Спосіб діагностики первинної відкритокутової глаукоми

УКРАЇНА (19) UA (11) 29947 (13) U (51) МПК (2006) A61B 3/00 G01N 33/49 МІНІСТЕРСТВО ОСВІТИ І НАУКИ УКРАЇНИ ДЕРЖАВНИЙ ДЕПАРТАМЕНТ ІНТЕЛЕКТУАЛЬНОЇ ВЛАСНОСТІ ОПИС видається під відповідальність власника патенту ДО ПАТЕНТУ НА КОРИСНУ МОДЕЛЬ (54) СПОСІБ ДІАГНОСТИКИ ПЕРВИННОЇ ВІДКРИТОКУТОВОЇ ГЛАУКОМИ 1 2 (13) 29947 (11) Недоліком найближчого аналога є те, що дані їх досліджень показали, що немає статистично достовірної різниці частоти наявності гена HLADQA1 у порівнянні з результатами отриманими у здорових людей у популяції жителів Іспанії. В основу корисної моделі поставлено задачу розробити спосіб діагностики захворювання на первинної відкритокутової глаукоми у популяції жителів України. Поставлена задача вирішується тим, що для діагностики первинної відкритокутової глаукоми у пробах крові індивідуальних хворих визначають імунологічну ланку системи гена HLA DRB1 і атигенів II класу гістосумісництва D - локус - DR в полімеразній ланцюговій реакції і по частоті гена HLA DRB1 у хворого визчають ступінь захворювання на первинну відкритокутову глаукому. Дослідження. У хворих на первинну відкритокутову глаукому та у здорових людей, в умовах стаціонару очного відділення Центральної міської лікарні, в маніпуляційній кімнаті, медсестра відбирала проби крові у стерильні вакуумтейнери у кількості 5-9мл. Зразки крові надходили до лабораторії генетики кафедри мікробіології, вірусології та імунології Національного медичного університету імені О.О.Богомольця. Визначення специфічностей гена HLA DRB1 у зразках крові хворих виконували за допомогою полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР). Полімеразна ланцюгова реакція здійснювалася поетапно. UA Корисна модель відноситься до медицини, а саме офтальмології. В етіопатогенезі первинної відкритокутової глаукоми все більшу увагу починає надавати офтальмолог вивченню імунологічної ланки, яка проявляється змінами в системі HLA (human leukocyte antigens). Спектр антигенів HLA визначає біологічну індивідуальність кожного організму. Гени цього комплексу контролюють синтез тканинних антигенів. При встановленні імуногенетичних маркерів захворювань необхідно враховувати національний склад обстежуваних груп людей, бо в різних популяціях спостерігається взаємозв’язок однієї і тієї ж патології з різноманітними антигенами HLA. В системі HLA прийнято виділяти гени і антигени 3 класів: І клас-локуси А, В, С; II клас - D - локус (D-, DR-, DQ-, DP- сублокуси); III клас - поліморфні гени. Так вчені з Іспанії [1] проводили дослідження специфічностей гена HLA-DQA1 у 84 хворих на первинну відкритокутову глаукому. Дане дослідження взяте нами за найближчий аналог. Спільні суттєві ознаки найближчого аналога і корисної моделі є те, що проводили генетичне обстеження (гени системи HLA) хворих на первинну відкритокутову глаукому; аналіз зразків ДНК проводили методом полімеразної ланцюгової реакції. U системі спектра антигенів, аналіз зразків ДНК методом полімеразної ланцюгової реакції з урахуванням біологічної індивідуальності кожного організму, який відрізняється тим, що у пробах крові визначають імунологічну ланку системи гена HLA DRB1 в полімеразній ланцюговій реакції і по частоті специфічностей DRB1*01, DRB1*02, DRB1*13 гена HLA DRB1 у хворих на первинну відкритокутову глаукому визначають ступінь захворювання. (19) (21) a200702338 (22) 05.03.2007 (24) 11.02.2008 (72) САЛАТА ПАВЛО МИКОЛАЙОВИЧ, UA (73) САЛАТА ПАВЛО МИКОЛАЙОВИЧ, UA (56) (57) Спосіб діагностики первинної відкритокутової глаукоми, який передбачає обстеження хворих на первинну відкритокутову глаукому, відбір проб крові для проведення імуногенетичного аналізу з наступним визначенням генетичних маркерів в 3 Виділення ДНК. Кров відбирають одноразовою голкою в стерильну пробірку із антикоагулянтом - ЕДТА (К2Е). 1. 0,5мл свіжої чи замерзлої крові переносять у пластикову пробірку типа "Епендорф" об’ємом 1,5мл та додають 0,5мл лізуючого буферу, все перемішують піпетируванням та осаджають у центрифузі типа "Епендорф" протягом 1 хвилини при 14000 обертів за хвилину. 2. Надосадову рідину видаляють за допомогою піпетки. 3. До осаду додають 0,5мл лізуючого буфера, перемішують піпетируванням. 4. Пробірку центрифугують протягом 1 хвилини при 14000 обертів за хвилину. 5. Стадії 2-4 повторюють до тих пір, поки осад не стане світлим (2-4 рази). 6. Надосадову рідину видаляють за допомогою піпетки. 7. В пробірку вносять 60-100мкл (в залежності від величини осаду) буферу для протеінази К, 1мл протеінази К та перемішують піпетируванням. 8. Пробірку ставлять на 30-60 хвилин у термостат при температурі +55°С чи на 12-16 годин при температурі +37°С. 9. Пробірку ставлять на 10 хвилин у термостат при температурі +95°С. 10. Після відсмоктування матеріалу конденсат із стінки пробірки осаджають центифугуванням протягом 5-10 секунд. 11. Розчин ДНК зберігають протягом тижня при температурі +4°С. Для більш тривалого зберігання рекомендована температура -20°С. Постановка полімеразної ланцюгової реакції. Проведення полімеразної ланцюгової реакції, електрофорезу, аналіз результатів повинні проводитися в одноразових гумових рукавичках та повинні бутиізольовані один від одного, тобто розміщені в різних приміщеннях. Поверхні робочих столів, а також приміщення в яких проводять основні роботи повинні після закінчення робіт опромінюватися ультрафіолетом. 1.1. Для постановки полімеразної ланцюгової реакції використовують комплект реагентів для ампліфікації ДНК, що містить: ДНК-полімеразу, мінеральну олію, розчинник 1 та 2, суміш 1 та 2, DRB 01-14. 1.2. Реакцію проводять у пробірках 500мкл. 1.3. Кожна пробірка перед постановкою в термоцикл ер містить: 5мкл розчинника 1, 4мкл суміші 1 чи 2, а також пробірки з назвами DRBспецифічностей, 0,1мкл ДНК-полімерази, 1 каплю мінеральної олії (10мкл), 1мкл розчину з виділеною ДНК. 1.4. Кожна пробірка з негативним контролем перед постановкою в термоциклер містить: 5мкл розчинника 1, 4мкл суміші 1 чи 2, а також пробірки з назвами DRB-специфічностей, 0,1мкл ДНКполімерази, 1 каплю мінеральної олії (10мкл). 1.5. При підготовці декількох проб однієї специфічності в одній пробірці потрібно змішати відповідну кількість розчинника 1, ДНК-полімерази та суміші із пробірок 1 чи 2, а також із пробірки із назвою DRB-специфічності. Готову суміш 29947 4 перемішують та переносять по 9мкл в кожну із 10 пробірок. В кожну із пробірок капають по 1 краплі мінеральної олії. Закривають пробірки. 1.6. Для приготування декількох проб різних специфічностей в одній пробірці потрібно змішати відповідну кількість розчинника 1 та ДНКполімерази. Готову суміш перемішують та переносять по 5мкл в кожну із 10 пробірок. В кожну із пробірок окремим наконечником вносять по 4мкл із пробірок, промаркованих як суміш 1 та 2 чи з назвами DRB-специфічностей. В кожну із пробірок капають по 1 краплі мінеральній олії. Закривають пробірки. 1.7. Переносять готові пробірки із сумішами на робоче місце для роботи з ДНК. 1.8. Додають в кожну пробірку по 1мкл розчину ДНК (за виключенням пробірок із негативним контролем). 1.9. Переносять пробірки в інше приміщення для роботи із ампліфікованим матеріалом, ставлять у термоциклер та задають програму. 2. Типування гена DRB1. 2.1 Перший етап: 2.1.1. Визначення необхідної кількості пробірок: кількість проб ДНК, взятих для типування, помножити на 2 плюс 2 пробірки із негативним контролем. Промаркувати пробірки. 2.1.2. Приготувати повні суміші для ПЛР (пункти 1.5 чи 1.6), використовуючи суміш 1 у кількості n+1 та суміш 2 у кількості n+1. 2.1.3. Виконати пункти 1.7-1.9. 2.1.4. Ампліфікація. Для проведення ампліфікації використовують програму створену для ампліфікатора типа МС2, запрограмованого на об’єм 10мкл, в режимі активного, швидкого регулювання. 2.1.5. Електрофорез. 2.1.5.1. Приготування буфера для електрофорезу. Для приготування робочого розчину буфера для електрофорезу вміст пакету із надписом "буфер для елетрофорезу" розчиняють віл дистильованої води. 2.1.5.2. Приготування агарозного геля. Для аналізу продуктів ампліфікації готують 3% агарозний гель. Для цього в термостойку колбу кладуть 1,2г агарози та заливають її 40мл буферу для електрофорезу. Агарозу розплавляють на електроплиті чи у мікрохвильовій печі, доводячи її до кипіння. Колбу з агарозою охолоджують до температури 40-60°С та вносять 3мкл розчину бромістого етидія та заливають в спеціальну форму із вставленими в неї гребінками. Після застигання геля гребінки обережно виймають. Гель разом із формою ставлять у апарат для електрофорезу, заповнений буфером для електрофорезу, який повинен покривати гель на 12мм. 2.1.5.3. В кожну з лунок 3% агарозного геля під буфер окремим наконечником вносять по 5мкл окрашеного ампліфікату. В одну з лунок геля вносять 5мкл з пробірки із маркіровкою "маркер длин". Електрофорез проводять при напрузі 200250 Вольт. Час проведення електрофорезу після закінчення першого етапу-10 хвилин, після закінчення другого етапу-15-20 хвилин. 5 2.1.6. В кожну з пробірок із позитивною реакцією додають по 50мкл розчинника 2. Ставлять пробірки в побутовий холодильник та зберігають при температурі +4°С. Продукти ампліфікації першого етапу використовуються потім на другому етапі типування. 2.2. Другий етап: 2.2.1. Приготування ПЛР-суміші для типирування (пункти 1.6 та 1.7) використовуючи DRB 1*01,10n штук; DRB1*07,09n штук; DRB1*04n штук; DRB1*15n штук; DRB1*16n штук; де nкількість позитивних реакцій із сумішшю 1. 2.2.2. Приготування ПЛР-суміші для типирування (пункти 1.6 та 1.7) використовуючи DRB1*08,11k штук; DRB1*12,14k штук; DRB1*03k штук; DRB1*13(1)k штук; DRB1*13(2)k штук; де k кількість позитивних реакцій із сумішшю 2. 2.2.3. Перенести готові пробірки в приміщення для роботи із ампліфікованим матеріалом. 2.2.4. Додають окремими наконечниками під олію по 1мкл розведеного ампліфікату (дивись пункт 2.1.6): із кожної пробірки, що прореагувала із сумішшю 1 в пробірки із сумішами DRB1*01,10, DRB1*07,09, DRB1*04, DRB1*15, DRB1*16; із кожної пробірки, що прореагувала із сумішшю 2 в пробірки із сумішами DRB1*08,11, DRB1*12,14, DRB1*03, DRB1*13(1), DRB1*13(2). 2.2.5. Ставлять пробірки в ампліфікатор, задають програму. Для проведення ампліфікації використовують програму наведену для ампліфікатора типа МС2, запрограмованого на об’єм 10мкл в режимі активного, точного регулювання. 2.2.6. Після закінчення ампліфікації проводять електрофорез (пункт 2.1.5). 2.3. Детекція ДНК. Після проведення електрофорезу гель виймають і проглядають на трансілюмінаторі в ультрафіолетовому світлі з довжиною хвилі 254нм. Продукт ампліфікації можна побачити у вигляді полоси червоно-помаранчевого кольору, що світиться. Оцінювання результатів реакції. Специфічність продуктів ампліфікації, що утворилися визначається за їх відношенням до розташування на агарозному гелі полос маркера довжини ампліфікованих фрагментів. Результати. Було обстежено 80 хворих на первинну відкритокутову глаукому. Вік хворих коливався від 52 до 84 років (середній вік - 64 роки). Контрольна група складала 20 здорових людей віком 19-24 років. Частота специфічностей гена HLA DRB1 у хворих на первинну відкритокутову глаукому коливалася від 2,5% - DRB1*08, DRB1*10 до 32,5% - DRB1*11(O5),DRB1*13 (табл.1). В контрольній групі не виявлені специфічностей гена HLA DRB1 - DRB1*08, DRB1*10, DRB1*16, DRB1*17(03) і DRB1*18(03) (табл.2). У контрольній групі частота специфічностей гена HLA DRB1 коливалася від 5% - DRB1*12(05), DRB1*14(06) до 40% - DRB1*11(05). 29947 6 Таблиця 1 Частота специфічностей гена HLA DRB1 у хворих на первинну відкритокутову глаукому (n=80) Специфічність DRB1*01 DRB1*02 DRB1*04 DRB1*07 DRB1*08 DRB1*10 DRB1*11(05) DRB1*12(05) DRB1*13 DRB1*14(06) DRB1*15 DRB1*16 DRB1*17(03) DRB1*18(03) Частота, % 27,5 27,5 22,5 25 2,5 2,5 32,5 5 32,5 10 27,5 20 20 10 Таблиця 2 Частота специфічностей гена HLA DRB1 у контрольній групі (n=20) Специфічність DRB1*01 DRB1*02 DRB1*04 DRB1*07 DRB1*08 DRB1*09 DRB1*10 DRB1*11(05) DRB1*12(05) DRB1*13 DRB1*14(06) DRB1*15 DRB1*16 DRB1*17(03) DRB1*18(03) Частота, % 10 10 15 10 5 40 5 10 5 15 Результати досліджень показують підвищення експресії специфічностей DRB1*01, DRB1*02, DRB1*13, що відрізняється від контрольної групи людей. Ці дані свідчать про використання генетичного дослідження (визначення специфічності гена HLA DRB1) для діагностики первинно відкритокутової глаукоми. За умови присутності у хворих цих специфічностей їх відносять до груп ризику. Література: 1. Е Аbесіа, В Martinez-Jarreta, Y Casalod, В Bell, I Pinilla, and FM Honrubia Genetic markers in primary open-angle glaucoma. Int Ophthalmol, January 1, 1996; 20(1-3): P.79-82.