Спосіб одержання препарату для діагностики туберкульозу

Способ получения препарата для диагностики туберкулеза, включающий выраіцивание микобактерий туберкулеза, стерилизацию туберкулезных культур, фильтрацию микобактерий, концентрирование и очистку культуральной жидкости, стандартизацию продукта, о т л и ч а ю щ и й с я тем, что концентрирование и очистку фильтрата проводят путем ультрафильтрации при 8-12°С до концентрации культуральной жидкости 1/6-1/8 от исходного объема и после операции стандартизации' производят стерилизующую фильтрацию продукта. Изобретение относится к фармации, а именно к способу получения диагностического препарата, который может быть использован для диагностики туберкулеза. Наиболее близким к предлагаемому способу является способ получения диагностического препарата путем выращивания микобактерий туберкулеза, стерилизации туберкулезных культур, фильтрации мичобактерий, концентрирования фильтрата культуральной жидкости путем выпаривания его в вакууме при 74-78°С и дав4 лении 5,3 • 10 Па до 1/8-1/12 исходного объема, очистки сепарированием, стерилизации и стандартизации продукта (Регламент производства № 183-89 "Аллерген туберкулезный концентрированный жидкий для накожного применения (Альт туберкулин-АТ)" Харьковского предприятия по производству бактерийных препаратов, 1989). Данный способ имеет ряд недостатков: длительность процесса, низкая очистка от балластных примесей, низкий выход целевого продукта, нестабильность продукта. В основу изобретения поставлена задача создать способ получения препарата для диагностики туберкулеза, в котором технологические стадии и параметры процесса позволили бы получить препарат со стабильными физико-химическими свойствами, сократить длительность процесса, повысить выход целевого продукта. Поставленная задача решается тем, что в способе получения препарата для диагностики туберкулеза, включающем вы О 21470 ращивание микобактерий туберкулеза, стерилизацию туберкулезных культур, фильтрацию микобактерий, концентрирование и очистку фильтрата культуральной жидкости, стандартизацию продукта, согласно изобретению концентрирование и очистку фильтрата проводят путем ультрафильтрации при температуре 8-12°С до концентрации культуральной жидкости 1/61/8 от исходного объема и после операции стандартизации производят стерилизующую фильтрацию продукта. В табл. 1-3 приведены данные, обосновывающие достаточность выбранных соотношений для достижения обеспечиваемого изобретением технического результата. Как видно из данных, приведенных в табл. 1, оптимальной является температура 8-12°С. Использование температуры ниже указанной величины приводит к повышению содержания балластных белков, а повышение температуры приводит к снижению выхода целевого продукта. Как видно из данных, приведенных в табл. 2, оптимальной является концентрация культуральной жидкости 1/6-1/8 от исходного объема. Использование соотношений менее указанных приводит к повышенному содержанию балластных белков и снижению выхода целевого продукта, а увеличение концентрации приводит к высокому содержанию белка, что в свою очередь сопровождается невозможностью проводить стерилизующую фильтрацию н нестабильностью препарата. Как видно из данных, приведенных в табл. 3, после термической стерилизации (как в прототипе) наблюдается падение выхода целевого продукта, а использование стерилизующей фильтрации не влияет на выход целевого продукта. Таким образом, стерилизующая фильтрация обеспечивает стабильность препарата и сохранность целевого продукта. Преимущества предлагаемого способа по сравнению с прототипом приведены в табл. 4. П р и м е р 1. Емкость, содержащую питательную среду, засевают культурой микобактерий и выдерживают в термостате при 38-39°С в течение 7 - 8 нед. Полученную культуру микобактерий стерилизуют текучим паром при 100-102°С и давлении 1 • 10 4 Па в течение 1 ч. Затем микробную взвесь фильтруют через многослойный марлевый фильтр. Полученный прозрачный фильтрат культуры концентрируют на аппарате для ультрафильтрации на мембранах с величиной пор, отсе 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 кающих белковые молекулы массой 1 0 20 кД при 8°С до концентрации культуральной жидкости 1 /6 от исходного объема. Затем производят стандартизацию продукта путем добавления к полученному раствору фенола до концентрации его 0 , 2 0,25 об.%, после чего раствор подвергают стерилизующей фильтрации через мембранный фильтр с величиной пор 0,22 мкм. Длительность процесса при получении 15 л препарата из культуральной жидкости составляет 7 сут. Содержание балластных белков составляет 0,32 мг/мл. Выход целевого продукта из 1 л культуральной жидкости - 48000 ТЕ/мл. П р и м е р 2. Емкость, содержащую питательную среду, засевают культурой микобактерий и выдерживают в термостате при 38-39°С в течение 7 - 8 нед. Полученную культуру микобактерий стерилизуют текучим паром при 100-102°С и давлении 1 • 10 4 Па в течение 1 ч. Затем микробную взвесь фильтруют через многослойный марлевый фильтр. Полученный прозрачный фильтрат культуры концентрируют на аппарате для ультрафильтрации на мембранах с величиной пор, отсекающих белковые молекулы массой 10-20 кД при 10°С до концентрации культуральной жидкости 1/7 от исходного объема. Затем производят стандартизацию продукта путем добавления к полученному раствору фенола до концентрации его 0,2-0,25 об.%, после чего раствор подвергают стерилизующей фильтрации через мембранный фильтр с величиной пор 0,22 мкм. Длительность процесса при получении 15 п препарата из культуральной жидкости составляет 9 сут. Содержание балластных белков составляет 0,36 мг/мл. Выход целевого продукта из 1 л культуральной жидкости 50000 ТЕ/мл. П р и м е р 3. Емкость, содержащую питательную среду, засевают культурой микобактерий и выдерживают в термостате при 38-39°С в течение 7 - 8 нед. Полученную культуру микобактерий стерилизуют текучим паром при 100-102°С и дав4 лении 1 • 10 Па в течение 1 ч. Затем микробную взвесь фильтруют через многослойный марлевый фильтр. Полученный прозрачный фильтрат культуры концентрируют на аппарате для ультрафильтрации на мембранах с величиной пор, отсекающих белковые молекулы массой 1 0 20 кД, при 12°С до концентрации культуральной жидкости 1/8 от исходного объема. Затем проводят стандартизацию продукта путем добавления к полученному 21470 раствору фенола до концентрации его 0,20,25 об.%, после чего раствор подвергают стерилизующей фильтрации через мембранный фильтр с величиной пор 0,22 мкм. Длительность процесса при получе- 5 6 нии 15 л препарата из культуральной жидкости составляет 10 сут. Содержание балластных белков составляет 0,30 мг/мл. Выход целевого продукта из 1 л культуральной жидкости - 54000 ТЕ/мл. Т а б л и ц а Зависимость физико-химических свойств препарата от температуры процесса ультрафильтрации Температура, Показатели 4 °С 5 Содержание балластных белков, мг/мл Выход целевого продукта из 1 л культуральной жидкости, ТЕ/мл 1 8 10 12 15 0,50 0,30 0,36 0,35 0,33 52000 50000 54000 48000 40000 Т а б л и ц а 2 т Зависимость физико-химических свойств препарата от концентрации культуральной жидкости Концентрация культуральной жидкости от исходного объема Показатели 1/5 Содержание белка, мг/мл Выход целевого продукта из 1 л культуральной жидкости, ТЕ/мл Содержание балластных белков, мг/мл 1/6 1/7 1/8 1/9 0,61 0,70 0,75 0,80 1,0 44000 48000 50000 54000 58000 0,42 0,35 0,34 0,30 0,27 Т а б л и ц а Зависимость выхода целевого продукта от вида стерилизации Вид стерилизации Выход целевого продукта из 1 л культуральной жидкости, ТЕ/мл До стерилизации Термическая стерилизация Стерилизующая фильтрация После стерилизации 48000-54000 48000-54000 36000-40000 48000-54000 3 21470 8 Т а б л и ц а Характеристика препарата в зависимости от способа получения Способ Показатели Предлагаемый Продолжительность процесса получения 15л препарата из культуральной жидкости, сут. Содержание балластных белков, мг/мл Выход целевого продукта из 1 л культуральной жидкости, ТЕ/мл Прототип 7-Ю 30-35 0,30-0,36 1,3-1,6 48000-54000 36000-40000 Упорядник Техред М. Келемеш Коректор О. Обручар Замовлення 544 Тираж Підписне Державне патентне відомство України, 254655, ГСП, Київ-53, Львівська пл., 8 Відкрите акціонерне товариство "Патент", м. Ужгород, вул. Гагаріна, 101 4