Спосіб морфологічної верифікації апоптозу

Спосіб морфологічної верифікації апоптозу, що включає віз уалізацію клітин біологічного зразка, який відрізняється тим, що клітини візуалізують фарбуванням їх за Ейнарсоном. (19) (21) u200808708 (22) 01.07.2008 (24) 25.11.2008 (46) 25.11.2008, Бюл.№ 22, 2008 р. (72) ЯКОВЦОВА АНТОНІНА ФЕДОРІВН А, U A, ГУБІНА-ВАКУЛИК ГАЛИНА ІВАНІВН А, U A, КИХТЕНКО ОЛЕН А ВАЛЕРІЇВН А, UA, ГАРГІН ВІТАЛІЙ ВІ 3 37456 962 с; Лили Р. Патогистологическая техника и практическая гистохимия. - М.: Мир, 1960. - 648 с; Микроскопическая техника: Руководство / Под ред. Д. С. Саркисова, Ю. Л. Перова. - М.: Медицина, 1996. - 544с; Меркулов Г. А. Курс патологогистологической техники. - М.: Медицина, 1961. - 339 с]. Із виготовлених таким способом блоків виготовляють серійні зрізи товщиною 4-5 х10-6м. Порядок подальших дій такий: 1. Проводять депарафінірування зрізів шляхом промивання спочатку в ксилолі (15-20 хвилин), потім у спиртах концентрації, що зростає: 70%, 90% абсолютний спирт (по 5-10 хвилин); промивають у дистильованій воді - 2 рази по 10-15 хвилин. 2. Зрізи поміщають у забуферений фізіологічний розчин на Тріс-Буфері (ТБС), що має рН 7,4. Інкубують 10 хвилин у термостаті при температурі 80°С. 3. Для блокування ендогенної пероксидазної активності зрізи поміщають в 1% розчин перекису водню на 20 хвилин, після чого промивають у дистильованій воді - 3 рази по 3 хвилини. 4. На зрізи наносять неімунну сироватку (донор вторинних антитіл), інкубують 30 хвилин. 5. Без промивання на зрізи наносять вторинні антитіла (кон'юговані з пероксидазою хрону антитіла проти імуноглобулінів тварини - донор первинних антитіл), інкубують 30 хвилин. Зрізи промивають в ТБС - 3 рази по 3 хвилини, потім у дистильованій воді - також 3 рази по 3 хвилини. 6. На зрізи наносять ДАБ і інкубують 15 хвилин, після чого зрізи промивають в дистильованій воді 3 рази по 3 хвилини. 7. Ядра дофарбовують гематоксиліном і накривають накривним склом. Непрямий метод Кунса проводиться за методикою Brosman [Brosman M. Immunofluorescencne vysetrovanie formal-parafinovego materialu. // Cs. patol. - 1979. - Vol. 15 (4). - P.215-220.]. У якості люмінесцентної мітки використовують F (ab)-2 мічені фрагменти кролячих антитіл проти імуноглобулінів миші (FITS). Методика проводиться таким способом. Матеріал фіксується в 10% розчині формальдегіду на протязі 2-3 діб. Потім шматочки тканини піддаються стандартній гістологічній парафіновій проводці [Пирс Э. Гистохимия (теоретическая и прикладная). - Москва: Иностранная литература, 1962. 962 с; Лили Р. Патогистологическая техника и практическая гистохимия. - М.: Мир, 1960. - 648 с; Микроскопическая техника: Руководство / Под ред. Д. С. Саркисова, Ю. Л. Перова. - М.: Медицина, 1996. - 544с; Меркулов Г. А. Курс патологогистологической техники. - М.: Медицина, 1961. - 339с.]. Із виготовлених таким чином блоків виготовляють серійні зрізи товщиною 4-5х10-6м. Порядок подальших дій такий: 1. Проводять депарафінірування зрізів шляхом промивання спочатку в ксилолі (15-20 хвилин), потім у спиртах концентрації, що зростає: 70%, 90% абсолютний спирт (по 5-10 хвилин); промивають у дистильованій воді - 2 рази по 10-15 хвилин. 4 2. Зрізи поміщають в 1% розчин трипсину або 2,5% розчин пепсину й витримують у термостаті протягом 1 години при температурі 37°С, після чого промивають у дистильованій воді (3 рази по 10 хвилин) і занурюють у фізіологічний розчин, що має рН 7,4. 3. Зрізи горизонтально розташовують у ча шках Петрі на вологому фільтрі. Готовлять розчин моноклональних антитіл (у співвідношенні 1:15) і капають його на скло. Чашки із препаратами накривають кришками й поміщають у термостат на 1 годину при температурі 37°С, після чого промивають у фізіологічному розчині 3-4 рази по 10 хвилин. 4. Зрізи горизонтально розташовують у ча шках Петрі на вологому фільтрі. Готовлять розчин флуоресціюючого антиглобуліну (у співвідношенні 1:30) і капають його на скло. Чашки із препаратами накривають кришками й поміщають у термостат на 30 хвилин при температурі 37°С, після чого промивають у фізіологічному розчині 3-4 рази по 10 хвилин. 5. Скельця зі зрізами просушують у темному місці. Препарати вивчають у люмінесцентному мікроскопі. Даний спосіб верифікації апоптозних тілець є найбільш близьким до того, що заявляється, за технічною суттю та результатом, який може бути досягнутим, тому його обрано за прототип. Негативними якостями обох описаних вище методик є по-перше - дорожнеча реактивів, подруге - громіздкість і трудомісткість. У зв'язку з вищевикладеним, в основу корисної моделі покладено задачу здешевлення та спрощення способу морфологічної верифікації апоптозу. Задачу, яку покладено в основу корисної моделі, вирішують тим, що у відомому способі морфологічної верифікації апоптозу, що включає візуалізацію клітин біологічного зразка, згідно з корисною моделлю, клітини візуалізують їх фарбуванням за Ейнарсоном. Технічний ефект корисної моделі обумовлений тим, що виявлення апоптозу клітин біологічного зразку здійснюють просто, швидко й із значним здешевленням методики при високій якості одержаних результатів. Спосіб виконують наступним чином: Для морфологічної верифікації апоптозу використовують фарбування біологічного зразка за Ейнарсоном. При цьому одночасно офарблюють рибонуклеїнову кислоту (РНК) і ДHK. Останні, як відомо, є фрагментами ядра клітини, що гине, і виявляються вже на фінальних стадіях апоптотичного процесу. Склад і готування барвного розчину наступні: хромові галуни - 5,0гр; галоціанін - 0,15гр. Розчин готують шля хом розчинення хромових галунів у дистильованій воді, після чого додають галоціанін. Поступово нагріваючи, його доводять до кипіння й кип'ятять 5 хвилин. Після охолодження розчин фільтрують і доводять його обсяг до 100,0мл дистильованою водою. Методика проведення реакції включає наступні етапи: 5 37456 1. Проводять депарафінірування зрізів шляхом промивання спочатку в ксилолі (15-20 хвилин), потім у спиртах концентрації, що зростає: 70%, 90% абсолютний спирт (по 5-10 хвилин); промивають у дистильованій воді - 2 рази по 10-15 хвилин. 2. Зрізи поміщають у приготовлений барвний розчин на 48 годин при кімнатній температурі. 3. Зрізи промивають водопровідною водою 1-2 хвилини, споліскують дистильованою водою й збезводнюють у дво х порціях 96% спирту, по 1-2 хвилині в кожній. 4. Послідовно просвітлюють зрізи в карбонксилолі й ксилолі, потім покривають накривним склом. 6 Результат: стр уктури, що містять нуклеїнові кислоти, офарблюються в сірувато-блакитний колір. Ефективність способу ілюструють наступні приклади: Приклад 1. Епіфіз кролика, що утримува вся 6 місяців в умовах цілодобового висвітлення. Є безліч вільно лежачих апоптозних тілець. Фарбування за Ейнарсоном, збільшення в 1000 разів. Приклад 2. Епіфіз кролика контрольної групи, що утримувались в умовах нормальної зміни денного й нічного висвітлення. Апоптозні тільця відсутні. Фарбування за Ейнарсоном, збільшення в 1000 разів. Здешевлення способу ілюструють таблиці 1 та 2. Таблиця 1 Назва клону Фасовка 1мл 1мл CD95 Каспаза-3 Ціна за упаковку (грн.) 4741,00 4466,00 В таблиці 1 наведена вартість нерозведених моноклональних антитіл виробництва фірми Dako (Данія); Таблиця 2 Назва Система візуалізації Вторинні антитіла Імунофлуоресцентна мітка Тріс-Буфер Хромоген фасовка 15мл 125мл 15мл 10л 500мл У таблиці 2 наведена вартість систем візуалізації и інших додаткових реактивів, що використовуються для постановки описаних імуногістохімічних реакцій. Таким чином, сукупна вартість реактивів, необхідних для постановки непрямої реакції Кунса з CD95 становить 5064грн 40коп, з каспазою-3 Комп’ютерна в ерстка І.Скворцов а Цiна за упаковку (грн.) 3984,75 646,8 323,4 739,2 808,5 4789грн 40коп. Вартість реактивів для непрямої пероксидазної реакції з CD95 становить 10 тисяч 920грн 05коп, з каспазою-3 - 10 тисяч 15грн 50 копійок. При цьому вартість реактивів, необхідних для виконання способу, що заявляється, не перевищує 150,0грн. Підписне Тираж 28 прим. Міністерство осв іт и і науки України Держав ний департамент інтелектуальної в ласності, вул. Урицького, 45, м. Київ , МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислов ої в ласності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601