Плазмідний експресуючий вектор р32, кодуючий послідовність днк, відповідаючу за експресію гібридного злитного білка env-2 вірусу імунодефіциту людини другого типу( env bіл-2) в бактеріях e. coli

Винахід відноситься до розділу молекулярної біології, генної інженерії, і може бути використаний при біотехнологічному синтезі білка Env ВІЛ-2 і в медицині, для конструювання тест-систем придатних для виявлення антитіл до ВІЛ-2 в сироватках крові пацієнтів. Прототипами винаходу є сімейство бактеріальних експресіонних векторів типу pEX1-3 (Keith K Stanley and Paul Lusio., Construction of a new family of high efficiency bacterial expression vectors: identification of cDNA clones for human liver proteins. // EMBO Journel vol 3, № 6, pp. 1429 - 1434). Ці вектори проходять від cro-lacZ злитних плазмид, які експресують велику кількість злитних білків під контролем Pr промотору фагу лямбда. В основу винаходу покладене завдання створити генно-інженерну конструкцію, яка забезпечить микробіологічний синтез в E.Coli злитного білка Env ВІЛ-2, у склад якого входять послідовності амінокислот білків Env ВІЛ-2: gp110, gp38. Суть винаходу полягає в одержанні модифікованої послідовності плазмідної ДНК, відповідаючої за синтез злитного білка Env-2 ВІЛ-2 в бактеріях E.Coli (штам ITG-9). Для цього була створена рекомбінантна плазміда pK32, яка містить наступні інсерціонні фрагменти ДНК: фрагмент гену cro розміром 51н. фрагмент Laci, розміром 114н., делегований фрагмент LacZ, розміром 444н., - фрагмент ДНК, відповідаючий за послідовність білка Env-2, розміром 1144н. Фрагменти ДНК з'єднували ДНК-лігазою фага T4 і одержаним лігатом трансформували клітини E.Coli. Рекомбінантні клони E.Coli нарощували і тестували методом імуноблотінгу, використовуючи сироватки крові людини, які утримували антитіла до ВІЛ-2. Подальша модифікація плазміди складалась в одержанні делеції розміром 630п.о. в області бетагалактозідазного гена рестріктазою HPa-1. Фізична карта одержаного плазмідного вектора приведена на фіг.1, 2. Плазміда pK32 кодує гібридний білок молекулярною масою 67752Д. Штам - продуцент гібридного білка (ITG-9) одержували трансформацією клітин E.Coli Y1090 плазмідою pK32. Клітини - продуценти ростуть добре на простих поживних середовищах при температурах 32 - 42 градуси. При рості на м'ясо-пептонному поживному агарі формують гладкі, круглі, плоскі, сірі, блискучі колонії з рівними краями. При рості на рідких поживних середовищах утворюють інтенсивну муть. Джерелом вуглеводів для клітин є вуглеводи, спирти, органічні кислоти. Клітини не споживають ацетат, аданіт, лактозу, ксилозу. Джерелом азоту з'являються пептон, амінокислоти і мінеральні солі в амонійній і нітратній формах. Клітини ростуть при pH 5,0 - 8,0. Синтез гібридного білка відбувається при вирощуванні культури E.Coli ITG-9 при температурі 32 - 42 градуси C. В оптимальних умовах ферментації рекомбінантного штама гібридний білок нагромаджується усередині клітин в нерозчиненій формі у вигляді тілець включення і по кількості складає до 10% всього білка клітин. Гликозилювання білка відсутнє. Клітини рекомбінантного штаму виявляють стійкість до ампіциліну, обумовлену рекомбінантною плазмідою pK32. Амінокислотна послідовність рекомбінантного білка pEnv-2 ВІЛ-2, 531 амінокислота. Молекулярна маса рекомбінантного білка 67752Д. Ізоелектрична точка pI = 6,99.