Спосіб одержання біологічного препарату для алергічної діагностики туберкульозу

Спосіб одержання біологічного препарату для алергічної діагностики туберкульозу, що включає вирощування культури штаму Mycobacterium boris N 8 на синтетичному живильному середовищі, інактивацію автоклавуванням, відділення 3 А61К39/04, А61К39/35, 1995г.]. Для запобігання вказаним негативним моментам при виготовленні очищеного туберкуліну М. bovis, штам №8 вирощують на синтетичному живильному середовищі протягом 68 тижнів, посіви інактивують автоклавуванням, культуральну рідину відділяють від бактерійної маси, культуральний фільтрат піддають ультрафільтруванню через мембрани (пластинчасті, рулонні або у вигляді порожнистих волокон) із затримуючою здатністю 100 і 15кДа. Після ультрафільтрування через мембрани 100кДа концентрат відкидають. Фільтрат піддають ультрафільтруванню через мембрани 15кДа, фільтрат відкидають, а концентрат, що містить з'єднання мол. м. від 15 до 100кДа, використовують як цільовий продукт. Недоліком способу є те, що препарат містить артроспори збудника туберкульозу і при автоклавуванні вони не гинуть, а також через видалення молекул в діапазоні 300-100кДа втрачається фракція з високою специфічною активністю, вихід цільового препарату знижується, а специфічність суттєво не змінюється. У основу корисної моделі поставлена задача створити такий спосіб одержання біологічного препарату для алергічної діагностики туберкульозу, в якому шляхом додаткової обробки концентрату досягається підвищення специфічної активності туберкуліну, знищення артроспор збудника туберкульозу в препараті, збільшення виходу годного. Для вирішення задачі запропонований спосіб отримання біологічного препарату для алергічної діагностики туберкульозу, що включає вирощування культури штаму Mycobacterium boris N 8 на синтетичному живильному середовищі, інактивацію автоклавуванням, відділення культурального фільтрату, його концентрацію ультрафільтруванням на мембрані з порогом розділення 100±10кДа, відділення фільтрату з подальшою повторною концентрацією ультрафільтруванням на мембрані з порогом розділення 15±1,5кДа і виділенням цільового продукту у вигляді концентрату, в якому, згідно корисної моделі, виділений концентрат додатково піддають ультрафільтруванню на мембрані з порогом розділення 300±10кДа до зменшення об'єму ретентата не більше ніж в 20 разів, далі концентрують ультрафільтруванням на мембрані з порогом розділення 10±1,0кДа до досягнення змісту туберкулопротєїнів 0,3+0,09 або 0,6±0,18мг/мл і додають консервант, що містить 0,5% фенолу, 10% гліцерину, 0,001% твіну 80 і 0,51% формаліну на 100мл концентрату. Конкретні приклади виконання способу. Приклад 1 Для виготовлення алергену «туберкуліну очищеного для ссавців» М. bovis, штам №8 вирощують при 37°С протягом 8 тижнів на середовищі Сотона, інактивують автоклавуванням при 121°С 30хв. Бактерійну масу відділяють фільтрацією через «грубий» і стерилізуючий фільтр. Культуральний фільтрат піддають ультрафільтруванню через мембрани РТМК 300К 28240 4 (РТМКОМР04) із затримуючою здатністю 300кДа і більш до зменшення об'єму ретентата (затримуваної фракції Р300) не більше ніж в 20 разів. Ретентат відкидають. Одержаний фільтрат Ф300 (цільовий продукт) збирають, в стерильних умовах доводять вміст туберкулопротеїнів до 0,3±0,09мг/мл (при виготовленні туберкуліну з активністю 25000МЕ/мл), додають фенол, гліцерин, твін 80 і формалін в масовій частці, відповідно, 0,5%. 10% і 0,001% та 0,5% на 100мл концентрату. Для виготовлення туберкуліну з активністю 50000МЕ/мл фільтрат концентрують на мембранах з межею затримання 10кДа до досягнення концентрації туберкулопротеїнів 0,6±0,18мг/мл, додають фенол, гліцерин і твін 80 та формалін в кількості, відповідно 0,5%, 10% і 0,001% та 0,5% на 100мл концентрату. Одержаний зразок перевірений на активність порівняно з референтною серією ППД туберкуліну Sanofi philaxia для ссавців сер.02796/2 і ППД туберкуліну для ссавців Курської біофабрики відповідно до ГОСТ 16739-88 "Туберкулін очищений (ППД) для ссавців" Результати визначення активності туберкуліну очищеного серії 2-00 (концентрація білка 0,66мг/мл) порівняно із стандартним розчином ППД туберкуліну Sanofi philaxia (концентрація білка 1мг/мл) представлені в таблиці 1. Результати визначення активності очищеного тубе на морських свинках, сенсибілізованих М.bo Номера тварин 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. Сума діаметрів Діаметр еритем Стандартний розчин ППД туберкуліну Sanofi (контроль) 100 МО 10 9 9 15 13 12 10 6 8 6 9 12 7 149 Активність випробовуваної серії = 151:149 х 50 000 М.Е.= 50650 М.Е. у 1мл. Препарат був стерильний. Приклад 2 Для порівняння специфічності туберкулін очищений ультрафільтруванням (цільовий продукт) випробуваний порівняно з ППД туберкуліном серії 11 Курської біофабрики в тривало благополучному по туберкульозу стаді. З 102 корів на введені препарати реагувало 6 (табл. 2). Результати визначення специфічності цільового пр 5 28240 6 благополучному по туберкульозу стаді і контрольного препарату. Завдяки ніж у вихідного видаленню цієї фракції перехресна активність цільового і після введення алергенів Потовщення шкірних складок в мм допродукту знижувалася з 6,5 до 4,9 (на №, кличка ППД туберкулін Курської біофабрики 24,6%) і достовірно не відрізнялася продукт) Туберкулін очищений (цільовий від показника ППД туберкуліну 5000МО Для (4,4). порівняння сер. 11 5000МО ефективності очищення по прототипу частину Мечта 6-9=3 6-8=2 культурального фільтрату піддавали 3167 5-10=5 5-9=4 ультрафільтруванню 6-12=6 через мембрани із Фея 6-12=6 затримуючою здатністю 100 і 15кДа і одержували Лада 5-9=4 5-8=3 ретентат Р100 і фільтрат Ф100, який 7929 6-10=4 6-8=2 концентрували на мембранах з межею затримання 15кДа (цільовий продукт за прототипом). Як видно з таблиці 25 корів реагували на ППД Приклад 4 туберкулін Курської біофабрики і лише 3 корови Після вирощування виробничого штаму реагували на цільовий продукт, що указує на його збудника туберкульозу, автоклавування і велику специфічність (на 40% більше). Для фільтрації культуральної рідини одержано 10л виготовлення туберкуліну з активністю культурального фільтрату із вмістом 50000МЕ/мл фільтратів концентрують на туберкулопротеїнів 0,25мг/мл або 2500 міліграм у мембранах з межею затримання 10кДа до всьому об'ємі. досягнення концентрації туберкулопротеїнів 10л культурального фільтрату піддали 0,6±0,18мг/мл, додають фенол, гліцерин і твін 80 ультрафільтруванню через мембрани РТМК 300К та формалін в масовій частці, відповідно, 0,5%, (РТМКОМР04). При цьому було одержано 500мл 10% і 0,001% і 0,8% на 100мл концентрату. ретентата (фракції, що видаляється) і 9500 Курський туберкулін був нестерильний і мав фільтрату. Вміст туберкулопротеїнів в ретентаті артроспори збудника туберкульозу, тоді як склав 0,6мг/мл або 300 міліграм в загальному запропонований препарат був стерильний. об'ємі. Одержаний фільтрат (9500мл) містив 2200 Приклад 3 міліграм туберкулопротеїнів (0,23мг/мл). Фільтрат Ефективність очищення від (9500мл) піддали концентрації на мембранах низькоспецифічних компонентів за допомогою PTGK (PTGK. OMP04) з межею затримання 10кДа ультрафільтрування на мембранах з межею до об'єму 3166мл (у 3 рази). У одержаному затримання 300кДа ілюструють результати концентраті вміст туберкулопротеїнів склав дослідження фракцій в іммуноферментном аналізі 0,66мг/мл (загальне - 2089 міліграм). Активність (ІФА) і в шкірній пробі на морських свинках. 1мл одержаного продукту склала 50650 ME, в У ІФА (таблиця 3) визначили індекс перерахунку на 1 міліграм туберкулопротеїнів специфічної і перехресної активності фракцій, 76742ME. одержаних при різних режимах При отриманні цільового продукту по ультрафільтрування. Контролем служили прототипу активність 1мл продукту складає 49500початковий культуральний фільтрат і ГШД 50000МЕ, а 1 міліграм туберкулопротеїнів туберкулін. Препарати в рівних по білку дозах 49750ME, до досягнення концентрації фіксували в однакових умовах на одній туберкулопротеїнів 0,6±0,18мг/мл, додають фенол, імунологічній панелі. ІФА ставили в непрямому гліцерин і твін 80 та формалін в кількості, варіанті, з використанням референтних бичачих відповідно, 0,5%, 10%, 0,001% і 1% на 100мл антисироваток до M. bovis Vallee і до суміші концентрату. атипових мікобактерій 2-4 групи по Рапьону. Як Препарат був стерильним. кон'югата використовували кролячі IgG до IgG Отже, вихід цільового продукту по способу, що великої рогатої худоби мічені пероксидазой заявляється, на 35,1% вищий. (Sigma). Таблиця 3 Специфічна активність фракцій туберкулін, отриманих за пропонованим способом Показники Індекс специфічної активності Індекс перехресної активності Культуральний фільтрат (початковий продукт) Р 300 (фракція, яку відкидають) Ф 300 (цільовий продукт) Стандартний розчин ППД туберкуліну (контроль) 2,7 1,6* 2,6 3,4 6,5 9,1* 4,9 4,4 * - відмінності статистично достовірні; Як видно з таблиці 3 специфічна активність у РЗОО (фракції, що видаляється) була достовірно нижчою, а перехресна активність достовірно вища,