Спосіб визначення параметрів електропробою мембрани клітини за кривизною провідності

Спосіб визначення параметрів електропробою мембрани клітини за кривизною провідності, що включає розміщення досліджуваної клітини в 3 двома прямими. Потім обчислюють координати точки їх перетину, які і вважають значеннями параметрів електропробою мембрани клітини. Проте цей спосіб не забезпечує достатньої точності обчислення параметрів електропробою мембрани клітини. Це пояснюється особливістю лінійної апроксимації двома прямими такої істотно нелінійної функції, як провідність клітини в зростаючому імпульсному електричному полі. Згідно цьому способу, лінійна апроксимація двома прямими, що пересікаються, двох гілок цієї функції (до і після пробою) дає дещо зміщені координати точки передбачуваного електропробою, а саме, занижене значення провідності і завищене напруженості поля. Це відбувається тому, що точка перетину прямих при апроксимації часто лягає нижче і правіше за ту частину кривої провідності, де вона починає різко зростати, тобто там, де її кривизна максимальна. При малих швидкостях росту провідності клітини в області електропробою цим зсувом координат можна практично нехтувати, проте, при великих швидкостях росту провідності він стає особливо помітним і вже вимагає обліку. Крім того, в цих умовах внаслідок відсутності фіксації клітина часто починає або повертатися, або її виштовхують з між електродного простору реактивні сили, що виникають внаслідок витікання компонентів цитоплазми через електропоровану мембрану, тобто клітина втрачає нерухомість. Тим самим порушується геометрія експерименту або він просто стає неможливим. В основу корисної моделі поставлене завдання удосконалити спосіб визначення параметрів електропробою мембрани клітини шляхом введення її фіксації і нелінійного аналізу експериментальної залежності її провідності від напруженості поля. Поставлене завдання вирішується тим, що у відомому способі визначення параметрів електропробою мембрани клітини, що включає розміщення досліджуваної клітини в середовищі між електродами, подачу на них зростаючої імпульсної напруги, визначення залежності провідності клітини від напруженості поля і параметрів електропробою за її аналітичною апроксимацією, згідно корисної моделі, клітину злегка підтискають електродами, а апроксимацію провідності виконують поліномом непарного ступеня не нижче 5 і обчислюють його максимальну кривизну в точці, координати якої вважають значеннями параметрів електропробою. Суть корисної моделі пояснюється малюнком. На ньому зображені експериментальні точки залежностей провідності яйцеклітин (oоцитів) миші від напруженості імпульсного поля в 0,3М і 0,4М водних розчинах маніту при температурі 25°С. На обох залежностях приведені також відповідні криві апроксимуючих поліномів, які в позначених на графіку точках їх максимальної кривизни дають координати параметрів електропробою мембрани клітини при даній молярності розчину маніту. Заявлена корисна модель реалізується таким чином. Між електродами, зануреними в 30272 4 середовище, поміщають досліджувану клітину, наприклад, ооцит. Електроди злегка підтискають, тим самим фіксуючи клітину, і подають на них відому зростаючу імпульсну напругу. За виміряними значеннями напруги і струму через клітину розраховують її провідність. Потім проводять апроксимацію одержаної залежності провідності від напруженості поля поліномом непарного ступеня не нижче 5, наприклад, таким: G=a+bЕ+сЕ2+dE3+eE4+fE5 (1) де: G і Е - поточні змінні - провідність клітини і напруженість поля відповідно; а, b, с, d, e, і f- вільний член і коефіцієнти при ступенях Е відповідно. Можлива також апроксимація зворотним поліномом або поліномом вищого непарного ступеня залежно від необхідного критерію згоди модельної функції з експериментальними точками. Поліноми парного ступеня не використовують, оскільки вони не мають фізичного сенсу. Далі за відомою формулою диференціальної геометрії визначають кривизну одержаного полінома, як функцію напруженості поля: K= G' ' , 3 (2) é ' 2ù 2 ê1 + G ú ë û де: К - поточна кривизна полінома; G' і G" перша та друга похідні полінома відповідно. Потім проводять аналіз функції кривизни полінома на наявність максимуму, тобто виконують необхідну умову, яка вимагає, щоб перша похідна цієї функції дорівнювала нулю: К'=0. Розв'язуючи відповідне рівняння, одержують абсцису точки максимальної кривизни полінома, тобто напруженість поля, при якій починається необоротний пробій мембрани клітини. Підставляючи отримане значення напруженості пробою в початкове рівняння полінома, визначають значення провідності при пробої мембрани клітини. Обчислені значення координат вважають початком необоротного розриву мембрани, тобто параметрами її електропробою. Всі розрахунки ведуть за допомогою прикладних програм на комп'ютері. Приклад 1 Одержана експериментальна залежність провідності ооциту миші від напруженості поля в 0,4М маніті. Проведена апроксимація цієї залежності за рівнянням (1), але зворотним поліномом 5 ступеня: G-1=0,094-0,226E+0,313E2-0,204E3+0,061Е40,007E5 де G і E- поточні змінні - провідність клітини і напруженість поля відповідно. Критерієм згоди вибраної моделі апроксимації з експериментом взято коефіцієнт детермінації, що склав R=0,994. Далі за формулою (2) одержано рівняння функції кривизни полінома, потім узята перша похідна функції кривизни і обчислені корні відповідного рівняння. Серед всіх коренів цього рівняння вибраний один позитивний і найбільший, що є першим параметром пробою - напруженість поля. її підставляють в початковий поліном і отримують ( ) 5 значення другого параметра пробою - провідність. Таким чином, обчислені параметри електропробою мембрани ооциту миші в 0,4М маніті: напруженість поля E0,4=2,92кВ/см, провідність у момент розриву мембрани G0,4=76,34мкСм/см. Приклад 2 Одержана експериментальна залежність провідності ооциту миші від напруженості поля в 0,3М маніті. Проведена апроксимація цієї залежності поліномом 7 ступеня: G=-47+888E-3348E2+6445E3-6792E4+3965E51202E6+148E7 де G і Е - мають той же сенс, що і в прикладі 1. Коефіцієнт детермінації експеримент - модель для цього рівняння склав R2=0,997. Далі проведені аналогічні обчислення координат (Е0,3, G0,3) точки максимальної кривизни полінома, які виконуються за таким же принципом, як і в прикладі 1. Отримані наступні значення параметрів електропробою мембрани ооциту миші в 0,3М маніті: напруженість поля E0,3=2,03кВ/см, провідність у момент розриву мембрани G0,3=67,94мкСм/см. Таким чином, ці приклади показують, що запропонований спосіб дозволяє точно, відповідно до вибраної моделі поліноміальної апроксимації, обчислювати параметри електропробою мембрани клітини. Перевага заявленого способу полягає у тому, що на відміну від прототипу він не вимагає попереднього умовного розбиття експериментальної нелінійної залежності на дві гілки за характером зростання (слабке і різке зростання провідності) для того, щоб провести апроксимацію. Застосування запропонованого способу можливе безпосередньо до таблиці експериментальних даних без будь-яких попередніх припущень про місцезнаходження точки необоротного електропробою, тобто всліпу. До того ж заявлений спосіб забезпечує надійну фіксацію клітини шляхом легкого стискання її між електродами, що виявляється достатнім для компенсації виштовхуючих реактивних сил, які виникають при витіканні цитоплазми в результаті сильної електропорації мембрани в області пробою. Крім того, заявлений спосіб є універсальним підходом до аналізу експериментальних нелінійних кривих на предмет пошуку координат точок різкої зміни швидкості росту (падіння) функції при рівномірному зростанні аргументу. 30272 6