Спосіб визначення активності сорбітдегідрогенази в спермі та крові тварин

Спосіб відноситься до галузі штучного осіменіння тварин і, зокрема, свиней, оцінки якості сперми, відбору і оцінки кнурів-плідників про їх генеративну здатність, відбору і оцінки кнурців в більш ранньому віці (2 - 3 місяці) і придатність їх для племінного використання. Найбільше близьким є спосіб визначення активності сорбітдегідрогенази в біологічних тканинах, зокрема в над осадовій рідині гомогенатів сім'яників пацюків, який включає її оброблення інкубаційною сумішшю, яка містить трис -буфер, субстрат - сорбіт і кофермент нікотинамідаденіндинуклеотид (НАД), суміш перемішують, витримують при температурі 23°C і кожні 20с заміряють на спектрофотометрі екстінцію при 340ммк. Про активність ферменту сорбітдегідрогенази судять по швидкості перетворення, НАД в НАДН з розрахунку на грам білка, який визначали за методом Ловри. Недоліком способу визначення активності сорбітдегідрогенази є невисока вірогідність, обумовлена тим, що про активність ферменту судять не по кінцевому продукту, який утворився з субстрату (фруктози або сорбіту), а по відновленню НАДН в НАД або окисленні НАД в НАДН. В основу винаходу поставлено задачу вдосконалити спосіб визначення активності ферменту сорбітдегідрогенази, забезпечуючи підвищення вірогідності визначення активності ферменту, що в свою чергу дасть можливість відбирати тварин для використання її в племінній справі в більш ранньому віці. Поставлена задача вирішується у відомому способі визначення активності сорбітдегідрогенази в біологічних тканинах шляхом оброблення дослідного матеріалу інкубаційною сумішшю, яка містить буфер, субстрат і кофермент, в якому в якості буферу використовують трисбуфер, в якості субстрату - сорбіт, а як кофермент використовують НАД. Згідно винаходу приготовляють контрольні і дослідні проби, куди вносять НАД, причому в контрольні проби попередньо вносять трихлороцтову кислоту, після чого в проби вносять дослідний матеріал, перемішують і добавляють трисбуфер, вміст проб перемішують і ставлять на інкубацію при 37,5°C протягом 15, 30 і 45хв, після інкубації в дослідні проби добавляють трихлороцтову кислоту, перемішують і одержану суміш витримують не менше 30хв з наступною фільтрацією, в одержаному фільтраті проб визначають концентрацію фруктози з використанням резорцинового і залізоамонійно галунового реактивів, інкубують одержану суміш при 80°C ± 3°C протягом 40хв, охолоджують до кімнатної температури, визначають в пробах вміст фруктози на ФЕК-М при синьо-зеленому або синьому світлофільтрі і по різниці концентрації фруктози в контрольних і дослідних пробах судять про активність ферменту. Спосіб забезпечує зупинення каталітичної дії ферменту з одночасним депротеінуванням інкубаційної суміші, що забезпечує можливість визначення активності ферменту по кінцевому продукту -фруктозі, утвореної з сорбіту, що підвищує вірогідність самого способу визначення активності ферменту сорбітдегідрогенази і можливість його використання при визначенні в різних біологічних тканинах. Запропонований спосіб здійснюється шляхом внесення в контрольні та дослідні проби по 0,5мл НАД (2,5мг на 1мл води), в контрольні проби перед внесенням дослідного матеріалу вносять по 0,5мл 20% трихлороцтової кислоти і 0,25мл дослідного матеріалу (сперми, її плазми, крові, сироватки крові, або плазми, або гемолізатів), 1,0мл трис -буферу при pH від 7,4 до 8,6 і 0,25мл різної молярності субстрату-сорбіту. Проби добре перемішують, Інкубують на водяній бані 15, 30 і 45хв, але більш закономірно проявляється активність сорбітдегідрогенази при 30-хвилинній інкубації (табл.1, 2). Реакційна суміш дорівнює 2,5мл. Реакцію припиняють внесенням в дослідні проби по 0,5мл 20% трихлороцтової кислоти. В контрольні проби трихлороцтову кислоту добавляють перед внесенням дослідного матеріалу. Через 30хв проби фільтрують через паперові фільтри. До 1мл трихлороцтового фільтрату добавляють по 1,5мл резорцинового реактиву, добре змішують і вносять 1,5мл залізоамонійногалуну. Вмістиме проб добре змішують, накривають пробірки повітряними холодильниками і ставлять в водяну баню при температурі 80°C ± 3°C на 40хв під витяжною шафою. Після проби виймають з водяної бані, охолоджують до кімнатної температури. Колориметрують на фотоелектроколориметрі ФЕКМ, при синьо-зеленому або синьому світлофільтрі (445 або 480ммк) проти сліпої проби. Стабільне забарвлення, прямопропорціональне концентрації фруктози, зберігається тривалий час. Розрахунки проводять по стандартному розчину фруктози або по калібровочному графіку. Активність сорбітдегідрогенази виражають кількістю утвореної фруктози з сорбіту в мг або мікромолях на 1мл або на 100мл дослідного матеріалу, крім цього в спермі в мг на 10 і в мкг (мікрограмах) на куб.мм маси сперміїв. Використання запропонованого способу дає можливість з більшою точністю визначити активність сорбітдегідрогенази в різних біологічних тканинах. Показник активності можна використовувати при оцінці якості сперми при штучному осіменінні свиней, а також при прогнозуванні їх продуктивних якостей шляхом вивчення активності в крові її плазми та гемолізатах еритроцитів.