Спосіб діагностики сніду

Изобретение относится к медицине, а именно к клинической иммунологии, и может быть использовано для повышения специфичности способа диагностики синдрома приобретенного иммунодефицита (СПИД) при определении антител к вирусу иммунодефицита человека (ВИЧ) методом иммуноферментного анализа (ИФА) на этапе скринингового обследования. Известен способ диагностики СПИД методом иммуноблотинга [СПИД. Эпидемиология, клиника, уход за больными, пути передачи, профилактика и программы борьбы// ВОЗ серия СПИД № 1, 2, 3 - Женева. - С.3]. Недостатком способа является его дороговизна, невозможность использования при скрининговых исследованиях и длительность обследования, крайне ограниченное снабжение тест-системами для иммуноблотинга. Известен способ определения антител к ВИЧ путем проведения ИФА, выбранный нами за прототип [Закон Украины "Про запобігання захворюванню на СНІД та соціальний захист населення", - Київ, "Україна", 1993, с, 3]. Этот способ осуществляется следующим образом: проводится ИФА сыворотки крови по стандартной методике, которая прилагается к каждой тест-системе в виде инструкции. В случае положительного или сомнительного результата исследования, для исключения ложноположительного результата, осуществляют повторный забор крови для уточнення достоверности реакции. Согласно Закона Украины "Про запобігання захворюванню на СНІД та соціальний захист населення" "Серопозитивными в ИФА" считаются те обследуемые, у которых из двух - оба или из трех - два анализа виявили наличие антител, при этом дальнейшее исследование такой сыворотки методом ИФА прекращается. Недостатком прототипа является относительно высокий процент ложноположительных реакций в ИФА при определении антител к ВИЧ до 20-30% [Новохатский А.С., Дрынов И.Д., Сергиев В.П. Синдром приобретенного иммунодефицита (СПИД). - М.: ВИНИТИ, 1987, с. 179], в результате чего обследуемых ставят на учет, как "Серопозитивных в ИФА" сроком до 6 и более месяцев и проводят экспертную оценку полученного в ИФА результата, при этом применяют метод иммуноблотинга. В основу изобретения поставлена задача усовершенствования способа диагностики СПИД, в котором за счет использования неоднократной процедуры замораживания/размораживания серопозитивной в ИФА сыворотки обеспечивается исключение ложноположительных реакций в ИФА при определении антител к ВИЧ, в результате чего повышается специфичность и точность способа, снижаются материальные затраты на дальнейшее проведение исследований, в том числе и иммуноблотинга. Поставленная задача решается тем, что в способе диагностики СПИД путем проведения ИФА сыворотки крови и регистрации экстинции (оптической плотности) в анализируемой пробе, согласно изобретения, серопозитивную в ИФА сыворотку подвергают трем-шести последовательным замораживаниям при температуре -20°С и размораживаниям при комнатной температуре в течение 45 минут и после каждой процедуры замораживания/размораживания повторяют ИФА этой сыворотки. Отсутствие после этой процедуры снижения оптической плотности в исследуемой пробе на 25% и более указывает на наличие антител к ВИЧ. Анализ заявляемого технического решения позволил выявить следующие отличия: - проведение ряда последовательных замораживаний, "Серопозитивной в ИФА" сыворотки; - проведение ряда последовательных размораживаний "Серопозитивной в ИФА" сыворотки. Таким образом, заявляемое техническое решение соответствуе т критерию "новизна". Известен прием замораживания (с целью хранения) с последующим размораживанием сыворотки крови при проведении некоторых исследований, например, при определении поверхностного маркера вирусного гепатита В методом ИФА. Однако по всех случаях допускается применение однократного замораживания/размораживания исследуемых проб с целью хранения. Применение последовательных (3-6 раз) замораживаний/размораживаний с целью диагностики неизвестно. Оценка динамики изменения оптической плотности проводится, например, в способе-прототипе. Однако авторами найдено количественное выражение степени изменения динамики последней, которое представляет собой необходимое и достаточное условие исключения ложноположительных реакций в ИФА при определении антител к ВИЧ. Таким образом, совокупность отличительных признаков, предложенных в заявленном способе, обеспечивает достижение положительного эффекта, а именно - повышение специфичности ИФА, что находит выражение: 1) в идентификации ложно- и истинно положительных результатов анализа; 2) в повышении специфичности иммуноферментного анализа при определении антител к ВИЧ. кроме того, анализ чувстви тельности иммуноферментного метода определения антител κ ВИЧ при проведении исследований по заявляемому способу и способу прототипу в соответствующем биологическом материале "ВИЧ-инфицированных" показал, что антитела к ВИЧ обнаружены во всех образцах и результаты соответствовали данным иммуноблотинга. Это свидетельствует, что определение антител к ВИЧ предлагаемым способом не приводит к изменению чувствительности метода ИФА. Проведенными исследованиями установлено, что формирование таких ложноположительных реакций в ИФА связано с неспецифическими молекулярными тиолопривными механизмами нарушения структурнофункционального состояния белков сыворотки крови. Это подтверждается полученными нами данными, согласно которых у лиц с ложноположительными реакциями в ИФА обнаружены нарушения показателей белкового тиолдисульфидного состояния сыворотки крови, а процедура замораживания/размораживания этой сыворотки модифицировала показатели тиол-дисульфидного состояния, которые после этой процедуры приближались к таковым показателям контрольной группы. Сущность предлагаемого способа поясняется рисунками 1 и 2. На рис.1 представлены графики изменения экстинции (оптической плотности) исследуемых образцов сыворотки по предлагаемому нами способу, согласно которого, исследуемая сыворотка подвергалась трем-шести последовательным замораживаниям при температуре -20°С и размораживаниям при комнатной температуре в течение 45 минут и после каждой процедуры замораживания/размораживания проводился ИФА. На рис.2 представлены графики изменения экстинции исследуемых образцов сыворотки по способу-прототипу, согласно которого, исследуемая сыворотка не подвергалась процедуре замораживания/размораживания, а хранилась при температуре 4°С и использовалась для проведения ИФА. На рис.1 и рис.2 по оси ординат откладывались величины экстинции в единицах оптической плотности, а на оси абсцисс обозначены порядковые номера (№) исследований сывороток крови предлагаемым способом (рис.1) и способом-прототипом (рис.2). Предлагаемый способ осуществляется следующим образом. У обследуемого натощак, с соблюдением правил асептики, из кубитальной вены одноразовым шприцем производился забор крови в количестве 3-5 мл в сухую стерильную пробирку. Кровь обводилась сухой стерильной стеклянной палочкой, ставилась в штатив в наклонное положение. В течение 2-3 часов от забора кровь доставлялась в лабораторию в изотермическом контейнере. При поступлении в лабораторию кровь регистрировалась в "Журнале учета поступления биоматериала для исследования в ИФА на наличие антител к ВИЧ". В последующем кровь центрифугировалась (3000 об/мин 15-20 минут при 20°С). Сыворотка в количестве 200 мкл отбиралась в лунку стерильного планшета для иммунологических реакций, а также в количестве 1000 мкл в стерильный эппендорф для хранения с целью повторной диагностики в случае необходимости. Определение антител к ВИЧ осуществлялось при помощи тест-систем "Genetavla Mixt HIV 1+2" (производство Sanofi Diagnostics Pasteur, Франция) различных серий. Для определения антител к ВИЧ из лунки планшета отбиралось 20 мкл исследуемой сыворотки, которая разводилась (1:5) разводящим раствором, находящимся в комплекте поставки каждой тест-системы. Определение наличия антител к ВИЧ проводилось в соответствии с инструкцией, прилагаемой к каждой тестсистеме. Оценка результатов регистрировалась спектрофотометрически на вертикальном фотометре LP 400 (производство Sanofi Diagnostics Pasteur, Франция) и расчет критической экстинции выполнялся согласно прилагаемых к тест-системе инструкций. При получении отрицательного результата в ИФА выдавался ответ о том, что антитела к ВИЧ не выявлены. Такая сыворотка помещалась в "банк", условно обозначенный нами как группа "Отрицательные в ИФА" с целью изучения динамики изменения и характера реакций предлагаемым нами способом, согласно которого, сыворотка группы лиц "Отрицательные в ИФА" подвергалась трем-шести последовательным замораживаниям при температуре -20°С и размораживаниям при комнатной температуре в течение 45 мин и после каждой процедуры замораживания/размораживания повторялся ИФА этой сыворотки. При получении положительного результата в ИФА проводилась идентификация пациента - по координатам лунки. Сыворотка такого больного, заранее отобранная на случай повторного исследования, в объеме 1000 мкл помещалась в "банк", условно обозначенный нами как группы "Первичноположительные в ИФА" и созданный с целью повторного уточнения достоверности полученного положительного результата, а также для изучения динамики его изменения предлагаемым нами способом. Повторное исследование этой же сыворотки проводилось вновь, но в двух параллельных пробах и тест-системой другой серии. Только при получении в указанных двух параллельных пробах отрицательных результатов, первичное исследование расценивалось как ложноположительное, и пациенту выдавался ответ "антитела к ВИЧ в сыворотке крови не обнаружены". Указанная сыворотка оставалась в "банке", в гр уппе "Первичноположительные в ИФА" для дальнейшего исследования предлагаемым нами способом, согласно которого, сыворотка группы лиц "Первичноположительные в ИФА" подвергалась трем-шести последовательным замораживаниям при температуре -20°С и разморажи-ваниям при комнатной температуре в течение 45 минут и после каждой процедуры замораживания/размораживания повторялся ИФА этой сыворотки. В случае, если в указанных двух параллельных пробах при повторном исследовании один или оба результата были положительными, учитывался также положительный результат первого обследования и вступало в силу условие: лицам, в сыворотке которых из двух оба или из трех - два анализа отчетливо выявили наличие антител к ВИЧ в ИФА, выносилось заключение "Серопозитивные в ИФА". Такая сыворотка изымалась из "банка" "Первичноположительные в ИФА" и из нее формировался "банк", условно обозначенный нами как группа "Серопозитивные в ИФА", созданный с целью проведения экспертной оценки в реакции иммуноблотинга, а также для параллельного изучения динамики изменения и характера реакций, предлагаемым нами способом, согласно которого, сыворотка группы лиц "Серопозитивные в ИФА" подвергалась трем-шести последовательным замораживаниям при температуре -20°С и размораживаниям при комнатной температуре в течение 45 минут и после каждой процедуры замораживания/размораживания повторялся ИФА этой сыворотки. В случае, если в указанной пробе методом иммуноблотинга обнаружены антитела к отдельным белкам ВИЧ (др160, др120, др41, р24 и др.), такая сыворотка, находящаяся в "банке", в группе "Серопозитивные в ИФА", изымалась и из нее формировался "банк", обозначенный нами как группа "ВИЧ-инфицированные" для параллельного изучения динамики изменения и характера реакции предлагаемым нами способом, согласно которого, сыворотка группы лиц "ВИЧ-инфицированные" подвергалась трем-шести последовательным замораживаниям при температуре -20°С и размораживаниям при комнатной температуре в течение 45 минут и после каждой процедуры замораживания/размораживания повторялся ИФА этой сыворотки. В случае, если в указанной пробе методом иммуноблотинга не обнаружены антитела к отдельным белкам ВИЧ (gp16O, gp120, др41, р24 и др.), т.е, результат был отрицательный, она оставалась в "банке", в группе "Серопозитивные в ИФА". После того, как при помощи метода-прототипа из сывороток крови были сформированы соответствующие "банки": "Отрицательные в ИФА", "Лервичноположительные в ИФА", "Серопозитивные в ИФА", "ВИЧинфицированные", результаты исследований которых были подтверждены при экспертной оценке существующим методом иммуноблотинга, все образцы крови, с целью определения возможности идентификации при проведении скрининговых исследований в ИФА, подвергались обследованию предлагаемым нами способом, согласно которого, зги сыворотки подвергались трем-шести последовательным замораживаниям при температуре -20°С и размораживаниям при комнатной температуре в течение 45 минут и после каждой процедуры замораживания/размораживания повторялся ИФА этих сывороток. Для определения специфичности предлагаемого нами способа проводилось параллельное исследование в ИФА сывороток, как после воздействия на них указанных вы ше низкотемпературных факторов, так и не подвергшихся такому воздействию, а содержащихся при температуре 4°С. Получены следующие результаты: В группе "Серопозитивные в ИФА" (в сыворотке которых методом-прототипом из двух оба или из трех два исследования отчетливо выявили наличие антител к ВИЧ, но при эспертной оценке - результат иммуноблотинга был отрицательный) в последующи х, дополнительных исследованиях предлагаемым нами способом, установлено, что эта сыворотка крови после процедуры трех-шести последовательных замораживаний при температуре -20°С и затем размораживаний при комнатной температуре в течение 45 минут, уже начиная со 2-3 размораживания, в динамике наблюдалось четкое снижение на 25-50% выраженности положительных реакций (экстинций), по сравнению с исходными и положительными контролями (входящими в тест-системы). В дальнейшем во всех исследуемых образцах этой гр уппы при каждом определении отмечалось снижение выраженности положительных реакций (экстинций), которые становились отрицательными, т.е. фактически соответствовали результату иммуноблотинга. При параллельном исследовании этой же сыворотки, но не подвергшейся замораживанию, а содержащейся при температуре 4°С, результат оставался положительным. В группе "ВИЧ-инфицированные" (в Сыворотке которых методом-прототипом из двух оба или из трех два исследования отчетливо выявляли наличие антител к ВИЧ и при экспертной оценке - результат иммуноблотинга был положительный) в последующи х дополнительных исследованиях предлагаемым нами способом, независимо от процедуры трех-шести последовательных замораживаний при температуре -20°С и затем размораживаний при комнатной температуре в течение 45 минут, наблюдалось сохранение выраженной положительной реакции в ИФА. Это свидетельствует, что процедура трех-шести последовательных замораживаний при температуре -20°С и размораживаний при комнатной температуре в течение 45 минут не оказывает существенного влияния на динамику истинно-положительных результатов этой реакции в ИФА у ВИЧ-инфицированных лиц. При параллельном исследовании этой же сыворотки, но не подвергшейся замораживанию, а содержащейся при температуре 4°С, результат оставался также положительным. В группах "Первичноположительные в ИФА" и "Отрицательные в ИФА" при последующи х дополнительных исследованиях предлагаемым нами способом, независимо от процедуры трех-шести последовательных замораживаний при температуре -20°С и затем размораживаний при комнатной температуре в течение 45 минут, реакция оставалась отрицательная. Это свидетельствует, что процедура трех-шести последовательных замораживаний при температуре -20°С и размораживаний при комнатной температуре в течение 45 минут не оказывает существенного влияния на динамику реакций в ИФА у лиц не инфицированных ВИЧ. При параллельном исследовании этой же сыворотки, но не подвергшейся замораживанию, а содержащейся при температуре 4°С, результат оставался также отрицательным. Следует отметить, что все результаты исследований при определении антител к ВИЧ методом ИФА с целью экспертной оценки их достоверности, нами параллельно сопоставлялись и контролировались методом иммуноблотинга. Таким образом, предлагаемый нами способ диагностики СПИД позволил повысить специфичность метода при скрининговых исследованиях, результаты которого были сопоставимы с результатами иммуноблотинга. Определение специфичности анализа при его проведении по предлагаемому способу и способупрототипу осуществлялось путем изучения 1521 обследованного (доноры, по клиническим показаниям, группа риска и т.д.). Результаты сравнительного анализа представлены в таблице. Из данных таблицы следует, что использование заявляемого способа позволяет исключить ложноположительные реакции в ИФА при определении антител к ВИЧ, и его результаты совпадают с данными иммуноблотинга. Далее приводим примеры конкретного выполнения способа. Пример 1. У больного С, направленного на обследование для определения антител к ВИЧ по клиническим показаниям (код 113) с диагнозом: туберкулезный плеврит, производили забор из вены 3,0 мл крови и подготовили ее для исследования в соответствии с описанной выше схемой. При спектрофотометрической оценке результата ИФА величина экстинции опыта составила 1,158, экстинция положительного контроля 1,517, экстинция отрицательного контроля 0,122. экстинция критическая 0,312. Это свидетельствует о вероятности наличия у обследованного больного С. антител к ВИЧ. При контрольном двукратном исследовании этой сыворотки, содержащейся при температуре 4°С величины экстинции соответственно составили 1,145 и 1,139, экстинция положительного контроля 1,328, экстинция отрицательного контроля 0,056, экстинция критическая 0,268. Такие данные позволили на основании вышеуказанного Закона Украины "Про запобігання захворюванню на СНИД та соціальний захист насе-лення" отнести больного к группе "Серопозитивные в ИФА" на период проведения экспертной оценки. Для уточнения диагноза и с целью экспертной оценки эта же сыворотка больного С. была направлена на иммуноблотинг и одновременно продолжено проведение ИФА по предлагаемому нами способу. Для этого сыворотка крови подвергалась шестикратному замораживанию при температуре -20°С и размораживанию при комнатной температуре в течение 45 минут. После каждого размораживания проводилось исследование методом ИФА. Получены результаты: После первого размораживания экстинция опыта составила 0,848 (экстинция положительного контроля 1,251, экстинция отрицательного контроля - 0,11, экстинция критическая - 0,298); после второго размораживания экстинция опыта составила -0,572, (экстинция положительного контроля - 1,11, экстинция отрицательного контроля - 0,056, экстинция критическая - 0,278); после третьего размораживания экстинция опыта составила -0,122, (экстинция положительного конроля - 1,345, экстинция отрицательного контроля 0,078, экстинция критическая - 0,304); после четвертого размораживания экстинция опыта составила -0,132, (экстинция положительного контроля - 1,809, экстинция отрицательного контроля - 0,067, экстинция критическая - 0,406, после пятого размораживания экстинция опыта составила - 0,115, (экстинция положительного контроля - 1,112, экстинция отрицательного контроля - 0,039, экстинция критическая - 0,261); после шестого размораживания экстинция опыта составила 0,097, (экстинция положительного контроля 1,025, экстинция отрицательного контроля - 0,079, экстинция критическая -0,248). При параллельном исследовании этой же сыворотки, но содержащейся при температуре 4°С динамика величин экстинции опыта была соответственно 1,275, 1,399, 1,103,1,528,1,354,1,405 (экстинции положительного контроля соответственно 1,251, 1,11, 1,345, 1,089, 1,112, 1,025 экстинция отрицательного контроля соответственно 0.11, 0,056,0,078,0.067,0,039,0,079, экстинция критическая соответственно 0,298, 0,27В, 0.304, 0,406, 0,261. 0,284). Полученные данные иммуноблотинга при экспертной оценке этой сыворотки не выявили антител к отдельным белкам ВИЧ, т.е. реакция была отрицательная. Такие данные подтвердили, что результаты предлагаемого нами способа диагностики СПИД в отличии от способа-прототипа сопоставимы, т.е. совпадают с результатами иммуноблотинга. Пример 2. Гражданин Эфиопии А. в плановом порядке (код 207), по прибытию в Украину был обследован на наличие антител к ВИЧ. Для этого производили забор из вены 3,0 мл крови и подготовили ее к исследованию по описанной выше схеме. При спектрофотометрической оценке результата ИФА величина экстинции опыта составила -1,328, экстинция положительного контроля - 1,517, экстинция отрицательного контроля -0,122, экстинция критическая -0,312). Это также свидетельствует о вероятности наличия у обследованного больного А. анти тел к ВИЧ. При контрольном двукратном исследовании этой сыворотки, содержащейся при температуре 4°С величины экстинции соответственно составили 1,315 и 1,325, экстинция положительного контроля - 1,328, экстинция отрицательного контроля - 0,056, экстинция критическая - 0,268. Такие данные также позволили на основании вышеуказанного "Закона Украины "Про запобігання захворюванню на СНІД та соціальний захист населення" отнести больного А. к группе "Серопозитивные в ИФА" на период проведения экспертной оценки. Для уточнения достоверности ИФА и с целью экспертной оценки эта же сыворотка крови была направлена на иммуноблотинг и одновременно продолжено проведение ИФА по предлагаемому нами способу. Для этого сыворотка крови подвергалась шестикратному замораживанию при температуре -20°С и размораживанию при комнатной температуре в течение 45 минут. После каждого размораживания проводилось исследование методом ИФА. Получены результаты: После первого размораживания экстинция опыта составила -1,317, (экстинция положительного контроля 1,251, экстинция отрицательного контроля - 0,11, экстинция критическая - 0,298); после второго размораживания экстинция опыта составила -1,335, (экстинция положительного контроля - 1,11, экстинция отрицательного контроля - 0,056, экстинция критическая - 0,278); после третьего размораживания экстинция опыта составила -1,299, (экстинция положительного контроля - 1,345, экстинция отрицательного контроля 0,078, экстинция критическая - 0,304); после четвертого размораживания экстинция опыта составила -1,315, (экстинция положительного контроля - 1,809, экстинция отрицательного контроля - 0,067, экстинция критическая - 0,406); после пятого размораживания экстинция опыта составила 1,291, (экстинция положительного контроля - 1,112, экстинция отрицательного контроля - 0,039, экстинция критическая - 0,261); после шестого размораживания экстинция опыта составила - 1,299, (экстинция положительного контроля 1,425, экстинция отрицательного контроля - 0,079, экстинция критическая 0,0248). При параллельном исследовании этой же сыворотки, но содержащейся при температуре 4°С динамика величин экстинции опыта была соответственно:1,179; 1,256; 1,140; 1,249,1,236,1,138 (экстинции положительного контроля соответственно 1,251, 1,11, 1,345, 1,089, 1,112, 1,025, Экстинция отрицательного контроля соответственно 0,11,0,056, 0,078,0,067,0,039,0,079, экстинции критические соответственно 0,298, 0,278, 0,304, 0,406, 0,261, 0,284). Полученные данные иммуноблотинга при экспертной оценке этой сыворотки выявили антитела к отдельным белкам ВИЧ (р17, р24, др41, р51. рбб, др120/160), т.е. реакция была положительная, а гражданин А. - "ВИЧ-инфицированный". Такие исследования подтвердили, что предлагаемый нами сгшсоб диагностики СПИД не дает ложноотрицательных реакций у "ВИЧ-инфицированных" и сопоставим с результатами иммуноблотинга. Пример 3. У донора И. (код 108), направленного на обследование для определения антител к ВИЧ, производили забор из вены 3,0 мл крови и подготовили к исследованию в соответствии с вышеописан ной схемой. При спектрофотометрической оценке результата ИФА величина экстинции опыта составила 0,956, экстинция положительного контроля -1,517, экстинция отрицательного контроля -0,122, экстинция критическая - 0,312). Это свидетельствует о возможности наличия у обследованного донора И. антител к ВИЧ. При контрольном двукратном исследовании этой сыворотки, содержащейся при температуре 4°С величины экстинций соответственно составили 0,068 и 0,059, экстин-ция положительного контроля 1,328, экстинция отрицательного контроля 0,056, экстинция критическая 0,268. Такие данные позволили на основании вышеуказанного Закона Украины "Про запобігання захворюванню на СНІД та соціальний захист населення" донора И. отнести к группе "Отрицательные в ИФА". С целью контроля качества проведенных исследований сыворотка крови донора И. была направлена на ИФА и инмуноблотинг и одновременно продолжено проведение ИФА по предлагаемому нами способу. Для этого сыворотка крови подвергалась 4-х кратному замораживанию при температуре -20°С и размораживанию при комнатной температуре в течение 45 минут. После каждого размораживания проводилось исследование методом ИФА. Получены результаты: После первого размораживания экстинция опыта составила 0,07, (экстинция положительного контроля 1,251, экстинция отрицательного контроля - 0,11, экстинция критическая - 0,298); после второго размораживания экстинция опыта составила -0,042, (экстинция положительного контроля - 1,11, экстинция отрицательного контроля 0,056, экстинция критическая - 0,278); после третьего размораживания экстинция опыта составила - 0,058, (экстинция положительного контроля - 1,345, экстинция отрицательного контроля 0,078, экстинция критическая - 0,304); после четвертого размораживания экстинция опыта составила -0,01, (экстинция положительного контроля - 1,809, экстинция отрицательного контроля -0,067. экстинция критическая - 0,406). При параллельном исследовании этой же сыворотки, но содержащейся при температуре 4°С динамика величин экстинций опыта была соответственно - 0,073, 0,038, 0,054, 0,089, (экстинций положительного контроля соответственно 1,251, 1,11, 1,345, 1,089, экстинция отрицательного контроля соответственно 0,11,0,056,0,078,0,067, экстинций критические соответственно 0,298, 0,278, 0,304, 0,406). Полученные данные проведенного ИФА и иммуноблотинга также не выявили антител к ВИЧ. Такие результаты подтвердили, что предлагаемый нами способ, в отличие от способа-прототипа, не дает ложноположи-тельных результатов. Пример 4. У донора М. (код 108), направленного на обследование для определения антител к ВИЧ производили забор из вены 3,0 мл крови и подготовили в соответствии с вышеописанной схемой. При спектрофотометрической оценке результата ИФА величина экстинций опыта составила 0,093, экстинция положительного контроля 1,517, экстинция отрицательного контроля 0,122, экстинция критическая 0,312). Это свидетельствует об о тсутствии у донора М. антител к ВИЧ. При контрольном двукратном исследовании этой сыворотки, содержащейся при температуре 4°С величины экстинций соответственно составили 0,035 и 0,03, экстинция положительного контроля 1,328, экстинция отрицательного контроля 0,056, экстинция критическая - 0,268. Такие данные позволили на основании вышеуказанного Закона Украины "Про запобігання захворюванню на СНІД та соціальний захист населення" донора Μ. о тнести к группе "Отрицательные в ИФА". С целью контроля качества проведения исследований эта же сыворотка крови донора М. была направлена на ИФА и на иммуноблотинг и одновременно продолжено проведение ИФА по предлагаемому нами способу, описанному выше. Для этого сыворотка крови подвергалась 3-х кратному замораживанию при температуре 20°С и размораживанию при комнатной температуре в течение 45 минут. После каждого размораживания проводилось исследование методом ИФА. Получены результаты: После первого размораживания экстинция опыта составила - 0,1, (экстинция положительного контроля 1,251, экстинция отрицательного контроля - 0,11, экстинция критическая - 0,298); после второго размораживания экстинция опыта составила 0,09, (экстинция положительного контроля - 1,11, экстинция отрицательного контроля 0,056, экстинция критическая 0,278); после третьего размораживания экстинция опыта составила 0,09, (экстинция положительного контроля - 1,345, экстинция отрицательного контроля 0,078, экстинция критическая 0,304). При параллельном исследовании этой же сыворотки, но содержащейся при температуре 4°С динамика величин экстинций опыта была соответственно 0,12, 0,1 и 0,14, (экстинций положительного контроля соответственно 1,251, 1,11 и 1,345, экстинция отрицательного контроля соответственно 0,11, 0,056 и 0,078, экстинций критические соответственно 0.298, 0,278 и 0,304). Проведенные исследования способом-прототипом и методом иммуноблотинга также не выявили антитела к ВИЧ. Такие данные свидетельствуют, что процедура трех-шести последовательных замораживаний при температуре -20°С и размораживаний при комнатной температуре в течение 45 минут не влияют на исход отрицательных в ИФА реакций и в этом случае они совпадают с результатами способапрототипа и иммуноблотинга.