Спосіб дослідження циркадіанних змін мелатонінових рецепторів і а у супрахіазматичних ядрах гіпоталамуса

Спосіб дослідження циркадіанних змін мелатонінових рецепторів І А у супрахіазматичних яд 3 36648 впродовж доби, так і різною щільністю рецепторів мелатоніну в СХЯ, через які гормон здійснює підлаштування ритмів циркадіанного осцилятора. Однак, відомості щодо характеристики мелатонінових рецепторів у С ХЯ гіпоталамуса носять фрагментарний характер і не висвітлюють цілісного уявлення про вказані структури. Мета дослідження: охарактеризувати щільність мелатонінових рецепторів у супрахіазматичних ядрах гіпоталамуса у циркадіанному аспекті. Матеріал і методи: експерименти проведені на 40 статевозрілих самцях безпородних білих щурів масою 0,15-18кг. Тварин утримували в твариннику при сталій температурі, вологості повітря та вільному доступі до води й їжі. Дослідних тварин поділено на 4 групи (10 особин у кожній), які перебували за умов звичайного світлового режиму 12.00С:12.00Т (світло з 08.00 до 20.00год. лампи денного світла ЛБ-40, освітленість приміщення на рівні тварин 200Лк) впродовж 7-ми діб. З метою виявлення циркадіанних відмінностей мелатонінових рецепторів та враховуючи циклічність продукції мелатоніну евтаназію щурів виконували з 6-ти годинним інтервалом (02.00, 08.00, 14.00 та 24.00год.) шляхом декапітації на 8-му добу. Всі етапи експерименту проведено з дотриманням основних вимог Європейської конвенції щодо гуманного ставлення до тварин (Страсбург, 1986). Для імуногістохімічного дослідження ідентифіковану ділянку СХЯ гіпоталамуса фіксували у 10%-му розчині нейтрального забуференого формаліну впродовж 22год. Після цього виконували прискорене зневоднювання у спиртах висхідної концентрації, заливали у парафін при температурі 58°С з наступним отриманням гістологічних зрізів 5мкм завтовшки. З метою виконання імуногістохімічної методики використані поліклональні антитіла до мелатонінових рецепторів 1А виробника Abeam (Велика Британія) та стрептавідинбіотинову систему візуалізації LSAB2 (пероксидазна мітка + діамінобензидин) виробника Chemicon International Inc. (США). Максимально дотримувалися стандартизації протоколу методики для всіх зрізів. Дофарбовування ядер виконували гематоксиліном Майера. Кількісні дослідження інтенсивності зафарбовування проводили за наступною схемою. Спочат 4 ку, при використанні об’єктива мікроскопа х40, отримували цифрові копії оптичного зображення, які в подальшому аналізували за допомогою ліцензійної копії комп’ютерної програми "ВидеоТест Размер 5.0" (ООО Видеотест, Россия), а саме проводили комп’ютерну мікроденситометрію. Аналіз здійснювали на підставі вимірювань мікрозондовою методикою у місцях позитивного забарвлення за показником "Оптична щільність" (в умовних одиницях з діапазоном 0-1, причому "0" відповідає абсолютній оптичній прозорості у мікрозонді, а "1" - абсолютній оптичній непрозорості). Враховуючи необхідність виконання множинних статистичних порівнянь середніх величин у статистичних вибірках, для визначення відмінностей між сукупностями використаний критерій Ньюмена-Кейлса. Чітке позитивне імуногістохімічне забарвлення визначалось у нейронах СХЯ у вигляді гранул різних розмірів та щільності, які концентрувалися переважно по периферії кожної клітини, що вочевидь відображає трансмембранне розташування мелатонінових рецепторів 1А. Ім уногістохімічного забарвлення ядер не спостерігали - вони профарбовувалися виключно гематоксиліном і характеризувалися типовою для нейронів СХЯ морфологією. Звертало на себе увагу те, що серед нейронів виділялися клітини дрібних розмірів (діаметром 510мкм) переважно круглястої форми та великі клітини (діаметром 13-24мкм), які мали або полігональну, або грушоподібну форму. Характерним було те, що на 8.00 порівняно з 02.00год. у 4,5 рази (з 64±1,2 до 14±0,8 у полі зору площею 1600мкм 2 р