Моноклональні антитіла до нуклеокапсидного антигену p24 вірусу імунодефіциту людини, придатні для використання у імуноферментних тест-системах

УКРАЇНА (19) UA (11) 26765 (13) U (51) МПК (2006) C12N 5/00 МІНІСТЕРСТВО ОСВІТИ І НАУКИ УКРАЇНИ ДЕРЖАВНИЙ Д ЕПАРТАМЕНТ ІНТЕЛ ЕКТУАЛЬНОЇ ВЛАСНОСТІ ОПИС в идається під в ідпов ідальність в ласника патенту ДО ПАТЕНТУ НА КОРИСНУ МОДЕЛЬ (54) МОНОКЛОНАЛЬНІ АНТИТІЛА ДО НУКЛЕОКАПСИДНОГО АНТИГЕНУ P24 ВІРУСУ ІМУНОД ЕФІЦИТУ ЛЮДИНИ, ПРИДАТНІ ДЛЯ ВИКОРИСТАННЯ У ІМУНОФ ЕРМЕНТНИХ ТЕСТ-СИСТЕМАХ 1 2 Назва МКАТ Ізотип МКАТ Константа афінності, ´1010 моль/л Титр антитіл у культуральній рідині* (13) 26765 (11) 282Н10 IgG1 9,0 1:1000 284G7 IgG1 10,0 1:2000 "тестування у непрямому твердофазному ІФА на р24 ВІЛ (сорбція 0,2мкг/мл) Приклад 1. Одержання асцитичної рідини із вмістом моноклональних антитіл 282Н10. 284G7. Черевину миші Balb/c обробляли спиртом та внутрішньочеревно вводили по 0,5мл пристану (Sigma, США, кат. номер Т7640) за допомогою стерильного скляного шприца на 1мл або 2мл; використовували стерильні голки «Рекорд» 0,5 ´ 10-15мм. Мишей витримували 3-4 тижні. Процедуру праймування проводили у гумових рукавичках. Кріопробірки з замороженими клітинами діставали з судини Дюара із рідким азотом, витримували на повітрі 2-3 хвилини та занурювали у воду із температурою 37-40°С. Пробірки витримували у воді до тих пір, поки повністю розтане лід. Після цього за допомогою піпетки на 1мл суспензії гібридом переносили у пробірки на 15мл (Nunc, кат. номер 366060), повільно додавали 10-15мл середовища DMEM (Sigma, США, кат. номер D 5648) без сироватки. Центрифугували при 1300об/хв. протягом 3хв. Над осад видаляли, а осад клітин ресуспендували у 10мл середовища DMEM (Sigma, США, кат. номер D 5648) без сироватки. Суспензію переносили у "пеніциліновий" флакон та закривали пробкою. Суспензію клітин перемішували та набирали у стерильний шприц по 1мл, вводили у черевну порожнину мишей (справа або зліва від UA Корисна модель стосується імунохімії та гібридомної технології і може бути використаний для одержання моноклональних антитіл (МКАТ) до нуклеокапсидного антигену вірусу імунодефіциту людини (ВІЛ) та їхніх імуноферментних кон'югатів. Метою винаходу є одержання нових моноклональних антитіл до р24 ВІЛ, придатних для використання у імуноферментних тестсистемах. Відомі МКАТ до білку р24 вірусу імунодефіциту людини [І]. Проте згадані моноклональні антитіла непридатні для використання у імуноферментних тест-системах для серологічної діагностики. Найбільш близьким до запропонованих є моноклональні антитіла, які взаємодіють із білком р24 вірусу імунодефіциту людини [2]. У порівнянні із вищезгаданим антитілами клони 282Н10, 284G7 характеризуються більшою специфічністю та активністю у імуноферментному аналізі. Моноклональні антитіла продукуються гібридними клітинами, що одержані при злитті мієломних мишачих клітин Sp 2/0 та спленоцитів мишей лінії Balb/c. Клони МКАТ 282Н10, 284G7 характеризуються наступними ознаками (таблиця 1). Таблиця 1. U придатні для використання у імуноферментних тест-системах, належать до класу імуноглобулінів миші, продукуються гібридомами, які одержані внаслідок хімічно індукованої гібридизації імунокомпетентних В-лімфоцитів та мієломи Sp 2/0, які отримані за довгостроковою схемою імунізації мишей лінії BALB/c, характеризуються високими константою афінності й титром у культуральній рідині. (19) (21) u200704443 (22) 23.04.2007 (24) 10.10.2007 (72) НІКОЛАЄНКО ІГОР ВАСИЛЬОВИЧ, UA, ГАЛКІН ОЛЕКС АНДР ЮРІЙОВИЧ, UA (73) НІКОЛАЄНКО ІГОР ВАСИЛЬОВИЧ, UA, ГАЛКІН ОЛЕКС АНДР ЮРІЙОВИЧ, UA (56) (57) Моноклональні антитіла до нуклеокапсидного антигену р24 вірусу імунодефіциту людини, 3 26765 4 серединної лінії на 1см нижче від реберної дуги), фосфа тним буфером із швидкістю мл/хв. Ви хід яка за 3-4 тижні до цього була праймована пігу реєстрували при 280нм. Збирали фракцію пристаном. Мишей залишали на 5-10 днів для МКАТ в окремий флакон, додавали 1% 10%-ого накопичення у черевній порожнині асцитичної азиду натрію та зберігали при плюс 4°С до 6 рідини. місяців. Дану процедуру проводили у гумових Приклад 3. Використання моноклональних рукавичках. антитіл 282Н 10, 284G7 у складі імуносорбенту Через 5-10 днів після введення мишам тест-систем для виявлення антигену р24 ВІЛ у суспензій гібридом у очеревинних порожнинах сироватках чи плазмі крові людини. спостерігалося накопичення асцитичних рідин. Для Для одержання імуносорбенту сорбцію МКАТ її відбору використовували тр убку спеціальної 282Н10 або 284G7 у полістиролових планшетах голки довжиною 4см. Голки стерилізували шляхом проводили у 0,05М карбонат-бікарбонатном обробки етиловим спиртом (70%) протягом 10хв. буфері (рН 9,6) протягом ночі при 4°С в Черевину миші обробляли спиртом та робили концентрації 5мкг/мл. Для відмивання голкою прокол справа або зліва від серединної використовували фосфатно-сольовий буфер з лінії на 1см нижче від реберної дуги, відбирали детергентом (ФСБД), рН 7,2-7,4. У лунки асцитичну рідину у пробірку на 15мл (Nunc, кат. приготовленого імуносорбенту вносили 100мкл номер 366060). Після відбору рідини місце проколу досліджуваних сироваток та 50мкл кон'югату обробляли спиртовим розчином йоду та на 1хв. поліклональний антитіл до р24 ВІЛ з біотином та затискали пінцетом. Повторний підбір асцитичної інкубували при 37°С упродовж 60 хвилин та рідини проводили через 2-3 дні. Процедуру відмивали ФСБД 6 разів. Далі в лунки вносили по підбору асциту проводили доти, доки тварина 100 мкл розчину кон'югату стрептавідину й залишалася живою. У середньому одна миша пероксидази хрону та інкубували при 37°С здатна дати 2-5мл асциту за один відбір. упродовж 30 хвилин. Далі в лунки вносили по Асцитичн у рідину центрифугували у пробірці на 100мкл розчину хромогену 3,3',5,5'15мл (Nunc, кат. номер 366060) при 5000об/хв. тетраметилбензидину - й інкубували при 18-25°С в упродовж 5хв. Відбирали освітлену фракцію та темному місті протягом 30 хвилин, після чого зберігали у флаконах при мінус 20°С. реакцію зупиняли внесенням у всі лунки по 100мкл Процедуру відбору асциту проводили у стоп-реагенту. Через 5 хвилин після зупинення гумових рукавичках. реакції визначали оптичну густину при Приклад 2. Виділення та очистка 450нм/620нм. моноклональних антитіл 282Н10, 284G7 Приклад 4. Використання моноклональних Розморожували асцитичну рідину із вмістом антитіл 282Н10, 284G7 у складі імуносорбенту моноклональних антитіл та переносили її у тест-систем для одночасного виявлення антигену центрифужну пробірку на 15мл. Пробірку р24 ВІЛ й антитіл до ВІЛ у сироватках чи плазмі поміщали у нагріту до 37°С воду на 10 хвилин. крові людини. Зважували сульфат натрію в кількості, потрібній Для одержання імуносорбенту сорбцію МКАТ для 18%-го насичення (вага на об'єм) асцитичної 282Н10 або 284G7 у полістиролових планшетах рідини, всипали у пробірку з асцитом та старанно проводили у 0,05М карбонат-бікарбонатном струшували до розчинення сульфату натрію. буфері (рН 9,6) протягом ночі при 4°С в Спостерігали помутніння, зумовлене випадінням в концентрації 5мкг/мл. Для відмивання осад МКАТ. Пробірку центрифугували при використовували ФСБД. У лунки приготовленого 10000об./хв впродовж 5 хвилин у кутовому роторі. імуносорбенту вносили 100мкл досліджуваних Після чого надосад видаляли, а осад антитіл сироваток, 50мкл кон'гагату поліклональний розводили у 5мл деіонізованої води. Пробірку антитіл до р24 ВІЛ з біотином та кон'югату поміщали у нагріту до 45 - 50°С воду на 5 хвилин. антигенів ВІЛ з пероксидазою хрону й інкубували Знову зважуювали сульфа т натрію у кількості, при 37°С упродовж 60 хвилин та відмивали ФСБД потрібній для 16%-го насичення (вага на об'єм) 6 разів. Далі в лунки вносили по 100мкл розчину розчину антитіл, всипали у пробірку та старанно кон'югату стрептавідину й пероксидази хрону та струшували до розчинення сульфату натрію. інкубували при 37°С упродовж 30 хвилин. Далі в Спостерігали помутніння, зумовлене випадінням лунки вносили по 100мкл розчину хромогену антитіл в осад. Пробірку центрифугували при 3,3',5,5'-тетраметилбензидину - й інкубували при 10000об./хв впродовж 5 хвилин у кутовому роторі. 18-25°С в темному місті протягом 30 хвилин, після Після чого надосад видаляли, а осад антитіл чого реакцію зупиняли внесенням у всі лунки по розводили у 2-3мл деіонізованої води. 100мкл стоп-реагенту. Через 5 хвилин після Одержаний розчин МКАТ фільтрували через зупинення реакції визначали оптичну густину при фільтри з порами 0,22мкм. 450нм/620нм. Для переведення МКАТ у фосфатний буфер Перелік літературних джерел: використовували 0,02 М фосфатний буфер (рН 7,21. Welflea К., Misselwitza R., Hausdorf G. et al. Conformation, pH-induced conformational changes, 7,4) та колонку 1,5´20см з сефадексом G-25 and thermal unfolding of anti-p24 (HIV-1) monoclonal зрівноважену фосфатним буфером. МКАТ, antibody CB4-1 and its Fab and Fc fragments // одержані раніше, в об'ємі 2-3мл наносили на гель, після поглинання розчину гелем наносили такий Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Protein Structure and Molecular Enzymology. - 1999. - Vol. же об'єм буферу. Після поглинання гелем буферу 1431, 1. - P. 120 - 131. колонку заповнювали фосфатним буфером доверху, вставляли адаптер та проводять елюцію 5 26765 2. Stevens P., Francis С., Jolley M. et al. Monoclonal antibodies to HIV-1 p24 core protein include pairs which exhibit synergistic binding // Molecular Immunology. - 1993. - Vol. 30, 3. - P. 243 254. 3. Tijssen P. Preparation of enzyme-antibody or enzyme-macromolecule conjugates // Laboratory techiques in biochemistry and molecular biology: practice and theory of enzyme immunoassays / Editors R.H. Burdon, P.H. van Knippenberg. Amsterdam: Elsevier, 1985. - P. 221 - 241. 6