Застосування інфузорії paramecium caudatum ehrenberg для експрес-визначення токсичності лікарських засобів

Застосування інфузорії Paramecium caudatum Ehrenberg для експрес-визначення токсичності лікарських засобів. (19) (21) 98010528 (22) 30.01.1998 (24) 15.11.2000 (33) UA (46) 15.11.2000, Бюл. № 6, 2000 р. (72) Дітчук Остап Романович, Малик Остап Григорович, Коцюмбас Ігор Ярославович 30232 Запропоноване технічне рішення не випливає явним чином з рівня техніки, що дозволяє зробити висновок про відповідність його критерію "Винахідницький рівень" і може бути використане в токсикологічних дослідженнях. Отже, запропоноване технічне рішення є новим, промислово придатним, широкодоступним, має винахідницький рівень, тобто відповідає всім умовам патентоспроможності винаходу, відповідно до статті 6 розділу Закону України "Про охорону прав на винаходи і корисні моделі" № 3687-XІІ. Реалізацію винаходу легко здійснити в зв'язку з тим, що отримання лікарських засобів, різних за хімічною будовою, функціональним призначенням та токсичністю, налагоджене на фармацевтичних заводах, а тест-об'єкт, інфузорія Paramecium caudatum, широкодоступна. Для здійснення пришвидшеного визначення токсичності лікувальних засобів використовують інфузорію Раrаmесіum caudatum Ehrenberg. На першому етапі змішують 9 мл культури інфузорій і 1 мл розчину, концентрація лікувального препарату в якому є в 10 разів більшою за досліджувану. Таким чином отримують розчини, в яких вміст лікарського засобу складає 10, 1, 0,1 та 0,01%. За допомогою мікроскопа МБС-9 (збільшення 9´4) слідкують за формою тіла, поведінкою, кількістю найпростіших перед дослідом і через 15 хв, 1, 3, 6, 12, 24, 48 год від його початку. Для підрахунків чисельності використовують лічильну камеру Богорова. Вона виготовлена з органічного скла, розміром 105´55´10 мм, містить звивисту (з 4-х колін) заглибину: обернено трапецієвидну в поперечному перерізі (довжина - 90 мм, глибина – 7 мм, ширина зверху - 10 мм, знизу - 4 мм). Підрахунок здійснюють уздовж довжини заглибини кож ного коліна, причому його верхня ширина постійно знаходиться в полі зору бінокуляра, що унеможливлює недооблік інфузорій. Показниками втрати життєдіяльності парамеції служать повне припинення локомоторної функції, деформація тіла, розшарування та руйнування оболонки, розсіювання цитоплазми. Кожен дослід проводять в 5-кратній повторності, загальна кількість інфузорій - не менше 100-150 особин. Якщо всі досліджувані концентрації препаратів викликають повну загибель інфузорій протягом двох діб, то дані лікарські засоби можна класифікувати як високотоксичні. До них належать ліки, які згідно класифікації шкідливих речовин при їх уведенні в шлунок щурів [6] відносяться до 1-го класу. Коли ж 100%-на летальність спостерігається тільки у 10-0,1, або 10-1%-их розчинах, то дані препа рати відносяться до середньотоксичних (2 і 3-ій класи токсичності на щурах). У випадку відсутності повної загибелі у жодному з вищевказаних розчинів протягом даного терміну препарат можна ідентифікува ти, як слаботоксичний (4-ий клас). Приклад 1. Для перевірки цього способу були підібрані лікарські засоби, що відносяться до різних фармакологічних груп та класів токсичності: бутокс (протипаразитарний засіб, 1 клас), аверсект (протипаразитарний засіб, 2 клас), дексатоманол, томанол (жарознижуючі, протизапальні анальгетики, 3 клас), лінкоміцин (антибіотик, 4 клас) (табл. 1). На прикладі даних ліків установлено, що спосіб визначення небезпечності препаратів на інфузоріях за результатами наступання загибелі протягом 48 год у вищезапропонованих концентраціях дає змогу класифікувати їх токсичність на щурах (табл. 2). Приклад 2. Для перевірки надійності цього способу з даними препаратами були проведені хронічні експерименти тривалістю до 30-ти діб. Для цього використовували концентрації, на 23 порядки слабші від мінімальної гостролетальної концентрації. Встановлено, що токсичність ліків у хронічному досліді, порівняно з гострим, не змінюється (табл. 3), що дозволяє обмежити експресвизначення токсичності за допомогою інфузорій 48-годинним терміном. Джерела інформації 1. Ветеринарные препараты / Под ред. А.Д. Третьякова. - М.: Агропромиздат, 1988. – 319 с. 2. Лозина-Лозинский Л.К., Быченкова В.Н. Реакции инфузории Colpoda maupasi на двуокись углерода // Вопр. экол. простейших. - Л.: Наука, 1978. - № 3. - С. 76-91. 3. ГОСТ 29136-91. Мука кормовая из рыбы, морских млекопитающих, ракообразных и беспозвоночных. Методы определения токсичности. - М.: Изд-во стандартов, 1992. 4. ГОСТ 13496.7-92. Зерно фуражное, продукты его переработки, комбикорма. Методы определения токсичности. - М.: Изд-во стандартов, 1992. 5. Голубкова Э.Г. Paramecium caudatum Ehrenberg как токсикологический тест-объект // Гидробиол. журн. - 1978. - 14, № 2. - С.95-99. 6. ГОСТ 12.1.007-76. Вредные вещества. Классификация и общие требования. - М.: Изд-во стандартов, 1976. - 16 с. 7. Розробити і освоїти наукову систему токсикологічного контролю вітчизняних та імпортних препаратів: Звіт про НДР (заключн.) / ДНДКІ ветпрепаратів. - № ДР УА 01002785 Р. - Львів, 1995. Таблиця 1 Токсичність досліджуваних препаратів на білих щурах* Препарат Аверсект Бутокс Дексатоманол Лінкоміцин Томанол LD50 при гострій інтоксикації, мг/кг 51,2 7,0 731,0 15645,0 1422,0 Клас токсичності 2 1 3 4 3 Примітка: * - дані лабораторії фармакологічних досліджень ДНДКІ ветпрепаратів [7]. 2 30232 Таблиця 2 Час загибелі 100% (ЛТ100) інфузорій під дією ліків у гострому досліді Концентрація, % 10 1 0,1 0,01 Бутокс (1) 1-2 сек 1-2 сек 10 хв 1 год Препарат (клас токсичності) Аверсект (2) Дексатоманол (3) Томанол (3) 0,5 год 0,5 год 10-20 сек 1 год 1 год 2 год 48 год 48 год в в в в Лінкоміцин (4) в в в Таблиця 3 Час загибелі 100% (ЛТІро) інфузорій під дією ліків у хронічному досліді Концентрація, % 10 1 0,1 0,01 0,001 0,0001 0,00001 Бутокс (1) 20 діб 29 діб в Препарат (клас токсичності) Аверсект (2) Дексатоманол (3) Томанол (3) 28 діб 28 діб 12 діб в в 29 діб Примітка: в - відсутність загибелі. __________________________________________________________ ДП "Український інститут промислової власності" (Укрпатент) Україна, 01133, Київ-133, бульв. Лесі Українки, 26 (044) 295-81-42, 295-61-97 __________________________________________________________ Підписано до друку ________ 2002 р. Формат 60х84 1/8. Обсяг ______ обл.-вид. арк. Тираж 35 прим. Зам._______ ____________________________________________________________ УкрІНТЕІ, 03680, Київ-39 МСП, вул. Горького, 180. (044) 268-25-22 ___________________________________________________________ 3 Лінкоміцин (4) 16 діб 23 доби 28 діб в