Спосіб отримання білкових компонентів плазми крові

Спосіб отримання білкових компонентів плазми крові, при якому після хроматографічної очистки з антивірусною обробкою детергентами і подальшим їх вилученням отримують альбумін, імуно 30651 вість отримати ширший спектр білкових компонентів. Поставлене завдання вирішується тим, що в способі отримання білкових компонентів плазми крові, при якому після хроматографічної очистки з антивірусною обробкою детергентами і подальшим їх вилученням, отримують альбумін, імуноглобулін-G та фактори коагуляції VIII і IX, згідно з винаходом антивірусній обробці попередньо піддають початкову плазму крові, хроматографічну очистку проводять поєднанням іонообмінної, афінної, гель-хроматографії та підбором хроматографічних елюентів і носіїв, використовуючи при цьому побічні фракції плазми і отримуючи додатково імуноглобуліни класів ІgА і IgM, фактор Віллебранда, антитромбін-ІІІ, фібронектин, фібриноген і альфа-1-антитрипсин. При цьому детергенти, що використовують для антивірусної обробки плазми, на кожному етапі хроматографічної очистки виходять у вільному об'ємі. Антивір усна обробка початкової плазми крові, а не кожної фракції, що отримують, заощаджує на дорогих детергентах, тому що їх використовують лише один раз, а не для кожної фракції плазми. Для вилучення детергентів після антивірусної обробки плазми не потрібні додаткові етапи хроматографічної очистки через те, що у кожному етапі хроматографічної очистки детергенти виходять у вільному об'ємі, що теж робить даний спосіб економічнішим. А поєднання різних прийомів хроматографічної очистки, підбір хроматографічних елюентів і носіїв при використанні побічних білкових фракцій плазми дозволяє отримати одинадцять білкових компонентів плазми. Суть винаходу полягає в наступному. Плазму відразу ж після забору для зменшення ризику передачі СНІД, гепатитів та інших вірусних інфекцій піддають антивірусній обробці додаванням трибутилфосфату та детергенту-тритон у Х100 або твіну-80 до концентрації 0,35% та 0,2% відповідно і витримують протягом 30 хв. при постійному перемішуванні та температурі +4°С. Після цього плазму заморожують у рефрижераторах і зберігають до трьох місяців при температурі -20°С. Етап 1. Отримання фактору коагуляції VIII, фібронектину Для отримання білкових компонентів плазму розморожують при температури +4°С, центрифугують при цій же температурі та 3000 об/хв. Осадкріопреципітату, що отримують, використовують для виділення фактора коагуляції VIII, фібриногену, фібронектину та фактору Віллебранда. Використовуючи іонообмінну хроматографію, кріо- преципітат розчиняють в 0,025 М цитратному буфері рН 7,0 до кінцевої концентрації по білку 2%, наносять на колонку з ДЕАЕ-фрактогелем. Фракцію, що ви ходить у вільному об'ємі та являє собою раніше додані детергенти, які використовує для антивірусної обробки, відкидають. Потім проводять елюцію фактора коагуляції VIII, промиваючи колонку цитратним буфером з рН 4,5. Фракція, яка містить фактор коагуляції VIII, при цьому ви ходить першою. Другою та третьою фракціями з цієї колонки виходять побічні компоненти, які збирають, і вони містять фібронектин, фібриноген, фактор Віллебранда. Використовуючи а фінну хроматографію на основі гепарін-сефарози CL-6B, після нанесення на колонку вище вказаних фракцій та елюції їх цитратним буфером, рН 6,5, отримують фракцію, яка містить фібриноген (друга) і ви ходить першою. Третю фракцію з колонки ДЕАЕ-фрактогель наносять знову на колонку з ДЕАЕ-фрактогелем. Після промивання колонки першу-побічну фракцію відкидають, збирають другу і наносять на колонку з желатин-сефарозою. При промивці колонки цитратним буфером, рН 6,5, отримують фракцію фібронектину (перша фракція) та фактора Віллебранда (друга фракція). Етап 2. Отримання фактора коагуляції IX Фракцію (надосадкову рідину), позбавлену фактора коагуляції VIII, фібриногену, фібронектину та фактора Віллебранда, в реакторі змішують з ДЕАЕ-седафаксом А-50, в слабкому цитратному буфері (0,025 М). Комплекс фактора коагуляції IX знімають з носія цим же цитратним буфером, в складі якого є 0,5 М хлористий натрій. Побічну фракцію плазми, після вилучення фактору коагуляції IX, використовують для отримання інших компонентів. Наступна очистка фактора коагуляції ІХ-адсорбція на колонці з іонообміником ДЕАЕсефарозою FF та елюція зв'язанного білка цитратним буфером з рН 4,5. Після промивки колонки з ДЕАЕ-сефадексом А-50 для вилучення фактора коагуляції IX побічну фракцію, яка має в своєму складі імуноглобуліни, альбумін, АТ-III, використовують для отримання вказаних препаратів. Етап 3. Отримання альбуміну Побічну фракцію, отриману на етапі 2, використовують для отримання альбуміну. Для цього, використовуючи гель-хроматографію, проводять її обезсолювання на колонці з сефадексом G-25 в натрій ацетатному буфері 0,025 М, рН 4,5. Зібраний матеріал після елюції доводять до рН 5,2 М оцтовою кислотою при перемішуванні, центрифугують, осад збирають для отримання інших білкових компонентів. Після цього проводять іонообмінну хромотографію на ДЕАЕ-се фарозі FF. Ма теріал наносять на колонку з цим носієм. Альбумін та інші присутні білки зв'язуються з цим іонообмінником, в той час як імуноглобуліни вимиваються з колонки у вільному об'ємі. Після промивки колонки натрій-ацетатним буфером, рН 5,5, фракцію, багату альбуміном, збирають. Наступною промивкою колонки цим же буфером з рН 4,0 отримують білки, зв'язані з носієм, які багаті альфа-І-антитрипсином та антитромбіномІІІ. Цю фракцію збирають для подальшого очищення цих білків. Етап 4. Отримання імуноглобулінів класів IgG, IgA, Ig M Фракцію, яка вийшла з колонки на ДЕАЕсефарозі FF в вільному об'ємі (етап 3), багату імуноглобулінами, доводять до рН 7,0 розчином ІМ NaOH, наносять на колонку з СМ-сефарозою FF. При прокачуванні розчину хлористого натрію та гліцину з рН 9,0, отримують фракцію IgG. Подальша промивка колонки цим же буфером з рН 7,5 дозволяє отримати IgA; з рН 4,5-IgM. 2 30651 Етап 5. Отримання альфа-І-антитрипсину та антитромбіну-ІІІ Фракцію, багату альфа-І-антитрипсином та антитромбіном-ІІІ, отриману промивкою колонки буфером з рН 4,0 (етап 3), наносять на колонку, наповнену ДЕАЕ-се фарозою GL 6В. Промиваючи колонку натрій-ацетатним буфером, рН 4,5, отримуємо фракцію альфа-1-антитрипсину. Подальша промивка колонки цим же буфером з рН 6,0 дозволяє отримати антитромбін-ІІІ. Детергенти, які використовують для антивірусної обробки у кожному етапі хроматографії, ви ходять у вільному об'ємі та відкидаються. Спосіб дозволяє отримати одинадцять білкових компонентів плазми з антивірусною обробкою: фактор коагуляції VIII, фібронектин, фібриноген, фактор Віллебранда, фактор коагуляції IX, імуноглобуліни - IgG, Ig A, Ig M, альфа-1-антитрипсин, антитромбін-ІІІ, альбумін. __________________________________________________________ ДП "Український інститут промислової власності" (Укрпатент) Україна, 01133, Київ-133, бульв. Лесі Українки, 26 (044) 295-81-42, 295-61-97 __________________________________________________________ Підписано до друку ________ 2002 р. Формат 60х84 1/8. Обсяг ______ обл.-вид. арк. Тираж 50 прим. Зам._______ ____________________________________________________________ УкрІНТЕІ, 03680, Київ-39 МСП, вул. Горького, 180. (044) 268-25-22 ___________________________________________________________ 3