Спосіб визначення параметрів електропробою клітинної мембрани

Спосіб визначення параметрів електропробою клітинної мембрани, що включає подачу на електроди, занурені в середовище, імпульсів напруги із зростаючою від нуля по заданому закону ампліту 3 24210 визначення провідності рідких середовищ [заявка на кор. мод. №U 2006 07704, пріоритет 10.07.06, позитивне рішення 12.09.06., G01N 27/06, G01R 27/22]. Спосіб включає подачу на електроди, занурені в рідке середовище, прямокутних імпульсів напруги із зростаючою від нуля по заданому закону амплітудою, обчислення провідності і побудову графіка її залежності від напруженості поля між електродами. По графіку судять про характер зміни провідності середовища в даному інтервалі напруженості. Проте, цей спосіб не забезпечує фізично коректного і достовірного визначення конкретних значень напруженості імпульсного поля при відповідних необоротних змінах провідності біооб'єкту. Це не дозволяє досліджувати такі необоротні процеси з різким зростанням провідності, як пробій мембрани клітини при критичній для неї напруженості електричного поля, тим самим не забезпечується можливість визначати параметри електропробою мембрани. Самі значення цих параметрів залежать від багатьох чинників, зокрема, від властивостей середовища, зовнішніх фізичних умов експерименту, а, крім того, визначаються видовою специфічністю клітин, їх розміром і т.п. У зв'язку з цим для практики клітинної біотехнології представляє інтерес знання конкретних величин параметрів електропробою в цих умовах з тим, щоб можна було ефективно проводити різні електроманіпуляції з живими клітинами, не допускаючи при цьому критичних значень поля, тобто необоротного електропробою мембрани і пошкодження клітини. У основу корисної моделі поставлена задача удосконалити спосіб визначення провідності шляхом дії імпульсним полем на клітину та подальшого аналізу необоротної зміни її провідності. Поставлена задача вирішується тим, що у відомому способі визначення провідності, що включає подачу на електроди, занурені в середовище, імпульсів напруги із зростаючою від нуля по заданому закону амплітудою і визначення залежності провідності від напруженості поля, згідно корисної моделі, між електродами в середовищі впритул до них розташовують досліджувану клітину, а визначену для неї залежність провідності від напруженості поля аналітичне апроксимують двома прямими і обчислюють координати точки їх перетину, які вважають значеннями параметрів електропробою клітинної мембрани, причому, абсциса дає напруженість поля, а ордината - провідність клітини у момент пробою. Суть корисної моделі пояснюється графіком. На ньому зображені експериментальні точки (з погрішностями) залежностей провідності яйцеклітин (ооцитів) миші від напруженості імпульсного поля при температурі середовища 25°С і 35°С. На обох залежностях приведені також відповідні лінії і рівняння апроксимуючих прямих, кожна пара яких, перетинаючись, дає точку з координатами параметрів електропробою мембрани клітини при даній температурі середовища. Заявлена корисна модель реалізується таким чином. Між електродами, зануреними в середовище, поміщають впритул до них досліджувану клітину, наприклад, ооцит і подають відому імпульсну 4 напругу із зростаючою від н уля амплітудою по заданому закону, наприклад, лінійно. Вимірюють струм, що протікає у момент проходження імпульсу через ооцит. Далі по відомим і виміряним значенням розраховують провідність клітини. Обчислені значення провідності можна, але не обов'язково, нанести на графік залежно від напруженості поля. Одержану залежність умовно розбивають на дві гілки по характеру зростання: слабке і різке зростання провідності. Далі методом якнайменших квадратів проводять апроксимацію двох гілок залежності лінійними функціями до і після передбачуваного пробою, наявність якого визначають по різкому, тобто необоротному, зростанню провідності. Після цього обчислюють координати точки перетину апроксимуючих прямих, вирішуючи спільно систему двох лінійних рівнянь згідно відомому правилу аналітичної геометрії. Обчислені значення координат точки перетину прямих вважають початком необоротного розриву - електропробою мембрани. Ці координати і є параметрами електропробою, причому, абсциса це напруженість пробою, а ордината - провідність клітини у момент розриву мембрани. Приклад 1. Одержана експериментальна залежність провідності ооциту миші від напруженості поля при температурі середовища 25°С. Проведена лінійна апроксимація двох гілок цієї залежності прямими, рівняння яких записані в загальному вигляді. Таким чином, одержана система лінійних рівнянь (див. графік для 25°С): ì 22,62G - E + 109,69 = 0 í î2576,2 G -E - 6695,7 = 0, де G і Е поточні змінні: провідність клітини і напруженість поля відповідно. Вирішуючи систему лінійних рівнянь, обчислюють координати точки перетину прямих (E25, G25) згідно відомим формулам аналітичної геометрії. Для цього ділять детермінант при кожному невідомому на головний детермінант системи: -1 - 6695,7 2576,2 -1 E25 = : = 2,67 кВ / см - 1 109,69 22,62 - 1 G25 = - 6695,7 2576,2 109,69 22,62 : 2576 ,2 - 1 22,62 - 1 =169 ,97 мкСм / см Таким чином, обчислені параметри електропробою мембрани ооциту миші при t=25°C складають: напруженість поля Е25=2,67кВ/см, провідність у момент розриву мембрани G25 »170мкСм/см. Приклад 2. Одержана експериментальна залежність провідності іншого ооциту миші від напруженості імпульсного поля при температурі середовища 35°С. Проведена лінійна апроксимація двох гілок цієї залежності і одержана система лінійних рівнянь (див. графік для 35°С): ì 59,34 G -E + 169,44 = 0 í î1596,1G - E - 3037,6 = 0, де G і Е мають той же сенс, що і в прикладі 1. Проводячи аналогічні обчислення координат (Е35, G35) точки перетину прямих цієї системи, які виконуються за таким же принципом, як і в при 5 24210 кладі 1, набуваємо наступні значення параметрів електропробою мембрани ооциту миші при t=35°C: напруженість поля. Е35»2,09кВ/см, провідність у момент розриву мембрани G35»293мкСм/см. По обчислених значеннях параметрів електропробою видно суттєвий вплив температури середовища на електричну міцність мембрани ооциту. Таким чином, ці приклади показують, що пропонований спосіб дозволяє точно і достовірно, відповідно до вибраної моделі лінійної апроксимації, обчислювати параметри електропробою мембрани клітини. Перевага способу, що заявляється, полягає у тому, що на відміну від прототипу він дозволяє аналізувати необоротні процеси з різкою зміною Комп’ютерна в ерстка А. Крулевський 6 провідності, такі, як пробій клітинної мембрани. Це дає можливість досліджувати вплив різних чинників на її електричну міцність, а розміщення клітини впритул до електродів дозволяє знизити втрати енергії імпульсу на провідність середовища, тим самим зменшити її шунтуючий вплив. Крім того, запропонований спосіб простий в здійсненні, не вимагає великих обчислювальних ресурсів і дозволяє підвищити інформативність визначення електрофізичних властивостей біооб'єктів, що мають чутливі стр уктурні елементи та схильність до необоротного руйнування з втратою життєздатності при перевищенні критичних значень зовнішніх дій. Підписне Тираж 26 прим. Міністерство осв іт и і науки України Держав ний департамент інтелектуальної в ласності, вул. Урицького, 45, м. Київ , МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислов ої в ласності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601