Спосіб виділення хламідій в культурах клітин

Спосіб виділення хламідій у культур клітин, який включає використання стандартних матеріалів і метаболітів, який відрізняється тим, що в якості стандарту використовують середовище 199, а в якості метаболіта використовують L-цистеінгідрохлорид. (13) 38578 (11) UA тання стандартних матеріалів та метаболітів, згідно винаходу, в якості метаболіта використовують L-цистеін-гідрохлорид, в дозі 2,5-3,0 мкг/мл. Спосіб здійснюється таким чином: на 1-2 добовий моношар клітин вирощений на покривних скельцях, вноситься інфекційний матеріал, одержаний від хворих, по 0,2-0,3 мл в плоскодонні пробірки. Адсорбція хламідій на клітинний моношар здійснюється за допомогою центрифугування на горизонтальному роторі при 2400-3000 об/хв протягом 1 години при кімнатній температурі. Потім безпосередньо після центрифугування інфекційний матеріал видаляють і вносять у плоскодонні пробірки по 1 мл поживного середовища 199 з добавленням до нього L-цистеіну-гідрохлориду в дозі 2,5-3,0 мкг/мл, який готують ex tempore. Подальше культивування хламідій проводять у термостаті при +37 градусах за Цельсієм. Результати враховують через 36-48-72 години по наявності цитоплазматичних включень мікроорганізму у клітинах препаратів фарбованих за Май-Грюнвальду-Гімза або методом флюоресцируючих антитіл. Діагностичне дослідження інфекційного матеріалу від хворих на культурі клітин проводилось заявленим способом та способом прийнятим нами за прототип. Так, при обстеженні 23 пацієнтів із запальними хворобами сечостатевих органів у 15 (65,2%) хворих виділені хламідії заявленим способом, тоді як у паралельній пробі способом прототипом хламідії виділені у 5 (22,6%). Приклад: К.О.А., 21 рік N 52, заміжня, поступила в пологове відділення 11-ої лікарні. Пологи-1, вагітність 36 тижнів. Загроза дострокових пологів. Враховуючи перенесений запальний процес статевих органів до теперішньої вагітності, в строці 37 тижнів вагітності обстежена на хламідійну інфекцію з метою пояснення причин ускладнень даної вагітності. При вивченні зішкрябних препаратів (19) Винахід відноситься до медичної мікробіології і може бути використаний у лабораторній практиці для виділення хламідій. Відомі способи виділення хламідій у культурам клітин шляхом застосування різних прийомів: центрифугування, вплив на клітини метаболітів (циклогексимід, поліетиленгліколь), полікатіонів (ДЕАЕ-Д) та інш. (Шаткин А.А., Мавров И.И. Урогенитальные хламидиозы. – К: Здоров'я, 1983. - 200 с.; Ориэль Дж.Д., Риджуэй Дж. Л. Хламидиозы.: Пер. с англ. – М.: Медицина, 1982. - 192 с.: Ripa К.Т., Mardh P.A. Cultivation of C. trachomatis іn cycloheximide treated Mc Coy cells, Infect, and Immuhol.,1981.,v. 33, N 1., p. 309-311.; Harrison M.J. Enhancing effect of an ovine Chlamydis (Bendsonia) in cell culture. Aust. J. Exp. Blol. Med. Scl.,1970, v. 48, N 2, p. 207-213. Вищеперераховані способи мають різні точки застосування і впливають на різні процеси, що відбуваються в клітинах: синтез ДНК, білка та інше. Виділення хламідії у культурах клітин (Hela, McCoy, L-929) з застосуванням метаболіту - циклогексиміда, доданого в середовище 199 прийнятий нами за прототип (Karayiannis P., Hobson D., Lee N., Effect of cyclohtcximid on the in inftctive yield of a gehitel strain of Clamydia trachomatis McCoy cells. J. Clin. Microbiol., 1977, N 6, р. 328-331). Зважаючи на його токсичну дію на клітини, спосіб несприятливо діє на діагностичне виділення хламідій і не дає можливості накопичення біомаси збудника в послідуючих пасажах. В основу винаходу покладено задачу підвищення кількості діагностичного виділення хламідій і скорочення терміну виявлення. Задача, покладена в основу винаходу, вирішується тим, що в відомому способі виділення хламідій в культурах клітин, який включає викорис A ______________________________________________ 38578 з сечостатевих органів виявлені хламідії. З метою діагностики внутрішньоутробного інфікування плоду хламідіями в строці вагітності 37 тижнів досліджували околоплідні води, одержані трансабдомінальним амніоцинтезом даним способом і способом взятим нами за прототип. На 48 годині інкубації в культурах клітин виявляли цитоплазматичні включення хламідій флюоресцируючими антитілами. В паралельній пробі способом прототипом хламідії не виявлені. Завдяки прискоренню циклу розвитку хламідій в культура х клітин заявленим нами способом, скорочується строки лабораторної діагностики з 72 до 48 годин, так, через 36-48 годин інкубації цитоплазматичні вакуолі хламідій займали більшу частину цитоплазми і по зрілості включень відповідали 72 годинам циклу розвитку збудника, а також збільшувалась інфікованість клітинних культур до 80% в порівнянні з прототипом - до 50%. При подальшому культивуванні хламідії зберігають потенцію росту накопичення біомаси збудника в порівнянні з прототипом. Наведений приклад та ілюстрація свідчать про те, що використання способу діагностичного виділення хламідій у культурах клітин з внесенням до культурального середовища L-цистеіну-гидрох-лориду у дозі 2,5-3,0 мкг/мл підвищує продуктивність праці, дозволяє скоротити строки лабораторної діагностики завдяки прискоренню циклу розвитку хламідій з 72 до 48 годин, збільшити частоту виділення хламідій від хворих, підвищує накопичення біомаси збудника як у первинному, так і в наступних пасажах, сприяє оптимізації культивування хламідій у культурах клітин. Впровадження способу виділення хламідій в культурах клітин в практику лабораторій шкірновенерологічних, акушерсько-гінекологічних, педіатричних та урологічних закладів забезпечить значне підвищення ефективності досліджень при хламідіозі, а також знижує витрати ресурсів, необхідних при культивуванні. Фіг. 2 38578 _________________________________________________________ ДП "Український інститут промислової власності" (Укрпатент) Україна, 01133, Київ-133, бульв. Лесі Українки, 26 (044) 295-81-42, 295-61-97 __________________________________________________________ Підписано до друку ________ 2001 р. Формат 60х84 1/8. Обсяг ______ обл.-вид. арк. Тираж 50 прим. Зам._______ ____________________________________________________________ УкрІНТЕІ, 03680, Київ-39 МСП, вул. Горького, 180. (044) 268-25-22 ___________________________________________________________ 3