Спосіб визначення загальної антиоксидантної активності плазми (сироватки) крові

Корисна модель відноситься до галузі біології і медицини, і може бути використаний при клінічних діагностичних та наукових дослідженнях, а також при використанні експериментальних науково-дослідних робіт. Розроблено спосіб визначення загальної антиоксидантної активності плазми (сироватки) крові. Він заснований на гальмуванні плазмою (сироваткою) крові пероксидного окиснення ліпідів головного мозку щурів і характеризується простотою виконання, доступністю реактивів і доброю відтворюваністю. На сьогодні не викликає сумніву той факт, що виникнення і розвиток широкого кола захворювань людини і тварин супроводжується активацією вільнорадикальних реакцій пероксидного окиснення ліпідів та окисної модифікації білків [1, 2, 3]. Основними механізмами активації таких реакцій є значне збільшення генерації радикалів кисню, так званих активних форм кисню (АФК) - супероксидного аніонрадикалу (О2), гідроксильного радикалу (ОН), синглетного кисню (1О2), пероксиду водню (Н2О2), гіпохлоританіону (СlO) тощо, а також вивільнення іонів заліза (Fe2+) із його клітинних депо. Процесу запуску і розвитку вільнорадикальних реакцій протистоять антиоксиданти. Основні антиоксиданти плазми крові та механізм їх дії подано в табл. 1 (2, 4) з подальшим доповненням. Антиоксидантні компоненти плазми (сироватки) крові теоретично можуть бути визначені шляхом вимірювання їх кількості чи активності (для ферментів). Одначе на практиці це виявилось неможливим із-за трудомістких аналізів і синергізму дії різних антиоксидантів. У зв'язку з цим впродовж останніх 35-40 років розробляються методики для визначення сумарної антиоксидантної активності інгібіторів вільнорадикальних реакцій, які присутні в біологічних рідинах (сироватка крові, слина, сльози, ліквор тощо), гомогенатах органів і тканин, суспензіях мембран і ліпопротеїнів. Люба методика визначення антиоксидантної активності (АОА) в біологічних рідинах заснована на використанні модельної системи, яка включає як мінімум два компоненти: механізм утворення (генерації) певного виду вільних радикалів і систему їх виявлення (детекції) безпосередньо чи продуктів їх дії на ліпіди, білки і нуклеїнові кислоти. Безпосереднє визначення АФК вимагає складної і дорогої апаратури (хемілюмінесценція, електрохемілюмінесценція, флюоресценція, полярографія, циклічна вольтметрія, манометрія, спектрофотометрія), яка на сьогодні є недоступною для більшості лабораторій України. Нами розроблений метод визначення сумарної антиоксидантної активності плазми (сироватки) крові, який характеризується простотою виконання, доступністю реактивів і доброю відтворюваністю. Принцип методу. Гомогенати головного мозку щурів, які характеризуються найбільшим вмістом ліпідів, піддаються спонтанному пероксидному окисненю з утворенням одного із кінцевих продуктів - малонового альдегіду (МА). По кількості утвореного МА судили про загальну (сумарну) антиоксидантну активність плазми (сироватки) крові. Хід виконання. На льду готується 5%-ний гомогенат головного мозку щура (в дослідах використовували тварин масою 180±15г) на трис-НСl-буфері, рН 7,4 (500мг мозку гомогенізували у 9,5мл буферу), центрифугували 10хв при 3000об/хв. Одержаний центрифугат (2мл) вносили в центрифужні пробірки об'ємом 10мл. В дослідні проби добавляли 0,1мл сироватки (плазми) крові, а в контрольні - 0,1мл буферу. Проби інкубували 60хв у водяному термостаті при 37°С після чого реакцію зупиняли, вносячи в проби по 2мл охолодженої 10%-ної трихлороцтової кислоти. Проби центрифугували (10хв при 3000об/хв) і в одержаному центрифугаті визначали вміст МА. Для цього в хімічні пробірки вносили 3мл центрифугату, 1мл 0,8%-ної тіобарбітурової кислоти і ставили в кип'ячу водяну баню на 15хв. Після охолодження вимірювали оптичну густину контрольних і дослідних проб на спектрофотометрі СФ-46 при 532нм в 10мм кварцових кюветах. Загальну антиоксидантну активність (ЗАОА) виражали в процентах і розраховували за формулою: де Дк - оптична густина контрольної проби; Дd - оптична густина дослідної проби. Проведені дослідження показали, що максимальна антиоксидантна дія має місце при використанні 0,1мл сироватки (плазми) крові. Нами вивчено вплив часу (тривалості) інкубації на величину антиоксидантної дії (табл. 2). Як витікає із даних табл. 2 максимальна антиоксидантна активність плазми крові щурів, вираженої в процентах гальмування спонтанного пероксидного окиснення ендогенних ліпідів головного мозку, спостерігається на 60хв. інкубації. Висновок. Розроблено метод визначення загальної антиоксидантної активності плазми (сироватки) крові. Він заснований на гальмуванні плазмою (сироваткою) крові пероксидного окиснення ліпідів головного мозку щурів і характеризується простотою виконання, доступністю реактивів і доброю відтворюваністю та подальших дослідженнях вивчення стану загальної антиоксидантної активності плазми (сироватки) крові при різноманітних захворюваннях, а також проведення скринінгових досліджень оригінальних речовин з метою виявлення серед них антиоксидантів. Література 1. Каримов І.З. Окисна модифікація білків і перекисне окиснення ліпідів у розвитку метаболітичної інтоксикації при патології //Лаб.діагностика. - 2005. - №1 (31). - С.7-13. 2. Ме щишен І.Ф., Пішак В.П., Григор'єва Н.П. Основи обміну речовин та енергії. Навчальний посібник. Чернівці: Медуніверситет, 2005. - 192с. 3. Ме щишен І.Ф., Польовий В.П. Ме ханізм окиснювальної модифікації білків //Буковинський мед.вісник. - 1999. - Т.3З, №1.-С.196-205. 4.Colleen S., Marks A.D., Lieberman M. Basic Medical Biochemistry. A clinical approach. - Lippincott Williams and Wilkins, USA, 2005. - 977p. Мета корисної моделі. Охарактеризувати спосіб визначення загальної антиоксидантної активності плазми (сироватки) крові. Поставлена мета досягається тим, що гомогенати головного мозку щурів, які характеризуються найбільшим вмістом ліпідів, піддаються спонтанному пероксидному окисненю з утворенням одного із кінцевих продуктів малонового альдегіду (МА). По кількості утвореного МА судили про загальну (сумарну) антиоксидантну активність плазми (сироватки) крові. Технічне рішення: на льду готується 5%-ний гомогенат головного мозку щура (в дослідах використовували тварин масою 180±15г) на трис-НСl-буфері, рН 7,4 (500мг мозку гомогенізували у 9,5мл буферу), центрифугували 10хв при 3000об/хв. Одержаний центрифугат (2мл) вносили в центрифужні пробірки об'ємом 10мл. В дослідні проби добавляли 0,1мл сироватки (плазми) крові, а в контрольні - 0,1мл буферу. Проби інкубували 60хв у водяному термостаті при 37°С після чого реакцію зупиняли, вносячи в проби по 2мл охолодженої 10%-ної трихлороцтової кислоти. Проби центрифугували (10хв при 3000об/хв) і в одержаному центрифугаті визначали вміст МА. Для цього в хімічні пробірки вносили 3мл центрифугату, 1мл 0,8%-ної тіобарбітурової кислоти і ставили в кип'ячу водяну баню на 15хв. Після охолодження вимірювали оптичну густину контрольних і дослідних проб на спектрофотометрі СФ-46 при 532нм в 10мм кварцових кюветах. Суть даного способу заключається в тому, що спосіб визначення загальної антиоксидантної активності плазми (сироватки) крові. Розроблено спосіб визначення загальної антиоксидантної активності плазми (сироватки) крові. Він заснований на гальмуванні плазмою (сироваткою) крові пероксидного окиснення ліпідів головного мозку щурів і характеризується простотою виконання, доступністю реактивів і доброю відтворюваністю та подальших дослідженнях вивчення стану загальної антиоксидантної активності плазми (сироватки) крові при різноманітних захворюваннях, а також проведення скринінгових досліджень оригінальних речовин з метою виявлення серед них антиоксидантів. Висновок Спосіб визначення загальної антиоксидантної активності плазми (сироватки) крові розроблено завдяки визначенню загальної антиоксидантної активності плазми (сироватки) крові. Спосіб заснований на гальмуванні плазмою (сироваткою) крові пероксидного окиснення ліпідів головного мозку щурів і характеризується простотою виконання, доступністю реактивів і доброю відтворюваністю. Відповідність критерію "новизна" даного способу відрізняється тим, що вперше досліджені гомогенати головного мозку щурів, які характеризуються найбільшим вмістом ліпідів, піддаються спонтанному пероксидному окисненю з утворенням одного із кінцевих продуктів - малеїнового альдегіду (МА). По кількості утвореного МА судили про загальну (сумарну) антиоксидантну активність плазми (сироватки) крові. Відповідність критерію "суттєві відмінності" даного способу забезпечується тим, що аналогів немає. Відповідність даного винаходу критерію "позитивний ефект" забезпечується результатами клінічних та експериментальтних досліджень, які вперше засвідчують визначення загальної антиоксидантної активності плазми (сироватки) крові. Він заснований на гальмуванні плазмою (сироваткою) крові пероксидного окиснення ліпідів головного мозку щурів і характеризується простотою виконання, доступністю реактивів і доброю відтворюваністю.