Моноклональні антитіла до поверхневого антигену вірусу гепатиту в, придатні для використання у імуноферментних тест-системах

Моноклональні антитіла до поверхневого антигену вірусу гепатиту В, придатні для 3 26766 4 Через 5-10 днів після введення мишам 10000об/хв. протягом 10хв. Освітлені МКАТ 95Е1 суспензій гібридом 95Е1 у очеревинних переносили до спільного флакону. Концентрація порожнинах спостерігалося накопичення МКАТ 95Е1, одержаних таким способом, асцитичних рідин. Для її відбору використовували коливається від 20 до 40мг/мл. трубку спеціальної голки довжиною 4 см. Голки Одержаний розчин МКАТ 95Е1 фільтрували стерилізували шляхом обробки етиловим спиртом через фільтри з порами 0,45мкм (Sigma, США, кат. (70%) протягом 10хв. Черевину миші обробляли номер F8273). спиртом та робили голкою прокол справа або Стандартний фосфатний буфер (рН 7,2-7,4) зліва від серединної лінії на 1 см нижче від фільтрували через фільтри з порами 0,45мкм реберної дуги, відбирали асцитичну рідину у (Sigma, США, кат. номер F8273). Використовували пробірку на 15мл (Nunc, кат. номер 366060). Після колонку 1,5 х 20см з сефадексом G-25 (Amersham відбору рідини місце проколу обробляли Pharmacia Biotech, 17-0033-01) зрівноважену спиртовим розчином йоду та на 1хв. затискали фосфа тним буфером шляхом пропускання його із пінцетом. Повторний підбір асцитичної рідини швидкістю 2мл/хв. протягом 20хв. МКАТ 95Е1 в проводили через 2-3 дні. Процедуру підбору об'ємі 2-3мл наносили на гель, після поглинання асциту проводили доти, доки тварина залишалася розчину гелем наносили такий же об'єм буферу. живою. У середньому одна миша здатна дати 2Після поглинання гелем буферу колонку 5мл асциту за один відбір. Асцитичну рідину заповнювали фосфатним буфером доверху, центрифугували у пробірці на 15мл (Nunc, кат. вставляли адаптер та проводили елюції номер 366060) при 5000 об/хв. упродовж 5хв. фосфа тним буфером із швидкістю 2мл/хв. Ви хід Відбирали освітлену фракцію та зберігали у піку реєстрували при 280нм. Збирали фракцію флаконах при мінус 20°С. МКАТ 95Е1 в окремий флакон, додавали 1% 10%Процедуру відбору асциту проводили у ого азиду натрію та зберігали при плюс 4°С до 4 гумових рукавичках. місяців. Приклад 2. Виділення та очистка Приклад 3. Спосіб одержання кон'югату моноклональних антитіл 95Е1 Розморожували моноклональних антитіл 95Е1 з пероксидазою асцитичну рідину та переносили її у центрифужну хрону пробірку та освітлювали при 4000об/хв. протягом Кон'югацію МКАТ з пероксидазою хрону 30хв. Після цього асцитичну рідину фільтрували здійснювали у співвідношенні антитіл до ферменту через фільтри з порами 0,45мкм (Sigma, США, кат. 2:1 (масові долі) методом періодатного окислення номер F8273). за Tijssen [3] із власними модифікаціями. Для афінної очистки використовували колонку При окисленні пероксидазу хрону розчиняли у з білком А-сефарозою об'ємом 10мл. Перед 0,1М бікарбонатному буфері до концентрації нанесенням асцитичної рідини колонку промивали 15мг/мл та додавали такий же об'єм 14мМ водного із швидкістю 1,5-2мл/хв 5-10 об'ємами 0,02М розчину періодату натрію. Суміш інкубували натрій-калій фосфатного буфер у, рН 7,0-7,2 протягом 2 годин при кімнатній температурі. (КН2Р04 та Na2HP04). Фільтровану асцитичну Одержаний таким чином розчин активованої рідину в об'ємі 20мл пропускали через колонку зі пероксидази додавали до розчину антитіл, які швидкістю 1мл/хв. Після цього промивали колонку попередньо діалізували проти 0,1М карбонатного 10-15 об'ємами фосфатного буферу. Елюцію розчину, рН 9,2. Суміш переносили у герметичну проводили за допомогою 0,1М лимонної кислоти в хроматографічну колонку та додавали 1/3 частину об'ємі 15мл. Вихід МКАТ 95Е1 реєстрували при сухого се фадексу G25, інкубували протягом 3 280нм. Пік, який виходить із колонки збирали у годин при кімнатній температурі. флакон, що містив 2мл 1М трис основи. рН По закінченні інкубації, розчин кон'югату одержаного розчину мав становити 7,0-8,0, що елюювали з колонки та зупиняли реакцію контролювали за допомогою індикаторного додаванням 1/20 об'ємні частини водного розчину паперу. Значення рН коректували додаванням NaBI-L» (5мг/мл), залишаючи на 30хв. при кислоти або трис-основи. Після виходу піка кімнатній температурі. Після цього ще додавали колонку промивали із швидкістю 1,5-2мл/хв 10-20 3/20 частини розчину боргідриду натрію, об'ємами 0,02М натрій-калій фосфатного буферу інкубували протягом 60хв. Одержаний розчин до нейтрального рН. пероксидазного кон'югату МКАТ переводили у МКАТ 95Е1 концентрували за допомогою 0,02М фосфатний буфер з 0,15М NaCI шляхом насиченого розчину сульфату амонію. Для цього діалізу. до охолодженого препарату МКАТ 95Е1 додавали Приклад 4. Використання кон'югату насичений розчин сульфату амонію до 40-50% моноклональних антитіл 95Е1 з пероксидазою насичення. Витримували на холоді (4°С) 2-3 хрону у тест-системі для виявлення поверхневого години, після чого центрифугували 20хв при антигену вірусу гепатиту В 4000об/хв. при кімнатній температурі. Осад МКАТ У лунки імуносорбенту вносили досліджувані ресуспендували в розчині сульфату амонію 40%сироватки (100мкл) та попередньо розведений ого насичення та переносили у центрифужні 1:11 розчин кон'югату моноклональних антитіл пробірки на 15мл (Nunc, кат. номер 366060). (50мкл). Центрифугували у кутовому роторі при 10000 Планшет інкубували при 42°С упродовж 120 об/хв. протягом 20хв. Надосад старанно видаляли, хвилин та відмивали фосфатно-сольовим а осад МКАТ 95Е1 розчиняли в мінімальній буфером з детергентом (ФСБД) 6 разів. Далі в кількості (1-2мл) деіонізованої води. Розчин лунки вносили по 100мкл розчину хромогену переносили у мікропробірки та освітляювали при 3,3',5,5'-тетраметилбензидину - й інкубували при 5 26766 18-25°С в темному місті протягом 30 хвилин, після чого реакцію зупиняли внесенням у всі лунки по 100мкл стоп-реагенту. Через 5 хвилин після зупинення реакції визначали оптичну густину при 45нм/62нм. Джерела інформації: 1. Zhenga X., Weinbergerc К., Gehrke R. et al. Mutant hepatitis В vims surface antigens (HBsAg) are immunogenic but may have a changed specificity // Virology. -2004. - Vol. 329, 2. - P. 454 - 464. 2. Канев А.Н., Бондарчук В.Б., Ма твеев Л.Э. и др. Получение и отбор моноклональных антител для выявления поверхностного антигена вируса гепатита В в сыворотках крови // Вопросы вирусологии. - 2002. - Том 47, № 1. -С. 15-21. 3. Tijssen P. Preparation of enzyme-antibody or enzyme-macromolecule conjugates // Laboratory techiques in biochemistry and molecular biology: practice and theory of enzyme immunoassays / Editors R.H. Burdon, P.H. van Knippenberg. Amsterdam: Elsevier, 1985. - P. 221 - 241. 6