Спосіб діагностики сніду

Изобретение относится к медицине, а именно клинической иммунологии и может быть использовано для повышения специфичности способа диагностики СПИД на этапе скринингового обследования. СПИД представляет собой заболевание вирусной этиологии, протекающее с поражением иммунной (в первую очередь клеточного звена) и нервной систем и проявляющееся развитием злокачественных новообразований, а также признаками энцефало/миелопатии. Известны клинические способы диагностики СПИД, которые позволяют лишь ориентировочно определять разные клинические формы СПИД (Кожемякин Л.А., Бондаренко И.Г., Тяптин А.А. / СПИД: Синдром приобретенного иммунодефицита. - Л.: Знание, 1990. - С.4), например, клинико-лабораторный, который включает: - снижение количества Т-хелперов в крови; снижение отношения Т-хелперы/Тсупрессоры крови; анемия, или лейкопения, или тромбоцитопения, или лимфопения; - повышение содержания иммуноглобулинов A и G в сыворотке крови; повышение уровня циркулирующих иммунных комплексов; снижение степени реакции бласттрансформации лимфоцитов на митогены; анергия кожи в реакции гиперчувствительности замедленного типа на антигены. Однако известные клинические способы диагностики СПИД являются ориентировочными, не всегда достоверны и неспецифичны для больных СПИД, т.к. встречаются и при других инфекционных и неинфекционных заболеваниях, не связанных со СПИД. Известен способ диагностики СПИД по определению антител к ВИЧ методом ИФА, принятый нами за прототип (Закон Украины "Про запобігання захворюванню на СНІД та соціальний захист населення". - К.: Україна, 1993. - С.3). Способ-прототип проводится путем соединения исследуемой сыворотки крови с антигеном вируса иммунодефицита человека (ВИЧ) в лунке полистиролового планшета, термостатируется при 40°C, в течение 30 минут. Затем, после троекратной промывки в лунки планшета вносится конъюгат, вновь термостатируется и повторно промывается. После этого в лунки планшета вносится индикаторная смесь (ортофенилендиамин) и через 30 минут добавляется раствор серной кислоты. Далее проводится фотометрирование и по величине оптической плотности определяют антитела к ВИЧ, наличие которых свидетельствует о диагнозе СПИД (Теория и практика иммуноферментного анализа. / A.M. Егоров, А.П. Осипов, Б.Б. Дзантиев, Е.М. Гаврилова. - М.: Высш. шк., 1991. - С.77 - 146). Способ-прототип сложен в техническом исполнении, многоэтапен и включает: сорбирование антигена ВИЧ, неоднократные промывки полистиролового носителя специальными буферными растворами, сушку полистиролового носителя, приготовление реактивов, соответствующую подготовку исследуемой сыворотки, использование в реакции канцерогенных индикаторов (ортофенилендиамин) и пр., после чего становится возможным постановка и учет реакции. Требует также использования сложных и дорогостоящих биотехнологий, промывающего устройства и регистрирующей аппаратуры вертикального фотометра. Кроме того, способ-прототип имеет следующие недостатки: - он не является достаточно специфичным, что не исключает ложноположительные результаты, которые могут составлять от 10 до 25%; - для уточнения специфичности ИФА требуется обязательное дополнительное верифицирующее (подтверждающее) исследование в иммуноблотинге; - невозможно судить об анергии, т.е. о снижении реактивности иммунной системы. В основу изобретения поставлена задача усовершенствования способа диагностики СПИД, в котором после соединения образцов исследуемой сыворотки крови с соответствующими моноспецифическими сыворотками против иммуноглобулинов M, G, A, определяют содержание свободных небелковых SH-групп, за счет чего обеспечивается повышение специфичности, чувствительности и достоверности способа диагностики СПИД и упрощается его проведение. Поставленная задача решается тем, что в предлагаемом способе диагностики СПИД, путем исследования сыворотки крови, согласно изобретению, соединяют три образца исследуемой сыворотки крови соответственно с моноспецифическими сыворотками против иммуноглобулинов M, G, A в соотношении 10 : 1, после чего в полученных трех биологических смесях определяют содержание свободных небелковых SH-групп, отсутствие которых указывает на наличие диагноза СПИД. Анализ заявляемого технического решения позволил выявить следующие отличия: - соединение трех исследуемых образцов сыворотки крови с соответствующими моноспецифическими сыворотками против иммуноглобулинов M, G и A в соотношении 10 : 1; - определение в полученных биологических смесях свободных небелковых SH-групп, отсутствие которых указывает на наличие диагноза СПИД. Заявленная совокупность признаков позволит повысить чувствительности и специфичность способа диагностики СПИД за счет соединения трех образцов исследуемой сыворотки крови соответственно с моноспецифическими сыворотками против иммуноглобулинов M, G, A в соотношении 10 : 1 и определения в полученных трех биологических смесях свободных небелковых SH-групп, отсутствие которых указывает на наличие диагноза СПИД. Известно определение свободных небелковых SH-групп в эритроцитах, лейкоцитах, сыворотке крови, например, для диагностики заболеваний крови, инфарктов внутренних органов и пр. Неизвестно определение свободных небелковых SH-групп в трех образцах биологической смеси - сыворотки крови, соединенной с соответствующими моноспецифическими сыворотками против иммуноглобулинов M, G и A для диагностики СПИД. Известен способ диагностики СПИД путем определения анергии по реакции гиперчувствительности замедленного типа на антигены, но неизвестен способ диагностики СПИД по отсутствию свободных небелковых SHгрупп в образцах биологической смеси сыворотки крови, соединенной с соответствующими моноспецифическими сыворотками против иммуноглобулинов M, G и A. Сущность способа заключается в том, что осуществляют соединение трех исследуемых образцов сыворотки крови обследуемого соответственно с моноспецифическими сыворотками против иммуноглобулинов M, G, A в соотношении 10 : 1. Три образца сыворотки крови нами взяты для уточнения реакции между иммуноглобулинами класса M, G и A, находящимися в исследуемой сыворотке крови с соответствующими моноспецифическими сыворотка против этих иммуноглобулинов. Причем, для создания оптимального стеохимического соотношения между реагирующими центрами иммуноглобулинов M, G и A с соответствующими моноспецифическими сыворотками против иммуноглобулинов M, G и A нами опытным путем выбрано указанное соотношение исследуемой сыворотки и моноспецифической сыворотки, которое составило 10 : 1. Мы установили у больных СПИДом феномен отсутствия свободных небелковых SH-групп при взаимодействии их сыворотки крови с моноспецифическими сыворотками против иммуноглобулинов M, G, A, что указывает на анергию иммунной системы, которая свидетельствует о заболевании СПИД. Вместе с тем, у здоровых лиц и у больных инфекционными и неинфекционными заболеваниями, которые не были обусловлены заболеванием СПИД (острые и хронические заболевания сердца, легких, печени, почек, поджелудочной железы, патология нервной системы и пр.), при взаимодействии их сыворотки крови с моноспецифическими сыворотками против иммуноглобулинов M, G, A, в отличие от больных СПИД, у всех без исключения обнаруживается появление свободных небелковых SH-групп в таких биологических смесях, что указывает на отсутствие заболевания СПИД. При разработке предлагаемого способа мы исходили из полученных нами данных, согласно которых появление свободных небелковых SHгрупп в сыворотке крови возможно в условиях денатурации белковых молекул (Костюшов В.В. // В сб. Актуальные проблемы патологии (Новое в диагностике и лечении). - Т.2. - Одесса: Маяк, 1997. - С.83 - 89). Денатурация же белковых молекул указывает на специфичность их повреждения в процессе биологической реакции антиген-антитело, например, иммуноглобулинов M, G и A сыворотки крови с соответствующими моноспецифическими сыворотками против иммуноглобулинов M, G и A (Костюшова Л.А. и соавт. // В сб. Актуальные проблемы патологии (Новое в диагностике и лечении). - Т.2. - Одесса: Маяк, 1997. - С.89 - 94). В этом плане есть все основания считать, что при денатурации белков сыворотки крови местом их "полома" могут быть дисульфидные мостики. При повреждении белковых молекул, в результате разрыва смешанных дисульфидных связей появляются свободные небелковые SH-группы (Костюшова Л.А. // В сб. Актуальные проблемы патологии (Новое в диагностике и лечении). - Т.2 - Одесса: Маяк, 1997. - С.94 - 98). Указанное выше и явилось предпосылкой для изучения молекулярных тиолопривных механизмов денатурации белков в процессе биологической реакции антиген-антитело иммуноглобулинов M, G и A сыворотки крови больных СПИД с моноспецифическими сыворотками против иммуноглобулинов M, G и А и разработки предлагаемого нами способа. Предлагаемый нами способ осуществляется следующим образом. У обследуемого, с соблюдением правил асептики, производят забор венозной крови в сухую Стерильную пробирку и доставляют в лабораторное отделение. Получают сыворотку крови общепринятым способом. В исследуемой сыворотке крови первоначально определяют спонтанное содержание свободных небелковых SH-групп методом амперометрического титрования (АМТ), на разработанном нами устройстве для АМТ (Заявка на изобретение №96124935, приоритет от 27.12.96). Затем в три новых образца этой же исследуемой сыворотки крови добавляют соответственно моноспецифические сыворотки против иммуноглобулинов M, G, A в соотношении 10 : 1 и производят термостатирование каждой биологической смеси при температуре 37°C, в течение 10 минут. В каждой исследуемой биологической смеси: сыворотка крови моноспецифическая сыворотка исследуют содержание свободных небелковых SH-групп методом АМТ. Отсутствие свободных небелковых SH-групп в исследуемых биологических смесях указывает на наличие у обследуемого диагноза СПИД. При определении СПИД по предлагаемому нами способу использовались моноспецифические сыворотки против иммуноглобулинов M, G, A (производство фирмы Sevac, Чехия), подготовка и разведение которых проводились согласно прилагаемой к набору инструкции. Для сравнения способов диагностики СПИД, исследования проводились предлагаемым способом и способом-прототипом. Анализ чувствительности, заявляемого нами способа показал, что диагноз СПИД у больных, установленный предлагаемым нами способом, всегда подтверждался наличием антител к ВИЧ, обнаруженных как способом-прототипом, так и при помощи верифицирующего (подтверждающего) исследования методом иммуноблотинга (проводимого на основании требований Закона Украины "Про запобігання захворюванню на СНІД та соціальний захист населення". - К.: Україна, 1993. - С.3). О более высокой специфичности и диагностической ценности, предлагаемого нами способа, по сравнению со способом-прототипом, свидетельствуют данные таблицы. Согласно требований руководящих документов Национальной программы профилактики СПИД (Постановление кабинета Совета Министров Украины от 14 марта 1995 №196) было обследовано по показаниям 11439 человек. Из них доноров (код - 108) - 4515 человек и по клиническим показаниям (код - 113) 6924 человек. Пример 1. У донора Ф-ва, с соблюдением правил асептики, производили забор венозной крови в сухую стерильную пробирку. Сыворотку крови получали общепринятым способом. В исследуемой сыворотке крови первоначально определяли спонтанное содержание свободных небелковых SH-групп, которое составило 0мкМ/л. Затем, отбирали три новых образца этой же сыворотки крови по 900мкЛ и к каждому из них добавляли соответственно по 100мкЛ моноспецифической сыворотки против иммуноглобулина M, G, A. Производили термостатирование таких биологических смесей при температуре 37°C, в течение 30 минут. После этого в каждой исследуемой биологической смеси определяли свободные небелковые SHгруппы, содержание которых соответственно составило 15мкМ/л, 31мкМ/л и 22мкМ/л, что указывает на отсутствие у донора диагноза СПИД. При определении способом-прототипом в сыворотке крови донора антитела к ВИЧ в ИФА не были обнаружены, что также указывает на отсутствие диагноза СПИД. Пример 2. У донора Б-ха, с соблюдением правил асептики, производили забор венозной крови в сухую стерильную пробирку. Сыворотку крови получали общепринятым способом. В исследуемой сыворотке крови первоначально определяли спонтанное содержание свободных небелковых SH-групп, которое составило 0мкМ/л. Затем, отбирали три новых образца этой же сыворотки крови по 900мкЛ и к каждому из них добавляли соответственно по 100мкЛ моноспецифической сыворотки против иммуноглобулина M, G, A. Производили термостатирование таких биологических смесей при температуре 37°C, в течение 30 минут. После этого в каждой исследуемой биологической смеси определяли свободные небелковые SHгруппы, содержание которых соответственно составило 0 мкМ/л, 0 мкМ/л и 0 мкМ/л, что указывает на наличие у донора диагноза СПИД. При определении способом-прототипом и методом иммуноблотинга в сыворотке крови донора были обнаружены антитела к ВИЧ, что также указывало на наличие диагноза СПИД. Пример 3. Больной 3-й, 28.12.95г. поступил в отделение торакальной хирургии 411 ОВГ с диагнозом: острая двусторонняя нижнедолевая некротическая пневмония. С соблюдением правил асептики 08.01.96г., производили забор венозной крови в сухую стерильную пробирку. Сыворотку крови получали общепринятым способом. В исследуемой сыворотке крови первоначально определяли спонтанное содержание свободных небелковых SH-групп, которое составило 0мкМ/л. Затем, отбирали три новых образца этой же сыворотки крови по 900мкЛ и к каждому из них добавляли соответственно по 100мкЛ моноспецифической сыворотки против иммуноглобулина M, G, A. Производили термостатирование таких биологических смесей при температуре 37°C в течение 30 минут. После этого в каждой исследуемой биологической смеси определяли свободные небелковые SH-группы, содержание которых соответственно составило 0мкМ/л, 0мкМ/л и 0мкМ/л, что указывает на наличие у больного диагноза СПИД. При определении способом-прототипом и методом иммуноблотинга в сыворотке крови больного 3-на были обнаружены антитела к ВИЧ, что указывает на наличие диагноза СПИД. Пример 4. У донора Г-ко, с соблюдением правил асептики, производили забор венозной крови в сухую стерильную пробирку. Сыворотку крови получали общепринятым способом. В исследуемой сыворотке крови первоначально определяли спонтанное содержание свободных небелковых SH-групп, которое составило 0мкМ/л. Затем, отбирали три новых образца этой же сыворотки крови по 900мкЛ и к каждому из них добавляли соответственно по 100мкЛ моноспецифической сыворотки против иммуноглобулина M, G, A. Производили термостатирование таких биологических смесей при температуре 37°C, в течение 30 минут. После этого в каждой исследуемой биологической смеси определяли свободные небелковые SH-группы, содержание которых соответственно составило 10мкМ/л, 35мкМ/л и 25мкМ/л, что указывает на отсутствие у донора диагноза СПИД. При определении способом-прототипом в сыворотке крови донора были обнаружены антитела к ВИЧ, однако при проведении верифицирующего исследования методом иммуноблотинга - антитела к ВИЧ у донора Г-ко не были выявлены, что указывает на отсутствие диагноза СПИД. Полученные данные свидетельствуют, что заявляемый нами способ является более чувствительным, информативным, имеет высокую диагностическую ценность, причем проводится без использования общепринятых наборов- для скрининга антител к ВИЧ-1 и ВИЧ-2 в ИФА и не требует дорогостоящего специального оборудования, доступен к широкому применению в различных медицинских учреждениях. Кроме того, он не требует верифицирующего (подтверждающего) исследования в иммуноблотинге, так как позволяет судить об анергии (ареактивности) иммунной системы больных СПИД по феномену отсутствия свободных небелковых SH-групп при взаимодействии их сыворотки крови с моноспецифическими сыворотками против иммуноглобулинов M, G, A, который как нами установлено характерен только для больных СПИД.