Спосіб виготовлення живильного середовища для культивування лептоспір

1. Спосіб виготовлення живильного середовища для культивування лептоспір, що полягає у використанні кролячої сироватки, який відрізняється тим, що перед додаванням сироватки до основи живильного середовища виявляють токси 3 24539 (РМА) з сироватками людей та тварин, ведуть до загибелі музейних штамів діагностичного набору лептоспір. В якості прототипу обрано рецептуру живильного середовища, що наведена в «Приказе №1152 МЗ СССР от 13.11.1979г. "О профилактике заболеваний людей лептоспирозом" [2]. Відповідно до способу прототипа для виготовлення живильного середовища використовують дистильовану воду отриману із водогінної води, рН якої фосфатними розчинами доводять до і після стерилізації (рН 7,27,4). Пробірки, у яких після стерилізації в автоклаві з'явився кристалічний, або аморфний осад видаляють. У кожну пробірку з прозорим вмістом та з рН 7,2 - 7,4 в стерильних умовах добавляють інактивовану протягом 30 хвилин при +56°С нормальну кролячу сироватку в кількості 1-2 краплі на 1,0мл забуференої води. До недоліків прототипу можна віднести те, що в кролячій сироватці не визначають токсичні фактори щодо лептоспір, наявність можливих неспецифічних аглютининів. Оптимальну концентрацію сироватки перед внесенням її до дистильованої води також не визначають. До недоліків прототипу також можливо віднести використання води приготовленої на основі дистиляції водогінної води, яка може мати токсичну дію в зв'язку з присутністю в ній токсичних речовин (фенол та хлорорганічні сполуки), що не видаляються при дистиляції, до яких лептоспіри є високочутливими. Недостатня кількість кролячої сироватки в живильному середовищі (у разі відсутності токсичної дії сироватки) веде до повільного приросту кількості лептоспір. Перевищення концентрації сироватки у живильному середовищі приводить до аутоаглютинації лептоспір, появи зернистості, визиває порушення морфології лептоспір та рухомості. Задачею корисної моделі на спосіб виготовлення живильного середовища для культивування лептоспір є підвищення якості живильного середовища для культивування лептоспір, що буде сприяти більш інтенсивному накопиченню лептоспір з характерною для них морфологією та рухливістю. Задача вирішується тим, що у способі виготовлення живильного середовища для культивування лептоспір, при використанні кролячої сироватки, перед доданням сироватки до основи живильного середовища виявляють її токсичність для лептоспір та наявність неспецифічних аглютининів, після чого визначають оптимальну концентрацію придатної кролячої сироватки, що є необхідною для швидкого росту лептоспір. Оцінку токсичності здійснюють за наявністю або відсутністю порушень типових морфологічних ознак бактерій, рухливості лептоспір, росту культури. Оптимальна концентрація кролячої сироватки визначається за критерієм наявності рухливих бактерій з типовою морфологією кількістю 100 та більше у полі зорі. Спосіб реалізується наступним чином: кролячу сироватку контролювали на токсичність, неспецифічних аглютининів та визначали оптимальну концентрацію, необхідну для вирощування лептоспір. Вирощували лептоспіри у зростаючих концентраціях кролячої сироватки від 1% до 10%. Врахову 4 вали інтенсивність росту культури, морфологічні ознаки, рухливість бактерій, визначаючи, таким чином, оптимальну концентрацію сироватки, яка сприяла інтенсивному накопиченню рухливи х лептоспір з типовою морфологією, придатних для пересіву музейних культур та для постановки серологічної реакції мікроаглютинації (РМА). Проводили також вивчення впливу якості дистильованої води на зріст культури лептоспір, готували живильні середовища на дистильованій воді перегнаної із водогінної води та на дистильованій воді перегнаної із води свердловини, взятої із шару води на глибині 120м. Було встановлено, що приготовлені в рівних умовах живильні середовища з доданням однакової кількості кролячої сироватки на дистильованій воді із водогінної води вели до загибелі лептоспір, порушення морфології та рухомості, в той же час живильне середовище приготовлене на дистильованій воді із свердловини давали добре зростання мікроорганізмів, мали характерну морфологію, були добре рухливими з концентрацією лептоспір 100-150 в полі зору мікроскопу. Такі культури можливо використовувати при постановці серологічної реакції мікроаглютинації (РМА), а також для збереження музейних штамів. Визначення концентрації кролячої сироватки у рідкому живильному середовищі досягали шляхом додавання дозованого об'єму кролячої сироватки у живильне середовище Терських, або у дистильовану воду з рН 7,2-7,4. Оптимальну концентрацію визначали для кожної серії сироватки (5-10 літрів). Ємкості з дистильованою водою (рН 7,2-7,4), або з живильним середовищем Терських стерилізували у а втоклаві при +120°С протягом 30 хвилин. В охолоджених розчинах знову перевіряли рН, при необхідності корегували та повторно стерилізували. Стерильне середовище Терських з рН 7,2-7,4, або забуферену дистильовану воду, переносили у 2 ряди по 10 пробірок в об'ємах наведених в Таблиці 1. В обидва ряди параллельно розташованих пробірок вносили зростаючий об'єм кролячої сироватки від 1% до 10%. Пробірки з приготовленим середовищем з різною концентрацією сироватки інактивували у водяній бані при +56°С протягом 30 хвилин, витримували у термостаті 48 годин при +37°С для контролю стерильності. У кожну пробірку із стерильним живильним середовищем з різною концентрацією кролячої сироватки вносили по 0,5мл. одного із штамів діагностичного набору лептоспір (наприклад Leptospirae Icterohaemorrhagiae). Вирощували лептоспіри у термостаті при +29°С протягом 7-10 діб. Перегляд культур, проводили на 710 добу спочатку у промені світла освітлювача 0119, для встановлення характерного лептоспірам росту у вигляді муарових хвиль, які виявляли при легкому струшуванні пробірок, та у відсутності зернистості, характерної для аутоаглютинації. Переглядали вирослі культури у темному полі мікроскопу при збільшені у 150 разів). Визначали кількість лептоспір у полі зору мікроскопу (більше 100 у полі зору мікроскопу). У цьому випадку краплини культури лептоспір наносили на предметне скло та переглядали у темному полі мікроскопу без на 5 24539 кривних скелець при збільшенні у ´150 разів. Також переглядали культури при збільшенні у 300 разів. Краплину культури наносили на предметне скло та накривали накривним скельцем, визначали рухомість лептоспір, відзначали характерний сріблястий відтінок, звертали увагу на морфологію, 6 відсутність аутоаглютинації та порушених лептоспір. Приклад. У 2 ряди стерильних бактеріологічних пробірок (по 10 пробірок у кожному рядку) вносили відповідно з розрахунковою таблицею (Табл.1) Таблиця 1 Розрахунок відсоткового вмісту кролячої сироватки у живильному середовищі Кількість дистильованої води, мл 4,95 4,90 4,85 4,80 4,75 4,50 4,25 4,00 3,75 3,50 Кількість сироватки мл. 0,05 0,1 0,15 0,2 0,25 0,3 0,35 0,4 0,45 0,5 мірними піпетками дистильовану воду, яку дистилювали із води свердловини з рН 7,2-7,4. У пробірки першого та друго го ряду вносили мірною піпеткою кролячу сироватку, у кількості наведеній у Таблиці 1. Пробірки з розведенням сироваток інактивували при +56°С протягом 30 хвилин, культивували 48 годин у термостаті +37°С, переглядали на предмет відсутності росту банальної мікрофлори (контроль стерильності), охолоджували до +18°С та засівали по 0,5мл культури Leptospirae icterohaemorrhagiae. Розміщали у термостат при +29°С на 10 діб. По закінченні цього терміну проводили перегляд культур, спочатку у промені світла освітлювача 01-19, для встановлення характерного росту лептоспір у вигляді муарових хвиль, які виявляли при легенькому струшуванні пробірок та відсутність зернистості, характерної для аутоаглютинації. У пробірках де було внесено 1% і 2% кролячої сироватки виявляли незначні муарові хвилі. Переглядали зрослі культури під мікроскопом та виявляли 20-30 лептоспір у полі зору при збільшені у 150 разів. Токсичність сироватки приводила до зменшення кількості лептоспір у 2 рази (досягала 10-15 у полі зору) з проявами токсичної дії на лептоспіри, вони були фрагментовані, рухомість їх значно знижена, порушені лептоспіри випадали в осад на дно пробірки. В пробірках з концентрацією кролячої сироватки 3%, 4%, 5% виявляли інтенсивні муарові хвилі. Загальне збільшення мікроскопу 150 разів дозволило виявити в полі зору мікроскопу 100-150 добре рухливи х лептоспір з типовою морфологією та характерною рухомістю, осаду на дні пробірок не виявляли, зернистість була відсутньою. Кількість лептоспір у пробірках з 3% - 5% сироватки була в 5-10 разів більшою у полі зору мікроскопу порівняно з пробірками з 1-2%. Вони мали характерну рухливість, сріблястий відтінок при відсутності аутоаглютинації у вигляді "павучків". %% 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Кількість лептоспір у полі зору (´150) 20 ± 5 25 ± 3 170 ± 18 161 ± 15 147 ± 13 81 ± 7 62 ± 6 43 ± 5 21 ± 3 13 ± 3 Починаючи з концентрації 6% і до 10% сироватки виявляли зернистість у пробірках, аглютиновані лептоспіри у вигляді "павучків" -10-15 у полі зору мікроскопу, рухомість їх була зменшеною, виявляли лізовані лептоспіри з порушеною морфологією, на дні пробірок утворювався осад із загиблих лептоспір. Такі культури лептоспір неможливо використовувати у якості антигену в РМА, тому що неможливо диференціювати аглютинацію визвану специфічними антитілами в сироватках, що досліджуються, з внесеними з антигеном аутоаглютинованими лептоспірами під дією високої концентрації сироватки. Таким чином, у нашому прикладі, сприятливою для культивувння лептоспір була концентрація з 3% - 5% кролячої сироватки в живильному середовищі, оптимальна кількість сироватки становила 3% - давала максимальний зріст лептоспір (100150 та більше лептоспір у полі зору мікроскопу) без аутоаглютинації, з характерною рухомістю та морфологією, які можливо використовувати як для пересіву задля збереження музейних культур, а також для проведення серологічних досліджень в реакції мікроаглютинації (РМА). Дистильована вода одержана із свердловини з доведеним рН 7,2 7,4 та оптимальною кількістю кролячої сироватки (3%) є добрим живильним середовищем для лепто спір. Такі ж результати отримували при виготовленні живильного середовища Терських на основі дистильованої води із свердловини з використання 3% кролячої сироватки. Запропонована корисна модель дозволила нам ізолювати велику кількість (біля 150) культур лептоспір від щурів, які були підтверджені Довідковою лабораторією ВООЗ у науково-дослідному інституті епідеміології і мікробііологіі ім. Гамалеї у Москві, як Leptospira icterrohaemorragiae, серовар Copenhagen!, забезпечувати готовими до роботи якісними живильними середовищами, а також музейними штамами лептоспір. Запропонована ко 7 24539 рисна модель забезпечувала покращення діагностики лептоспірозів бактеріологічними лабораторіями відділів особливо небезпечних інфекцій обласних санепідстанцій. Джерела інформації: Комп’ютерна в ерстка Л. Купенко 8 1 .Варфоломеева А.А. Лептоспіроз. М. Медгиз, 1946,40с. 2. Приказ МЗ СССР №1152 от 13.11.1979г. «О профилактике заболеваний людей лептоспирозом». M.1979 С. 58. Підписне Тираж 26 прим. Міністерство осв іт и і науки України Держав ний департамент інтелектуальної в ласності, вул. Урицького, 45, м. Київ , МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислов ої в ласності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601