Спосіб фармакокорекції ішемічних пошкоджень головного мозку в умовах моделювання гострого порушення мозкового кровообігу

Спосіб фармакокорекції ішемічних пошкоджень головного мозку в умовах моделювання гострого порушення мозкового кровообігу, що включає призначення лабораторним тваринам пептидного фрагменту, який відрізняється тим, що як пептидний фрагмент призначають (4-[оксо-3(4Н)-хіназолін]) бензойні кислоти у дозі 10 мг/кг. Корисна модель стосується медицини, а саме експериментальної медицини, нейрофармакології, патофізіології, і може бути використаною у лікуванні ішемічного пошкодження головного мозку в експерименті. У теперішній час для лікування захворювань ЦНС широко застосовується препарат Семакс, який є пептидним фрагментом молекули адренокортикотропного гормону. Проте Семакс не повністю відповідає сучасним вимогам: необхідність великих доз, недостатня церебропротективна та антиоксидантна активність. Крім того, Семакс не впливає суттєво на энергетичний метаболізм у нервовій тканині при ішемії, а також на процеси гіперекспресії генів раннього реагування, що ведуть до активації процесів апоптичної загибелі нейрональної клітини. Крім того, семакс не має суттєвого впливу на мозковий кровообіг. В комплексному лікуванні ішемічних пошкоджень головного мозку необхідно враховувати, що в результаті зниження мозгового кровотоку відбувається порушення функції дихального ланцюга мітохондрій та енергетичного обміну, глутаматна "ексайтотоксичність", порушення іонного гомеостазу клітини з підвищенням внутрішньоклітинного вмісту іонів кальцію, лактатацидоз, активація внутрішньоклітинних ферментів, підвищення синтезу N0, розвиток оксидативного стресу, гіперекспресія генів раннього реагування, аноксична деполяризація мембран та загибель клітини. Вищезазначене обґрунтовує доцільність створення препарату, який поєднує у собі високу антиоксидантну і церебропротективну активність. Найбільш близьким за технічною сутністю та результатом, що досягається, є спосіб, який полягає у призначенні щурам лінії Вістар з експериментальним пошкодженням головного мозку на протязі 18 діб пептидного фрагмента Семаксу у дозі 300 мг/кг внутрішньочеревне 1 раз на добу (Гусев Е.И., Скворцова В.И. Ишемия головного мозга. - М.: Медицина, 2001.- С. - 248276). Спільними суттєвими ознаками прототипу і корисної моделі, що заявляється, є такі: - призначення пептидного фрагменту Цей спосіб є недостатньо ефективним, тому що семакс не в повному обсязі відповідає сучасним вимогам: необхідність великих доз, недостатня це-ребропротективна та антиоксидантна активність. Так, в умовах експерименту призначення семаксу (300мг/кг) (19) UA (11) 30534 (13) U (21) u200713517 (22) 03.12.2007 (24) 25.02.2008 (72) ПАВЛОВ СЕРГІЙ ВАСИЛЬОВИЧ, UA, БЄЛЕНІЧЕВ ІГОР ФЕДОРОВИЧ, UA, ШАБЕЛЬНИК КОСТЯНТИН ПЕТРОВИЧ, UA, ХОДАКОВСЬКИЙ АЛЕКСІЙ АНДРІЙОВИЧ, UA, КОВАЛЕНКО СЕРГІЙ ІВАНОВИЧ, UA, АБРАМОВ АНДРІЙ ВОЛОДИМИРОВИЧ, UA, СТЕПАНЮК АЛЛА ГЕОРГІЇВНА, UA, БУХТІЯРОВА НІНА ВІКТОРІВНА, UA (73) ЗАПОРІЗЬКИЙ ДЕРЖАВНИЙ МЕДИЧНИЙ УНІВЕРСИТЕТ, UA, ПАВЛОВ СЕРГІЙ ВАСИЛЬОВИЧ, UA, БЄЛЕНІЧЕВ ІГОР ФЕДОРОВИЧ, UA, ШАБЕЛЬНИК КОСТЯНТИН 3 внутрішньочеревно призводить до зменшення неврологічного дефіциту на 18 добу лише у 30% тварин з ГПМК. Семакс суттєво не впливає на процеси окислювальної модифікації білків (0МБ) в головному мозку, зменшуючи кількість найбільш нейротоксичного продукту OМБ кетонфенілгідразину (КФГ) на 12% по відношенню до контрольної групи тварин. Крім того, Семакс не чинить суттєвого впливу на енергетичний метаболізм в нервовій тканині при ішемії, а також на процеси гіперекспресії генів раннього реагування c-fos, що ведуть до активації апоптичної загибелі нервової клітини. Важливо зазначити, що Семакс не має суттєвого впливу на мозковий кровообіг. В основу корисної моделі поставлено задачу вдосконалення способу лікування ішемічного пошкодження головного мозку в експерименті шляхом призначення іншого пептидного фрагмента, що забезпечить зменшення дози препарату та підвищення ефективності лікування. Поставлена задача вирішується тим, що у способі фармакокорекції ішемічних пошкоджень головного мозку в умовах моделювання гострого порушення мозкового кровообігу, який включає призначення лабораторним тваринам пептидного фрагменту новим є те, що як пептидний фрагмент призначають (4-[оксо-3(4Н)-хіназолін] бензойної кислоти з лабораторним шифром ПК 66 у дозі 10мг/кг. Причинно-наслідковий зв'язок між сукупністю ознак, що заявляються, та технічним результатом полягає у такому. Спостереженнями на 18 добу після моделювання гострого порушення мозкового кровообігу (ГПМК) було виявлено, що введення ПК 66 в 3 рази зменшило процент тварин с тяжкою симптоматикою у порівнянні з контрольною групою на ті ж строки спостереження, і середній бал по шкалі С.Р. McGrow склав усього 2,2 супроти 6,5 у контрольній групі. Введення ПК 66 зменшувало і явища когнітивного дефіциту після ГПМК. Так, латентний період умовної реакції пасивного по бігання (УРПП) у щурів, що отримували ПК 66 був у 3,4 рази вище, ніж у контрольній групі, а кількість повністю навчених тварин була на 68% вища, порівняно з контрольною групою. Призначення сполуки ПК66 знижувало явища енергодефіциту у тканинах мозку, що виражалося посиленням синтезу АТФ за рахунок активації аеробного шляху окислення. Варто зазначити, що рівень АТФ підвищувався на фоні зниження АМФ, що є прооксидантом. Важливим моментом в нейропротективній дії ПК 66 є її антиоксидантна дія, яка виражалася у значному зниженні КФГ у головному мозку більше ніж на 65%; а також у позитивному впливу на АО систему головного мозку, підвищуючи активність каталази та супероксиддисмутази у середньому на 55 и 67% відповідно. Другою ланкою нейропротективної дії ПК 66 є її здатність в умовах ГПМК знижувати гіперекспресію генів раннього реагування c-fos. Призначення ПК 66 призводило до зниження більше ніж на 60% кількості c-fos- позитивних 30534 4 нейронів в СА1- зоні гіпокампу. За рахунок пригнічення експресії генів раннього реагування cfos сполука ПК 66 здатна в деякій мірі впливати на процеси апоптичної загибелі нейронів, що проявлялося у збільшенні вмісту антиапоптичного bcl-2 білка в СА1- зоні гіпокампу на 158% у порівнянні з тваринами контрольної групи. Нейропротективний ефект ПК 66 в умовах моделювання ГПМК підтвердився і при морфогістохімічних дослідженнях СА1 зони гіпокампу. Призначення ПК 66 протягом 18 діб призводило до збільшення щільності нейроцитів на 13% відносно групи тварин з ГПМК, а також підвищувало індекс нейронів, що вижили на 87%. Призначення ПК 66 тваринам з ГПМК призводило до підвищення загальної швидкості мозгового кровотоку. Стимулююча дія ПК 66 була досить помітна починаючи з 4 доби відтворення ГПМК і складала у середньому 74% відносно фонового показника. Таким чином, сукупність вищезазначених позитивних впливів дозволить підвищити ефективність лікування ішемічних пошкоджень головного мозку в експерименті, а також знизити кількість побічних ефектів. Спосіб здійснюють таким чином: на протязі 18 діб 1 раз на добу щурам з ГПМК внутрішньочеревне вводять сполуку (4-[оксо3(4Н)-хіназолін] бензойну кислоту на фізіологічному розчині об'ємом 2мл із розрахунку 10мг/кг маси тіла. Приклад 1 Вплив ПК 66 на розвиток неврологічного дефіциту у тварин з моделювання ОПМК Призначення сполуки ПК 66 у дозі 10 мг/кг внутрішньочеревне щурам з ГПМК мало виражений нейропротективний ефект. Так, на 4 добу експерименту середній бал по шкалі С.Р. McGrow у групі тварин з введенням ПК 66 складав 12,4, летальність зменшувалась на 40% у порівнянні з контролем. Семакс по силі нейропротективного ефекту поступався ПК 66 (табл. № 1) Вплив ПК 66 та семакса на виживання та розвиток неврологічно після відтворення ГПМК Групи тварин Інтактні тварини Тварини з ГПМК (контроль) (n=20) Тварини 3 ГПМК+ПК 66(10мг/кг) (n=20) Тварини з ГПМК+ Семакс (300 мг/кг) (n=20) Кількість щурів з важкою симптоматикою, % На 4 добу На 18 добу 0 0 100 50 100 13,0** 100 30* Примітка: * - р£0,05 по відношенню до контролю; ** - р£0,05 по відношенню до Семаксу. Уведення ПК 66 зменшувало і явища Серед На 4 0 18,3± 12,4± 15,3± 5 когнітивного дефіциту після ГПМК. Так латентний період УРПП у щурів, які отримали ПК 66 був у 3,4 рази вище, ніж у контрольній групі, а кількість повністю навчених тварин була на 68% вища, у порівнянні з контрольною групою. Семакс також суттєво впливав на зменшення вираженості неврологічного та когнітивного дефіциту, але при цьому поступався по силі ефекту ПК 66. Приклад 2 Вплив ПК 66 на біоенергетику головного мозку; стан антиоксидантної системи; експресію генів раннього реагування, а також на морфофункціональний стан нейронів СА 1 зони гіпокампу у щурів з моделюванням ГПМК Призначення експериментальним тваринам ПК 66 (10мг/кг) на 18 добу призводило до зменшення ступеню вираженості енергодефіциту за рахунок інтенсифікації окисної продукції АТФ, підсилюючи активність дикарбонової ланки циклу Кребса (малат на 100%); знижувало «витрату» інтермедіатів ГАМК - шунта в енергообміні підвищувало концентрацію гальмівних амінокислот (ГАМК на 61%), зменшувало активність анаеробного гліколізу та розвиток лактат - ацидозу в головному мозку тварин з церебральною ішемією (лактат на 114%; цитохром -С-оксидаза на 131%). Іншою ланкою нейропротективної дії сполуки ПК 66 є її висока антиоксидантна активність. Призначення ПК 66 призводить до підвищення активності КАТ і СОД. ПК 66 за своїм впливом на дані показники перевищував активність семакса більш ніж на 30%. Захисний ефект ПК 66 в умовах гострого порушення мозкового кровообігу проявлявся позитивним впливом на процеси окисної деструкції білків. Встановлено, що курсове призначення ПК 66 знижувало концентрацію АФГ і КФГ у тканинах головного мозку. При спонтанній 0МБ вміст АФГ і КФГ знижувався на 1,7 і 1,5 рази; при стимульованій - на 3 та 2 рази, статистичне достовірно (р £ 0,05) перевищуючи показники Семакса. Важливим компонентом у механізмі антиоксидантної дії ПК 66 є її вплив на процеси окисної модифікації нуклеїнових кислот. Введення ПК 66 і семакса знижувало концентрацію 8-OHG у сечі в середньому на 33% та 20%, при цьому сполука ПК 66 статистичне достовірно (р£0,05) перевищувала показник Семакса. В умовах ГПМК однією з перших реакцій геному є індукція генів раннього реагування - c-fos. Білок c-fos як прямо, так і опосередковано бере участь у процесі фрагментації ДНК та ініціюванні процесів апоптичної загибелі нейрональної клітини. Призначення тваринам з ГПМК досліджуваної сполуки призводило до достовірного зниження (р £ 0,01) кількості Fosпозитивних нейронів у зоні СА1 гіпокампа більш, ніж на 61%. Менш активним виявився Семакс, знижуючи кількість Fos-позитивних нейронів на 25% стосовно контрольної групи тварин. За рахунок пригнічення експресії генів раннього реагування c-fos сполука ПК 66 і Семакс, здатні деякою мірою впливати на процеси апоптичної загибелі нейрональної клітини, здійснюючи тим самим, свою церебропротективну дію. Так, введення ПК 66 збільшувало кількість 30534 6 антиапоптичного білка bcl-2 у зоні СА1 зони гіппокампа в порівнянні з контрольною групою тварин (р£0,01) і статистичне достовірно (р£0,01) перевищуючи показники Семакса (рис. 2). Церебропротективна дія ПК 66 підтвердилася при морфологічних дослідженнях нейронів СА1 зони гіппокампа тварин з ГПМК. ПК 66 демонструвало церебропротективний ефект збільшенням щільності нейроцитів на 13%, відносно групи тварин з ГПМК Крім цього, призначення ПК 66 призводило не тільки до відновлення площі тіл нейронів, але й до перевищення даного показника на 8% у порівнянні з показниками інтактної групи. Позитивна дія ПК 66 проявлялася в підвищенні вмісту РНК у клітинах, повністю відновлюючи її концентрацію (табл. 2). Семакс за своїм впливом на досліджувані показники виявився менш ефективним. Важливим показником ефективності досліджуваних препаратів є індекс відношення кількості нейронів, що вижили, до числа апоптичних і деструктивно змінених. Призначення ПК 66 підвищувало індекс нейронів, що вижили, на 87% (табл. 2). Вплив семакса та ПК 66 на морфофункціональні показники нейрон ГПМК Досліджувані показники Щільність нейронів (клітин/мм2) Площа нейронів (мкм2) Вміст РНК(Еоп) Щільність апоптичних та деструктивно змінених нейронів (1мм2) Індекс кількості загиблих та виживших нейронів (1мм2) Інтактні тварини Контроль (ГПМК) 1211±18 800±20 143,2±4,1 111,2±0,7 14,8±0,78 110±5,6 10,5±0,12 160±6,5 14,5±1,2 6±1,2 Примітки: 1. *- р£0,01 відносно контролю; 2. ** - р£0,01 відносно Семаксу. Г