Спосіб приготування препаратів крові для люмінесцентної мікроскопії

Изобретение относится к биологии и медицине, а именно к иммунологическим методам исследования, и касается оптимизации люминесцентного микроскопирования для определения функциональной активности лимфоцитов крови. Известен способ приготовления мазков крови [Зеленин A.B. Люминесцентная цитохимия нуклеиновых кислот. - М.: На ука, 1974], который состоит в следующем: гепаринизированную кровь тщательно пипетируют, а затем берут в количестве 0,02 мл и готовят тонкий мазок, который после высушивания и фиксации окрашивают акридин оранжевым, Известен также способ приготовления мазков белой крови [Завгородняя Е.Т., Шахмардонов М.З., Исаева Н.П. Модифицированный метод определения функциональной активности лимфоцитов крови с использованием акридина оранжевого. // Клиническая лабораторная диагностика. - №2. - 1993], принятый в качестве прототипа, и состоящий в следующем: гепаринизированную кровь отстаивают в термостате при температуре 37°С в течение 20-30 мин. Полученную плазму в соотношении 1:1 разводят раствором питательной среды 199. Из полученного раствора, взятого в объеме 0,02 мл, готовят тонкий мазок, который после высушивания фиксируют 20 мин в смеси 96° этилового спирта и ацетона (1:1), а затем проводят через батарею спиртов понижающейся концентрации. Затем мазок крови окрашивают акридин оранжевым с предварительной инкубацией в цитрато-фосфатном буфере и промывкой в нем же после окрашивания. Признаками, общими с существенными признаками аналогов, являются: забор крови, отделение лейкоцитов с осаждением эритроцитов, фиксация и проведение препарата через батарею спиртов с последующей окраской акридин оранжевым. Однако известные методики имеют следующие недостатки. Так, кроме клеточных стр уктур, плазма крови также люминесцирует за счет находящихся в ней веществ, соединяющихся с акридин оранжевым, и тем самым приобретающих способность к флуоресценции. Кроме того, в плазме находятся вещества, способные к спонтанной флуоресценции (это относится к клеточным метаболитам, клеточному детриту и др.). Количество данных веществ в плазме не контролируется исследователями и сильно колеблется у разных здоровых индивидов и, особенно, у больных, которые получают различные лекарственные препараты. Большая часть данных препаратов сами, а также их метаболиты, являются флуорохромами, или же активно взаимодействует в акридин оранжевым, вызывая наведенную люминесценцию. Следует иметь в виду, что патологический процесс вносит значительные вариации в концентрацию метаболитов и клеточного детрита потенциальных флуорохромов, Возникающая при этом вариация фоновой люминесценции является нежелательной, так как вносит довольно значительную погрешность в измерение свечения клеточных структур, делая результаты разных опытов тр удно сопоставимыми. В связи с этим возникает необходимость снижения и стандартизации показателей фоновой люминесценции. В основу изобретения поставлена задача создать такой способ приготовления препаратов крови, в котором центрифугирование собранной плазмы и замена ее на эмбриональную телячью сыворотку, добавляемую к дважды отмытому средой 199 осадку лейкоцитов в равном к нему объеме, позволили бы устранить показатели неконтролируемой фоновой люминесценции и обеспечить 4-5-тикратное увеличение концентрации клеток в мазке, и за счет этого повысить объективность и оперативность оценки функциональной активности клеточных элементов крови. Способ осуществляют следующим образом. Проводят забор крови из пальца или вены в пробирки с антикоагулянтом. Кровь отстаивают в термостате при температуре 37°С в течение 15-20 мин с добавлением желатины до 1% в конечной концентрации для достижения полноты оседания эритроцитов. Затем полученную белую кровь переносят в центрифужные пробирки и центрифугир уют в течение 5 мин при 1000 оборотов в минуту. После этого надосадочную жидкость (аутоплазму) удаляют, а оставшийся осадок промывают дважды 1 мл среды 199. К промытым клеткам добавляют эмбриональную телячью сыворотку в объеме, равном объему осадка, после чего полученный лейкоконцентрат тщательно пипетируют. Из полученного раствора, взятого в объеме 0,02 мл, готовят тонкий мазок, который фиксируют, проводят препарат через батарею спиртов, а затем окрашивают акридин оранжевым. Эмбриональная телячья сыворотка обладает довольно низким уровнем люминесценции; кроме того, свечение данной сыворотки - величина практически постоянная, поэтому замена аутоплазмы на эмбриональную телячью сыворотку значительно снижаетроль фоновой люминесценции при определении функциональной активности клеток крови. Концентрация лейкоцитов в 4-5 раз значительно ускоряет клеточное микроскопирование. Пример. Для сравнения взято 50 мазков крови, приготовленных по известной методике, и 50 мазков, приготовленных с использованием заявляемого способа. На каждом мазке измерялось несколько фоновых значений люминесценции, после чего высчитывалась средняя величина свечения фона по мазку крови. Измерения проводились на микроспектрофлуориметре МСФ-2. Мазки красились акридин оранжевым (рабочая концентрация красителя - 1:25000). Длина волны возбуждающего излучения - 436 нм. Измерялась интенсивность свечения фона в красной I640 нм) и зеленой (I530 нм) полосах спектра, а также соотношение этих двух величин, называемое a-параметром I640 / I530). Данные люминесцентного анализа фона мазков крови приведены в таблице, которая дает наглядное подтверждение тому, что средние показатели интенсивности флуоресценции фона и их ошибки при длине волны 530 и 640 нм в мазках, приготовленных с помощью заявленного способа, значительно меньше (0,51±0,01 и 0,35±0,01 у.е. соотве тственно), чем при стандартном методе (0,85±0,04 и 0,54±0,07 у.е. соответственно). Кроме того, показатели свечения фона мазков при заявляемом способе приготовления, варьируют в меньшей степени. Так, коэффициенты вариации І530 и I640 равны 16% и 20% соответственно и совпадают с таковыми для однородной совокупности (5). Эти же показатели в мазках крови, приготовленных по общепринятой методике, значительно варьируют (коэффициент вариации І530 и I 640 равен 32% и 96% соответственно), что в 2-5 раз превышает его уровень в мазках, приготовленных по заявляемому способу. Снижение уровня и величины вариаций флуоресценции для мазков, флуорохромированных акридин оранжевым, приготовленных по предлагаемому способу, до минимальных значений, дает основание считать, что поставленная задача достигнута. Объективность люминесцентного микроскопирования, в случае его применения, повысится, так как фоновые значения уже не будут значительно влиять на значения флуоресценции клеточных структур в мазках крови разных индивидов и мазках крови лиц, наблюдаемых в динамике при воздействии различных факторов среды.