Спосіб відновлення вакцинного штаму туляремійного мікроба

1. Спосіб відновлення вакцинного штаму туляремійного мікроба, що полягає у відборі субкультури вакцинного штаму збудника туляремії, 3 24540 біосинтез внаслідок фенотипової мінливості. Відбір найбільш типових культур мікроба (селекція), що її проводили з метою відновлення втрачених властивостей штаму, здійснювалась шляхом введення біопробній тварині in vivo суміші культури та певного складу інгредієнтів. Недоліком прототипу для використання його в заявленій моделі є необхідність багаторазових повторів методу in vi vo біопробним тваринам для досягнення результату, а також відсутність можливості виділити вакцинні форми (SR-форми) культури. Задачею способу відновлення вакцинного туляремійного штаму є оптимізація його шляхом введення етапу селективного відбору найбільш імуногенних форм збудника туляремії, що забезпечує підвищення залишкової вірулентності, а також значне скорочення терміну відновлення штаму та здешевлення цього процесу, насамперед, за рахунок скорочення кількості біопробних тварин. Задача досягається тим, що у способі відновлення вакцинного штаму, наприклад, туляремійного мікробу, культивування in vivo здійснюють одноразово, після чого готують модельне біосередовище для наступного одно-, кількаразового культивування вакцинного штаму in vitro при температурі 37,0±0,5°С протягом 24-48 годин. Модельне біосередовище готують з кролячої або людської сироватки, розведеної фізіологічним розчином у співвідношенні 1:1. Запропонований спосіб відновлення туляремійного вакцинного штаму реалізують наступним чином. Пасаж in vivo. Здійснюють одноразовий пасаж суспензії (0,2-0,5мл) досліджуваної культури в фізіологічному розчині в концентрації 103105м.к./мл підшкірно біопробним тваринам (білі миші). Через 15-20 діб, після патанатомічного розтину, проводиться пасаж біопробного матеріалу на елективне середовище Мак-Коя (2-3 пасажі) культивування при 37±0,5°С впродовж 48-72 год. Селекція найбільш імуногенних варіантів культури in vitro. Для туляремійного вакцинного штаму наступні пасажі in vivo замінюються одноразовим пасажем in vitro на 50% сироватці теплокровних (модельне біосередовище). За основу брали методику, що полягає у вра хуванні високої патогенності туляремійного мікробу для організму людини та тварин, безпосередньо - різної чутливості вірулентних, авірулентних та атен уйованих культур збудника туляремії до бактерицидної дії сироватки деяких теплокровних [5]. На даному етапі готують модельне біосередовище - 50% сироватку крові теплокровних. Нормальна сироватка крові людини готується на станції переливання крові, розливається в стерильні пробірки по 1мл та зберігається при t=-10°С. Сироватку від тварин (морські свинки, кролики) одержують ex tempore способом, що передбачає: розлив крові (без консерванту) до стерильних пробірок (до 5мл), витримування при t°=37±0,5°С протягом однієї години, після чого ретельно відокремлюють кров'яний згусток від стінок пробірки та дають відстоятися при t°=4±0,5°С протягом 1-2 год. Після цього пастерівською піпеткою обережно відбирають сироватку, переносять її до пробірок в об'ємі 1,0мл та зберігають при -10°С. 4 Перед використанням модельного середовища нормальну сироватку розводять фізіологічним розчином 1:1 та одержують робочу концентрацію 50% нормальної людської сироватки (НЛС) або нормальної кролячої сироватки (НКС). Одержання культури відновленого туляремійного вакцинного штаму: Бактерії суспендують у фізіологічному розчині, змиваючи з поверхні щільного жовткового середовища Мак-Коя. Отриману завись (1 млрд. за галузевим стандартним зразком мутності) титрують у фізіологічному розчині до 107м.к./мл, потім 0,1мл цієї зависі засівають в 1,0мл 50% НКС, з подальшим інкубуванням при 37±0,5°С протягом 24-48 годин. Після цього 0,1мл отриманої зависі культури висівають на чашки Петрі з туляремійним FT-агаром та проводять культивування при 37±0,5°С впродовж 48 - 72 годин. Одержують ізольовані імуногенні SR-колонії вакцинного штаму, які мають залишкову вір улентність та характеризуються мінімальним ступенем дисоціації. Для накопичення бактеріальної маси одержані SR-колонії культивують кількаразово на елективних середовищах - щільному жовтковому середовищі Мак-Коя та туляремійному FT-агарі 3-4 рази, контролюють відповідно до вимог НТД та зберігають у напіврідкому (0,7% FT-агарі) або ліофілізованому стані. Запропонований спосіб, у порівнянні з прототипом, обумовлює: 1) можливість відновити життєздатність імуногенних форм вакцинного туляремійного штаму, що мають залишкову вірулентність; 2) значно коротший термін виконання (1 місяць проти 2-3-місячного терміну); 3) одноразове проведення пасажів in vivo замість 3-4-разових. Таким чином, запропонована сукупність ознак способу забезпечує підвищення залишкової вірулентності, а також значне скорочення терміну відновлення штаму та здешевлення цього процесу, насамперед, за рахунок скорочення кількості біопробних тварин. Приклад 1. Завись культури вакцинного туляремійного штаму у фізіологічному розчині розтитровували до концентрації 1x107м.к./мл, засівали в кількості 0,1мл у пробірку з 1мл 50% НКС (модельне біосередовище). Інкубували при 37±0,5°С 24 год. Наступний висів 0,1мл зависі із пробірки на чашку Петрі з FT-агаром виявив 58 ізольованих імуногенних SR-колоній вакцинного штаму. Приклад 2. Завись культури вакцинного туляремійного штаму у фізіологічному розчині розтитровували до концентрації 1x107м.к./мл, засівали в кількості 0,1мл у пробірку з 1мл 50% НЛС (модельне біосередовище). Інкубували при 37±0,5°С 48 год. Висів 0,1мл зависі із пробірки на чашку Петрі з FT-агаром виявив 88 ізольованих імуногенних SR-колоній вакцинного штаму. Аналогічним чином виконували наступні (2-й та 3-й) пасажі та накопичували імуногенні колонії у трикратному розмірі. Джерела посилань 1. Патент РФ №2163265 Способ культивирования микроорганизмов. Дата подачи заявки: 1999.04.27. Заявитель (патентообладатель): Ста 5 24540 вропольский научно-исследовательский противочумный институт. Дата п убликации: 2001.02.20. 2. Патент РФ №2102484 Способ восстановления вирулентности штаммов сибиреязвенного микроба. Дата подачи заявки: 1995.01.31. Заявитель (патентообладатель): Ставропольский научно-исследовательский противо-чумный институт. Дата публикации: 1998.01.20. 3. Олсуфьев, «Таксономия, микробиология и лабораторная диагностика возбудителя туляре Комп’ютерна в ерстка А. Крулевський 6 мии» - Москва, 1975, стр.110, 113. 4. Патент РФ №2155962 Способ восстановления способности к биосинтезу капсульного антигена чумного микроба Дата подачи заявки: 1999.02.04. Заявитель (патентообладатель): Ставропольский научно-исследовательский противочумный институт. Дата п убликации: 2000.09.10. 5. Методические рекомендации по оценке вирулентности штаммов Francisella tularensis in vitro, Ростов-на-Дону, 1994. Підписне Тираж 26 прим. Міністерство осв іт и і науки України Держав ний департамент інтелектуальної в ласності, вул. Урицького, 45, м. Київ , МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислов ої в ласності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601