Спосіб детекції вірусу лейкозу великої рогатої худоби

Спосіб детекції вірусу лейкозу великої рогатої худоби, що передбачає детекцію фрагмента ENVгена вірусу лейкозу, який відрізняється тим, що для полімеразної ланцюгової реакції використовують праймери, що складаються з таких послідовностей: 5'-АСС САА GGA TGG С АС САС ССТ ТСС CAG-3' (BL V 3), 5'-GC A ССТ ТС А GGG AGG TGA GTC ТCТ СТА CCG-3' (BLV 4). (19) (21) 99116399 (22) 25.11.1999 (24) 16.04.2001 (33) UA (46) 16.04.2001, Бюл. № 3, 2001 р. (72) Лиманський Олександр Петрович, Лиманська Ольга Юріївна (73) Інститут експериментальної і клінічної ветеринарної медицини 36260 специфічних послідовностей до рівня виявлення. В залежності від параметрів реакції та обладнання тривалість циклу може варіювати в межах 1 - 3 хвилини, а число циклів, в залежності від кількості вихідного матеріалу, - від 30 до 50. На специфічність та чутливість ПЛР-аналізу значний вплив мають декілька факторів: параметри ампліфікатору; пластиковий посуд, який використовується; дотримування певних заходів обережності при проведенні ПЛР; якість підготовки клінічного матеріалу; якість тест-систем, що використовуються. . Якість тест-систем для ПЛР визначається якістю води, термостабільної ДНК-полімерази та "якістю" праймерів - ступенем гомології олігонуклеотидів, що використовуються. Ступінь гомології праймерів є ключовим параметром, який визначає специфічність ПЛР. Найбільш близькою за суттю та досягнутому результату до запропонованої тест-системи є тест-системи для детекції фрагменту EN V-гену ВЛ ВРХ (Bo vine leukaemia virus: rapid detection of proviral DNA by nested PCR in blood and organs of experimentally infected calves / K. Klintevall, A. Ballagi-Pordany, K. Nusland, S. Belak // Veterinary Microbiology. - 1994. - V. 42. - P. 191-204; A field evaluation of the polymerase chain reaction procedure for the detection of bovine leukaemia vims proviral DNA in cattle / F.W. Ea ves, J.B. Мollоу, С.К. Dimmock et al // Veterinary Microbiology. - 1994. - V. 39. - P. 313-321; Degenerate and specific PCR assays for the detection of bovine leukaemia virus and primate T cell Icukaemia/lymphoma virus pol DNA and RNA: phylogenetic comparisons of amplified sequences from cattle and primates from around the world / S. Dube, S. Bachman, T. Spicer et al // J. of General Virology. - 1997. - V. 78. - P. 13891398). Проведений комп'ютерний аналіз тест-систем, що використовуються у різних лабораторіях (Dr. A. Olofsson, Національний інститут ветеринарії, Швеція; Dr.J. Мolloу, Інститут тваринництва, Австралія) для виявлення ВЛ ВРХ за допомогою ПЛР, показав, що праймери різних авторів характеризуються невисоким ступенем гомології (90 % і менше), що може істотно знижувати чутливість та специфічність ПЛР-аналізу та призводити до появи помилково позитивних та помилково негативних результатів. Помилковий вибір авторами температури відпалу праймерів, що є ключовим параметром ПЛР, та наявність неспарованих нуклеотидів при відпалу праймеру на одному з ланцюгів продукту призводять до того, що відпал праймеру і, отже, ампліфікація продукту будуть неможливі. В основу винаходу поставлене завдання створення високоспецифічної системи праймерів для ранньої діагностики ВЛ ВРХ. Створення системи праймерів для ПЛРдетекції вірусів передбачає пошук консервативних ділянок у геномах ізолятів вірусів з високим ступенем гомології. Для комп'ютерного аналізу з наявних у базах даних EMBL та GenBank секвенованих ізолятів ДНК ВЛ ВРХ було вибрано 8 фрагментів з різних ізолятів довжиною 1500 нуклеотидів. Вибрана ділянка геному ВЛ ВРХ відповідає позиції 4821-6320 повного геному ДНК ВЛ ВРХ (ізолят К02120 з GenBank) і містить гени, які кодують поверхневий глікопротеїн gp 31, трансмембранний білок gp 30, сигнальний пептид. Ділянки вірусних геномів, що характеризувалися 100 % ступенем гомології, були обрані для подальшого аналізу та визначення системи праймерів. Враховуючи вимоги, які пред'являються до праймерів (близькість температур плавлення, зведення до мінімуму димерізації праймерів та наявності самокомплементарних ділянок у праймерів, а також деякі особливості первинної структури олігонуклеотидів, що можуть призводити до утворювання рівноважних вигинів у праймерів) нами була сконструйована тест-система для гніздової ПЛР-детекції ВЛ ВРХ, яка дозволяє ампліфікувати фрагмент геному ВЛ ВРХ довжиною 241 пара нуклеотидів. Для відбору праймерів за їх термодинамічними характеристиками використовували програму “Oligo” (ver. 3.4 та 5.0). Клінічним матеріалом для ПЛР були зразки периферичної крові з додатком антикоагулянту (0,056 М цитрат Na, 0,166 М глюкоза). Лейкоцитарну фракцію отримували центрифугуванням у градієнті щільності 6 % фікол-15 % верографін (або тріомбраст) за 1500 g на протязі 20 хвилин. Препарати ДНК виділяли з лейкоцитів крові з використанням лізису протеїназою К. Об'єм реакційної суміші для ПЛР дорівнював 50 мкл. Використовували два варіанти підготовки проби для ПЛР. Приклад 1. Підготовка проби за допомогою фенолхлороформної обробки: до 100 мкл суспензії лімфоцитів додавали фенол, насичений 1 М трисНС1, рН 8,0, центрифугували при 3000 g протягом 5 хвилин, відбирали водну фазу; додавали суміш фенол-хлороформ, центрифугували при 3000 g протягом 5 хвилин; відбирали водну фазу, яка містила препарат геномної ДНК ВРХ. Для проведення ПЛР брали 5 мкл розчину ДНК. Приклад 2. Підготовка проби за допомогою лізису протеїназою К: до 100 мкл суспензії лімфоцитів додавали буфер для лізису протеїназою К (250 mM трисНС1, рН 7,8; 25 mM СаСІ2) та розчин протеїнази К з концентрацією С=10 мг/мл. Лізис проводили ,при Т=60°С протягом 1 години. Протеїназу К інгібірували прогріванням суміші при Т=95°С протягом 10 хвилин. 8 мкл клітинного лізату використовували для проведення ПЛР. Параметри реакції (температури плавлення продукту та праймерів) визначали за допомогою програми "0ligo" з врахуванням іонної сили інкубаційної суміші. ПЛР проводили на ампліфікаторі НВО "Точність" (Росія). Кожний цикл ампліфікації включав денатурацію при 94°С протягом 1 хв., підпал при 66°С – 1,3 хв., синтез при 74°С— 1 хв. Після 45 циклів ампліфікації відбирали 20 мкл проби для аналізу продуктів реакції у 4 % агарозному гелі (агароза DNA grade, Pharmacia). Електрофорез проводили за напруженістю електричного поля 10 В/см. Для фарбування гелей використовували бромистий стідій. ДНК фагу l, оброблену рестриктазою Hind ІІІ, використовували як маркер молекулярної ваги, а культуру клітин ембріонів вівці (FLK), інфікованих ВЛ ВРХ, а також плазміду pBLV344, яка містить геном ВЛ ВРХ, - як позитивний контроль. 2 36260 __________________________________________________________ ДП "Український інститут промислової власності" (Укрпатент) Україна, 01133, Київ-133, бульв. Лесі Українки, 26 (044) 295-81-42, 295-61-97 __________________________________________________________ Підписано до друку ________ 2001 р. Формат 60х84 1/8. Обсяг ______ обл.-вид. арк. Тираж 50 прим. Зам._______ ____________________________________________________________ УкрІНТЕІ, 03680, Київ-39 МСП, вул. Горького, 180. (044) 268-25-22 ___________________________________________________________ 3