді цитотоксичної дії або іншої. Конкретний ефект взаємодії індометацину та рецепторів мононуклеарних фагоцитів у теперішній час не вивчено та визначається, на нашу думку, співвідношеннями між елементами одної чи декількох рецепових констеляцій, які можуть динамічно змінюватися протягом метаболічнихпроцесів. Необхідність занурювання у 0,1% розчин індометацину саме на 12 годин було встановлено нами шляхом обробки серійних зрізів тканини у 0,1% розчині індометацину протягом декількох відмінних відрізків часу. Так один зріз тримали у розчині індометацину 3 години, другий - 6 годин, третій - 9 годин і нарешті четвертий зріз 12 годин при температурі 37°С. Саме у останньому зрізі не виявлялися навіть сліди мононуклерних фагоцитів чутливи х до Індометацину, тоді як у першому зрізі ніякі зміни не відбулися, у другому - зменшилася Інтенсивність імунофлюорісценції у деяких клітинах, у третьому – імунофлюорісценція не відмічалась у частині клітин повністю і у частині клітин зонально. За даними літератури час проінкубації біологічних субстратів з індометацином коливається від 1 години до 24 годин [Шпарык Я.И, Индометацин как модулятор активности естественных киллерных клеток // Врачебное дело, 1990. - №8. - С. 32-36]. Мінімальна кількість розчину Індометацину, яка необхідна для обробки препарату має бути не менша ніж 10 мл, щоб зріз був цілком вкритий розчином. Ми використовували фармакологічну дозу препарату - 1 мг/мл, для чого виготовляли 0,1% розчин. Реакція виконувалася при температурі 37°С, яка є оптимальною температурою, близькою до фізіологічної у людини, за якою відбуваються усі метаболічні процеси. Внаслідок обробки зрізів Індометацином не забарвлюються супресорні мононуклеарні фагоцити. У необроблених індометацином препаратах визначали загальну кількість мононуклеарних фагоцитів (МФзаг); з оброблених Індометацином препаратів визначали кількість мононуклеарних фагоцитів з цитотоксичними властивостями (МФц ). Різниця між двома вищевказаними показниками (МФзаг та МФц ) дозволяла визначати кількість мононуклеарних фагоцитів, що мають супресорні властивості (МФс). Спосіб здійснюється таким чином. Матеріал, який досліджується, наприклад пухлину, використовували для виготовлення серійних кріостатних зрізів, товщиною 5-6 мкм. Достатньо двох зрізів. Перший зріз вміщують у 0,1% розчин Індометацину на 12 годин при температурі 37°С у термостат. Після цього перший і другий зрізи обробляли по прямому методу Кунса з використанням МКА проти клітин системи мононуклеарних фагоцитів: наприклад МКА ІКО ГМ 1 (антиген СД 11в). Готові препарати досліджувалися на люмінісцентному мікроскопі при збільшенні 400. При дослідженні зрізу, який не оброблявся Індометацином, визначали кількість загальної популяції мононуклеарних фагоцитів (МФзаг) у полі зору при збільшенні 400. У зрізі, який попередньо оброблявся розчином індометацину, підраховували кількість мононуклеарних фагоцитів, які мають цитотоксичні властивості (МФц ). Потім підраховували різницю між загальною кількістю мононуклеарних фа гоцитів І кількістю мононуклеарних фагоцитів, які мають цитотоксичні властивості. Ця різниця уявляє з себе показник кількості мононуклеарних фагоцитів-супресорів (МФс). Таким чином, запропонований засіб дозволяє виділити дві популяції мононуклеарних фагоцитів, а саме мононуклеарні фагоцити з цитотоксичною дією І мононуклеарні фагоцити-супресори. Приклад. Протокол №1 патологоанатомічного дослідження біопсії вилученого яєчника з ознаками рака. Для повного патологоанатомічного висновку у біопсійному матеріалі виявляють, наряду з іншими параметрами, і стан мононуклеарних фагоцитів. Виготовляли 4 кріостатні зрізи серійні, товщиною 5-6 мкм. Два зрізи вміщували у 0,1% розчин індометацину на 12 годин при температурі 37°С у термостаті. Потім зрізи промивали у дистильованій воді 2 рази по 15 хвилин та один раз у фізіологічному розчині (рН 7,4)-15 хвилин. Після цього усі 4 зрізи обробляли по методу Кунса з МКА ІКО Г М І. У полі зору препарату при збільшенні 400 підраховували кількість клітин, які світяться. У необроблених Індометацином препаратах підраховували загальну кількість мононуклеарних фагоцитів (мал.1). У оброблених індометацином препаратах підраховували кількість мононуклеарних фагоцитів, які мають цитотоксичні властивості (МФц ) (мал.2). Підраховували різницю між цими двома показниками і отримували показник кількості мононуклеарних фагоцитів-супресорів (МФс). Кількість загальної популяції мононуклеарних фагоцитів у полі зору х 400 склала 18,0±2,8 екз. (МФзаг). Кількість мононуклеарних фагоцитів з цитотоксичними властивостями (МФц ) у полі зору х 400 рівнялася 11,0±1,8 екз. Тоді кількість мононуклеарних фагоцитів супресорів дорівнювалась МФзаг – МФц = 18-11 = 7 екз. Таким чином, у стромі папілярного рака яєчника виявлено співвідношення цитотоксичних і супресорних мононуклеарних фагоцитів як 11:7, що свідчить про несприятливий прогноз.