Спосіб визначення антитіл до вірусу імунодефіциту людини

Изобретение относится к медицине, а именно клинической иммунологии и может быть использовано на этапе скринингового обследования при диагностике СПИД. Известен способ определения антител к вирусу иммунодефицита человека (ВИЧ) методом иммуноблотинга (СПИД. Эпидемиология, клиника, уход за больными, пути передачи, профилактика и программы борьбы // ВОЗ серия СПИД №1, 2, 3. Женева. - С.3), недостатком которого является его дороговизна, невозможность использования при скрининговых исследованиях, и длительность обследования, крайне ограниченное снабжение тест-системами для иммуноблотинга. Известен способ диагностики СПИД по определению антител к ВИЧ методом ИФА, принятый нами за прототип (Закон Украины "Про запобігання захворюванню на СНІД та соціальний захист населення". - К.: Україна, 1993. - С.3). Способ-прототип проводится путем соединения исследуемой сыворотки крови с антигеном вируса иммунодефицита человека (ВИЧ) в лунке полистиролового планшета, термостатируется при 40°C, в течение 30 минут. Затем, после троекратной промывки в лунки планшета вносится конъюгат, вновь термостатируется и повторно промывается. После этого в лунки планшета вносится индикаторная смесь (ортофенилендиамин) и через 30мин добавляется раствор серной кислоты. Далее проводится фотометрирование и по величине оптической плотности определяют антитела к ВИЧ (Егоров A.M., Осипов А.П., Дзантиев Б.Б., Гаврилова Е.М. Теория и практика иммуноферментного анализа. М.: Высш. шк., 1991. - С.77 - 146). Способ-прототип сложен в техническом исполнении, многоэтапен и включает: сорбирование антигена ВИЧ, неоднократные промывки полистмролового носителя специальными буферными растворами, сушку полистиролового носителя, приготовление реактивов, соответствующую подготовку исследуемой сыворотки, использование в реакции канцерогенных индикаторов (ортофенилендиамина) и пр., после чего становится возможным постановка и учет реакции. Он требует также использования сложных и дорогостоящих биотехнологий, промывающего устройства и регистрирующей аппаратуры вертикального фотометра. Кроме того, способ-прототип имеет следующие недостатки: - он не является достаточно специфичным, что не исключает получение ложнопояожительных результатов, которые могут составлять от 10 до 25%; - для уточнения специфичности ИФА требуется обязательное дополнительное верифицирующее (подтверждающее) исследование в иммуноблотинге. В основу изобретения поставлена задача усовершенствования способа определений антител к ВИЧ, в котором, путем соединения исследуемой сыворотки крови с антигеном ВИЧ и дальнейшим определением в полученной биологической смеси содержания свободных небелковых SH-групп, появление которых указывает на наличие антител к ВИЧ, за счет чего обеспечивается повышение специфичности и чувствительности способа, что позволит значительно повысить достоверность способа определения антител к ВИЧ и упростить его. Поставленная задача решается тем, что в предлагаемом способе определения антител к ВИЧ, путем соединения исследуемой сыворотки крови с антигеном ВИЧ, согласно изобретению, осуществляют соединение исследуемой сыворотки крови с антигеном ВИЧ в соотношении 10 : 1, после чего в полученной биологической смеси определяют содержание свободных небелковых SH-групп, появление которых указывает на наличие антител к ВИЧ. Анализ заявляемого технического решения позволил выявить следующие отличия: - соединение исследуемой сыворотки крови с антигеном ВИЧ в соотношении 10 : 1; -определение в полученной биологической смеси свободных небелковых SH-групп, появление которых указывает на наличие антител к ВИЧ. Заявленная совокупность признаков позволит повысить чувствительность и специфичность предлагаемого нами способа определения антител к ВИЧ по появлению свободных небелковых SH-групп в процессе биологической реакции между исследуемой сывороткой крови и антигеном ВИЧ. Известен способ определения свободных небелковых SH-групп в эритроцитах, лейкоцитах, сыворотке крови, например, для определения заболеваний крови, инфарктов внутренних органов и пр., но неизвестно определение свободных небелковых SH-групп в биологической смеси: сыворотки крови, соединенной с антигеном ВИЧ. Известен способ определения антител к ВИЧ, путем измерения оптической плотности биологической смеси в ИФА, но не известен способ определения антител к ВИЧ по появлению свободных небелковых SH-групп в биологической смеси сыворотки крови, соединенной с антигеном ВИЧ. Сущность способа заключается в том, что соединяют исследуемую сыворотку крови с антигеном ВИЧ в соотношении 10 : 1, после чего в полученной биологической смеси определяют содержание свободных небелковых SH-групп, появление которых указывает на наличие антител к ВИЧ. Причем, для создания оптимального стеохимического соотношения между реагирующими центрами антител к ВИЧ с антигеном ВИЧ, нами опытным путем выбрано соотношение между исследуемой сывороткой и антигеном ВИЧ, которое составило 10 : 1. Нами установлено, что только у больных СПИД при соединении их сыворотки крови, содержащей антитела к, ВИЧ, с антигеном ВИЧ в соотношении 10 : 1, в полученной биологической смеси появляются свободные небелковые SHгруппы. У здоровых лиц и у больных инфекционными и неинфекционными заболеваниями, которые не были обусловлены заболеванием СПИД (острые и хронические заболевания сердца, легких, печени, почек, поджелудочной железы патология, нервной системы и пр.), при соединении их сыворотки крови, не содержащей антитела к ВИЧ, с антигеном ВИЧ в соотношении 10 : 1, в полученной биологической смеси не появляются свободные небелковые SH-группы. При разработке предлагаемого способа мы исходили из полученных нами данных, согласно которых появление свободных небелковых SHгрупп в сыворотке крови возможно в условиях денатурации белковых молекул (КостюшовВ.В. // В сб. Актуальные проблемы патологии (Новое в диагностике и лечении). - Т.2 - Одесса: Маяк, 1997. - С.83 - 89). Денатурация же белковых молекул указывает на специфичность их повреждения в процессе биологической реакции антиген-антитело, например, сыворотки крови, содержащей антитела к ВИЧ, с антигеном ВИЧ. В этом плане есть все основания считать, что при денатурации белков сыворотки крови местом их "полома" могут быть дисульфидные мостики. Установлено, что при специфическом повреждении белковых молекул, в результате разрыва смешанных дисульфидных связей появляются свободные небелковые SH-группы (Костюшова Л.А. // В сб. Актуальные проблемы патологии (Новое в диагностике и лечении). - Т.2 Одесса: Маяк, 1997. - С.94 - 98). Указанное выше и явилось предпосылкой для изучения молекулярных тиолопривных механизмов денатурации белков в процессе биологической реакции антиген-антитело, т.е. сыворотки крови, содержащей антитела к ВИЧ с антигеном ВИЧ и разработки предлагаемого нами способа. Предлагаемый нами способ осуществляется следующим образом. У обследуемого, с соблюдением правил асептики, производят забор венозной крови в сухую стерильную пробирку и доставляют в лабораторное отделение. Получают сыворотку крови общепринятым способом. В исследуемой сыворотке крови первоначально определяют спонтанное содержание свободных небелковых SH-групп методом амперометрического титрования (АМТ), на разработанном нами устройстве для АМТ (Заявка на изобретение №96124935, приоритет от 27.12.96). Затем в новый образец этой же исследуемой сыворотки крови добавляют антиген ВИЧ в соотношении 10 : 1 и производят термостатирование такой биологической смеси при температуре 37°C, в течение 10 минут. После этого в такой биологической смеси исследуют содержание свободных небелковых SH-групп методом АМТ, появление или повышение содержания которых указывает на наличие у обследуемого антител к ВИЧ. При определении антител к ВИЧ по предлагаемому нами способу использовался антиген ВИЧ из диагностического набора для скрининга антител к ВИЧ-1 и ВИЧ-2 Simhlired (Австралия). Для сравнения способов определения антител к ВИЧ, исследования проводились предлагаемым нами способом и способом-прототипом. Анализ чувствительности заявляемого нами способа и способа-прототипа показал, что антитела к ВИЧ параллельно обнаружены во всех образцах обследованных больных СПИДом предлагаемым нами способом, способомпрототипом и такие результаты подтверждены при помощи верифицирующего (подтверждающего) исследования методом иммуноблотинга. Это свидетельствует, что определение антител к ВИЧ предлагаемым нами способом совпадает со способом-прототипом и результатами иммуноблотинга (верифицирующего исследования). О более высокой специфичности, точности и диагностической ценности предлагаемого нами способа свидетельствуют данные, согласно которых в предлагаемом нами способе не получены "ложноположительные" реакции, тогда как в способе-прототипе имеют место "ложноположительные" реакции, о чем свидетельствуют проведенные верифицирующие исследования в иммуноблотинге (см. таблицу). Согласно требований руководящих документов Национальной программы профилактики СПИД (Постановление кабинета Совета Министров Украины от 14 марта 1995 №196), нами было обследовано по показаниям 11439 человек. Из них доноров (код - 108) - 4515 человек и по клиническим показаниям (код - 113) 6924 человек. Пример 1. У донора Ф- ва, с соблюдением правил асептики, производили забор венозной крови в сухую стерильную пробирку. Сыворотку крови получали общепринятым способом. В исследуемой сыворотке крови первоначально определяли спонтанное содержание свободных небелковых SH-групп, которое составило 0мкМ/л. Затем, к 900мкЛ новой порции этой же сыворотки крови донора добавляли 100мкЛ антигена ВИЧ. Производили термостатирование такой биологической смеси при температуре 37°C, в течение 30 минут. После этого в исследуемой биологической смеси определяли свободные небелковые SH-группы, содержание которых составило 0мкМ/л, что указывает на отсутствие у донора антител к ВИЧ. При определении способом-прототипом в сыворотке крови донора антитела к ВИЧ так же не были обнаружены, Пример 2. У донора Б-ха, с соблюдением правил асептики, производили забор венозной крови в сухую стерильную пробирку. Сыворотку крови получали общепринятым способом. В исследуемой сыворотке крови первоначально определяли спонтанное содержание свободных небелковых SH-групп, которое составило 0мкМ/л. Затем, к 900мкЛ новой порции этой же сыворотки крови донора добавляли 100мкЛ антигена ВИЧ. Производили термостатирование такой биологической смеси при температуре 37°C, в течение 30 минут. После этого в исследуемой биологической смеси определяли свободные небелковые SH-группы, содержание которых соответственно составило 10мкМ/л, что указывает на наличие у донора антител к ВИЧ. При определении способом-прототипом и методом иммуноблотинга в сыворотке крови донора так же были обнаружены антитела к ВИЧ. Пример 3. Больной З-й, 28.12.95г. поступил в отделение торакалькой хирургии 411 ОВГ с диагнозом: острая двусторонняя нижнедолевая некротическая пневмония. С соблюдением правил асептики 08.01.96г., производили забор венозной крови в сухую стерильную пробирку. Сыворотку крови получали общепринятым способом. В исследуемой сыворотке крови первоначально определяли спонтанное содержание свободу небелковых SH-групп, которое составило 0мкМ/л. Затем, к 900мкЛ новой порции этой же сыворотки крови больного добавляли 100мкЛ антигена ВИЧ. Производили термостатирование такой биологической смеси при температуре 37°C, в течение 30 минут. После этого в исследуемой биологической смеси определяли свободные небелковые SH-группы, содержание которых составило 12,3мкМ/л, что указывает на наличие у больного З-на антител к ВИЧ. При определении способом-прототипом и методом иммуноблотинга в сыворотке крови больного З-на так же были обнаружены антитела к ВИЧ. Пример. У донора Г-ко, с соблюдением правил асептики, производили забор венозной крови в сухую стерильную пробирку. Сыворотку крови получали общепринятым способом. В исследуемой сыворотке крови первоначально определяли спонтанное содержание свободных небелковых SH-групп, которое составило 0мкМ/л. Затем, к 900мкЛ новой порции сыворотки крови донора добавляли 100мкЛ антигена ВИЧ. Производили термостатирование такой биологической смеси при температуре 37°C, в течение 30 минут. После этого в исследуемой биологической смеси определяли свободные небелковые SH-группы, содержание которых соответственно составило 0мкМ/л, что указывает на отсутствие у донора антител к ВИЧ. При определении способом-прототипом в сыворотке крови донора были обнаружены антитела к ВИЧ. Однако при проведении верифицирующего исследования, методом иммуноблотинга антитела к ВИЧ у донора Г-ко не были выявлены, что указывает на отсутствие антител к ВИЧ. Полученные данные свидетельствуют, что заявляемый нами способ является более чувствительным, информативным, имеет высокую диагностическую ценность, не требует дорогостоящего специального оборудования, доступен к широкому применению в различных медицинских учреждениях.