Метод ранньої діагностики апоптотичних процесів в культурах клітин

Метод ранньої діагностики апоптотичних процесів в культурах клітин, що включає використання 3 25410 больных: Метод, рекомендации МЗ РФ. М.; 1990], різних форм бешихи [Еровченко А.А., Козинец Г.И., Попова О.В. Магнитная резонансная релаксометрия сыворотки крови у больных с различными формами рожи в динамике болезни //Терапевтический архив. -2003. -№11. -С.39-41]. Об'єктом досліду була також плазма крові хворих з опіками для вивчення порушення гомеостазу та оцінки якості лікування [Козинец Г.И., Попова О.В., Игнатов С.В. Ядерная магнитная резонансная релаксация плазмы крови больных с ожогами //Лабораторное дело. -1991. -№3. -С.13-16]. Досить досконало вирішується проблема вивчення водного балансу в тканинах нирки [Комаревцева И.А. Способ определения водного баланса организма in vitro на примере почечной ткани путем регистрации Т1 i T2 - показателей времен релаксации протонов тканевой воды методом ЯМР - релаксометрии. -№1682927 от 04.05.89. -07.10.91. бюл. №37]. Цей спосіб обраний нами як прототип. Перевага вивчення часу релаксації в різних тканинах полягає в тому, що дає можливість оцінити водний баланс тканин, виявити порушення гомеостазу та оцінити якість деяких лікувальних засобів, а також доступність плазми та сироватки як об'єкта дослідження. Але вивчення часу релаксації в тканинах можливо лише в експерименті на тваринах, або в біопсічному матеріалі людей, що приводить до значного зменшення об'єктив дослідження, оскільки біопсію взяти можливо тільки з деяких органів і тканин. А також, кількість тканини отриманої при біопсії часто замало для проведення дослідження. Крім того, метод ЯМР - релаксометрії не використовувався для дослідження процесів апоптозу, зокрема, в культурах клітин. Метою корисної моделі було використання метода Н1 – ЯМР - релаксометрії для ранній діагностики апоптотичних процесів в культурах клітин. Поставлене завдання вирішується тим, що значення спино-решітчастого та спино-спинового часу релаксації вимірюють в культурах клітин різного терміну культивування для констатації змін об'єму клітин як одного з маркерів апоптозу, при цьому значення показників Т1 з 3660 до 3760м.сек і Т2 з 1079 до 1279м.сек вказують про перші ознаки гідратації клітин, а їх значення з 3547 до 3647м.сек і з 1045 до 1165м.сек відповідно - про початок незворотної фази апоптозу. Запропонований метод дозволяє досить рано визначати стадію апоптозу в клітині, дослідження їде просто і не займає значного часу, а мононуклеарні клітини крові можна отримати в достатньої кількості не зашкоджуючи організму. Дослідження проводиться з використанням мононуклеарних клітин здорових донорів (МНК). 4 Клітини культивують у середовищі Ігла MEM при 37°С. Концентрацію клітин визначають у камері Горяєва та доводять до 2´106 клітин на 1мл. Життєздатність виділених клітин оцінюють за даними тесту з трипановим синім. Клітини культивують 24 і 48 годин. Апоптоз стимулюють внесенням в середовище дексаметазону в концентрації 10-3мг/мл. Детекцію апоптозу проводили по кількості фрагментованої ДНК за допомогою діфениламінового тесту [I.O. Комаревцева, О.М. Клімочкіна. Активація опіоїдних рецепторів та рівень індукованого апоптозу в культурі мононуклеарних клітин //Медична хімія. -2006. -Т.8, №2. -С.127–129]. Після культивування клітини центрифугують 5хв. при 1500об/хв. Зливають поживне середовище та двічі відмивають клітини у фізіологічному розчині. До кожної проби додають 1мл фізіологічного розчину. Дослідження зміни клітинного об'єму проводять методом ЯМР - релаксометрії на ядрах H+ in vitro за допомогою ЯМР - релаксометра «Minispec PC 100». Цей метод дозволяє виявити рухливість молекул води, швидкість їх переорієнтації в вільному та зв'язаному станах. В дослідженні спин - решітчастий час (Т1) визначають за методом «inversion recovery», використовуючи 18°-Т-90°-пульсову послідовність, а спин - спиновий час за методом CPMG. Час повтору імпульсу 3,0сек. Після визначення Т1 і Т2, показники розкладали на біекспоненти та розраховували Ра та Рв , які характеризують внутрішньо - та позаклітинний об'єм води відповідно. Результати обробляються автоматично на комп'ютері за допомогою програмних пакетів фірми «Druker»: «ДТ1, ДТ 2» і «Experiment Supervisor». За результатами проведених досліджень на 24 годину культивування показники часу релаксації як Т1 так і T2 в культурах з активованим апоптозом зменшувались порівняно з інтактними клітинами. Така динаміка показників характеризується швидким протонним обміном та зменшенням щільності гідрованого шару води, тобто, їде перерозподіл клітинної води у бік внутрішньоклітинної (гідратація клітин). При інкубації клітин 48 годин Т1 - релаксація мала знижені показники, а Т2 - релаксація навпаки збільшувалась порівняно з інтактними клітинами. Таке сполучення Т1 та Т2 характерно для накопичення у клітині ліпідної фракції, при цьому зменшувалась частина внутрішньоклітинної води (дегідратація). Таким чином, при подовжені терміну культивування спостерігається тенденція до дегідратації клітин, що характеризує термінальну стадію апоптозу. Отримані результати позитивно корелюють з показниками фрагментованої ДНК. 5 25410 6 Таблиця 1 Показники Т1(м.сек) Т2(м.сек) Ра(%) Рв(%) Культура клітин інтактна (п=30) 24 години культиву48 годин культивування вання 3926±100 4075±100 1226±60 1086±30 47,66±1,45 51,29±0,5 52,34±1,1 48,71±0,9 Культура клітин з дексаметазоном (п=30) 24 години культиву48 годин культивування вання 3710±50 3597±50 1179±100 1105±60 52,81±1,2 48,62±0,8 47,19±0,75 51,38±1,2 Таким чином, запропонований метод Н 1 - ЯМР - релаксометрії є придатним для визначення ранньої стадії апоптотичних процесів в культурах клітин. Комп’ютерна в ерстка C.Литв иненко Підписне Тираж 26 прим. Міністерство осв іт и і науки України Держав ний департамент інтелектуальної в ласності, вул. Урицького, 45, м. Київ , МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислов ої в ласності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601