Спосіб визначення карбонільних сполук в білках сироватки крові

Спосіб визначення карбонільних сполук у білках сироватки крові, що включає додавання до проби білка розчину 2,4-динітро-фенілпдразину на розчині соляної кислоти і трихлороцтової кислоти, центрифугування, промивання трихлороцтовою кислотою, фотометрію, який відрізняється тим, що визначення пдразонів карбонільних сполук проводять по аці-формі в лужному середовищі 5% NaOH Запропонований спосіб відноситься до медицини, зокрема лабораторної техніки Способи визначення карбонільних сполук у білках сироватки крові ВІДОМІ (див Refsgoard Н Н F, Tsai L, Stadtman E R \\ Modification of proteins by polyunsaturated fatty acid peroxydation products Biochemistry - 2000 - V97, N 2, P 611-616) Згідно цього способу до проби білка додають 10тМ розчину 2,4-динітрофенілпдразину на 2N розчині соляної кислоти, суміш витримують протягом 10 хвилин при кімнатній температурі, потім додають трихлороцтову кислоту, центрифугують, промивають осад трихлороцтовою кислотою і суспендують його в суміші етанол-етил ацетат (1 1об) Забарвлені жовті пдразони [Е=22000л/(М см)] карбонільних сполук білків фотометрують при довжині хвилі 370нм, відносно контролю на реактиви, де пробу білка обробляють таким же чином, але не додають розчин 2,4-динітрофенілпдразину Недоліком способу являється опалесценція внаслідок денатурації білка, яка дає завищені результати його вмісту і недостатня чутливість методу такого способу, який підвищує точність визначення і збільшує його чутливість Така задача забезпечується тим, що визначення пдразонів карбонільних сполук проводять по аці-формі в лужному середовищі 5% NaOH Як показали наші дослідження, застосування способу, що попереджує опалесценцію, сприяє підвищенню точності визначення карбонільних сполук і збільшенню чутливості До 0,1мл проби сироватки крові поступово додають 0,5мл 0,5 N розчину НСІ, 0,2мл 0,2% розчину 2,4-динітрофенілпдразину на 0,8 N НСІ Суміш шкубують 10 хвилин при 20° і осаджують білки 0,3мл 10% ССІзСООН Потім проводять центрифугування на протязі 10 хвилин при 3000 обертів за хвилину Отриманий осад білків промивають 1,0мл 5% ССІзСООН, вдруге центрифугують 10 хвилин при 3000об/хв і знову промивають його 1,0мл 5% ССІзСООН Після відокремлення осаду білків додають 1мл 0,9% розчину NaCI та 1мл 5% розчину NaOH і через 20 хвилин фотометрують при 490нм у кюветі 0,5см В основу винаходу способу визначення карбонільних сполук поставлена задача розробки Порівняльні дані, отримані по способупрототипу і запропонованому способу, представлені втабл 1 00 ю 58110 Таблиця 1 Вміст карбонільних сполук в білках сироватки крові N проби Оптична густина С, мкг пірувата/мг білка БСА Олайне БСА Ставрополь БСА Lachema желатина казеїн AD2 С1 С2 0,025 0,092 0,163 0,156 0,164 0,124 0,122 *0,055 *0,035 *0,041 *0,054 *0,079 279 310 311 361 373 487 504 AD1 0,043 0,033 0,056 0,046 0,049 0,047 0,043 0,62 2,30 3,57 3,93 4,04 2,82 3,10 *18,8 *8,9 *7,4 *21,3 *51,5 0,221 0,169 0,250 0,237 0,247 0,219 0,223 Примітка AD1 -оптична густина по американському методу, AD2 -оптична густина по пропонованому методу, С1-концентрація карбонільних груп по американському методу, С2-концентрація карбонільних груп по пропонованому методу, *-результати при ВМІСТІ білка в пробі 300-1 ЮОмкг Як видно з таблиці, відомий спосіб з сумішшю етанол-етил ацетат давав опалесцюючі розчини, в результаті чого вміст карбонільних груп у білках був завищеним, тоді як при використанні запропонованого способу з переведенням пдразонів в аці-форму в лужному середовищі отримували Комп'ютерна верстка Н Лисенко повністю прозорі взірці, а загальний вміст карбонільних груп був нижчим Таким чином запропонований спосіб визначення карбонільних сполук у білках має переваги перед відомим за рахунок вищої точності і більшої чутливості Підписано до друку 05 08 2003 Тираж39 прим Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, Львівська площа, 8, м Київ, МСП, 04655, Україна ТОВ "Міжнародний науковий комітет", вул Артема, 77, м Київ, 04050, Україна