Спосіб прогнозування ризику виникнення переломів

Спосіб прогнозування ризику виникнення переломів, який передбачає забір біологічного матеріалу (крові, слини, зішкрябків чи мазків) та його дослідження, який відрізняється тим, що з біологічного матеріалу виділяють ДНК та визначають наявність точкових мутацій генів рецептора естрогену ER1 та вітаміну Д VDR за допомогою застосування методу полімеразної ланцюгової реакції та наступною обробкою продуктів ампліфікації специфічними ендонуклеазами ХbаІ та BsmI (відповідно), і при наявності комбінації генотипу bbХХ прогнозують ризик виникнення переломів кісток. (19) (21) u200815220 (22) 29.12.2008 (24) 10.06.2009 (46) 10.06.2009, Бюл.№ 11, 2009 р. (72) ПОВОРОЗНЮК ВЛАДИСЛАВ ВОЛОДИМИРОВИЧ, UA, БУТЕНКО ГЕННАДІЙ МИХАЙЛОВИЧ, UA, ПІШЕЛЬ ІРИНА МИКОЛАЇВНА, UA, ГРИГОР'ЄВА НАТАЛІЯ ВІКТОРІВНА, UA, ЄВТУШЕНКО ОЛЬГА ОЛЕКСАНДРІВНА, UA, ЛЕОНОВ ЮРІЙ ІГОРОВИЧ, UA (73) ДЕРЖАВНА УСТАНОВА "ІНСТИТУТ ГЕРОНТОЛОГІЇ АМН УКРАЇНИ", UA 3 чає визначення алелей гену рецептору вітаміну Д В/b, А/а або T/t з використанням специфічних ендонуклеаз BsmI, АраІ та TaqI, відповідно. При наявності специфічної комбінації алелей bаТ роблять висновок про підвищений ризик виникнення переломів. Спосіб передбачає визначення трьох алелей гену, що ускладнює процес дослідження та ідентифікації результатів, й на 30% дорожче від запропонованого способу. Завданням даної корисної моделі є створення способу прогнозування ризику виникнення переломів за рахунок виділення та дослідження ДНК з біологічного матеріалу (крові, слини, зішкрябів чи мазків), визначення наявності точкових мутацій гену рецептору естрогену ER1 та вітаміну Д VDR, і при наявності генотипу bbХХ робиться висновок про належність обстежуваного пацієнта до групи ризику виникнення переломів, що забезпечує можливість раннього (в молодому віці) прогнозу та дозволяє завчасне застосування попереджувальних заходів. Спосіб здійснюється наступним чином: 1. Відбирають у пацієнта біологічний матеріал (кров / слина / зішкряби / мазки). 2. Виділення ДНК проводять з допомогою набору "ДНК-сорб-В" (фірми АмплиСенс, Росія). - у пробірки з лізуючим розчином вносять по 100мкл проби; - проби ретельно змішують на вортексі та прогрівають 5хв. при 65°С. Відцентрифугувати 5с при 5тис. об./хв. на мікроцентрифузі; - ретельно ресуспендують сорбент універсальний на вортексі. У кожну пробірку додають по 25мкл ресуспендованого сорбенту, змішують на вортексі, залишають у штативі на 2хв., ще раз змішують і залишають у штативі на 5хв.; - осаджують сорбент центрифугуванням при 5тис. об./хв. протягом 30с, видаляють супернатант; - додають в проби по 300мкл розчину для відмивання 1, змішують на вортексі до повного ресуспендування сорбенту. Осаджують сорбент центрифугуванням при 5тис. об./хв. протягом 30с Видаляють супернатант; - додають в проби по 500мкл розчину для відмивання 2, змішують на вортексі до повного ресуспендування сорбенту, центрифугують 30с при 10тис. об./хв. Видаляють супернатант. Процедуру повторюють; - пробірки ставлять в термостат при 65°С на 510хв. для підсихання сорбенту; - в пробірки додають по 50мкл ТЕ-буфера для елюції ДНК, змішують на вортексі, ставлять в термостат при 65°С на 5хв., періодично струшуючи; - центрифугують пробірки при 12тис. об./хв. протягом 1хв. Супернатант містить очищену ДНК, проби готові для постановки полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР). 3. Постановка ПЛР: - готують реакційну суміш для ПЛР, виходячи з необхідного числа реакцій, додаючи реагенти в наступному порядку: вода, буфер для ПЛР, розчин dNTP (100мМ), ДНК-полімераза Taq (5u/мкл), праймер (ER F: 5`-ATC CAG GGT TAT GTG GCA 41814 4 ATG АС-3`; ER R: 5`-АСС CTG GCG TCGATTATC TGA-3` або VDR (bsm) F: 5`-САА CCA AGA СТС AAG ТАС CGC GTC AGT GA-3`; VDR (bsm) R: 5`ААС CAG CGG AAG AGG TCA AGG G-3`). - у пронумеровані пробірки наливають по 15мкл реакційної суміші, 1 краплі мінеральної олії; - додають зразок ДНК і закривають пробірки. - центрифугують пробірки протягом 10с, щоб шар води опинився під олією. - пробірки ставлять до ампліфікатора та встановлюють програму роботи: Для ER1 95 oC - 5 хв 94 oC - 30 c ü ï ï 57 oC - 40 c ý30 циклів ï 72 oC - 30 c ï þ Для VDR 95 oC - 5 хв 94 oC - 30 c ü ï ï 65 oC - 30 c ý30 циклів 72 oC - 30 c ï ï þ 4. Обробка ендонуклеазами. - готують реакційну суміш, виходячи з необхідного числа реакцій, додаючи реагенти в наступному порядку: вода, буфер ендонуклеаза ХbаІ або BsmI; - в пронумеровані пробірки наливають по 5мкл реакційної суміші, 1 краплі мінеральної олії. - додають відповідні продукти ампліфікації і закривають пробірки. - центрифугують пробірки протягом 10с., щоб шар води опинився під олією. - інкубуємо при 37°С протягом 16 годин. 5. Аналіз отриманих продуктів проводять з допомогою електрофорезу в 1,5% агарозному гелі з бромистим етидієм.Електрофорез проводять в 1х ТВЕ (трисбейс-ЕДТА) буфері при 200В, 80мА, протягом 15хв. 6. Після проведення електрофорезу гель розміщують на робочій поверхні трансілюмінатора, закривають темною камерою з фотоапаратом і фотографують гель. 7. Аналіз отриманих результатів. При наявності генотипу bbХХ робимо висновок про ризик виникнення у пацієнта переломів. Новим у способі є те, що з біологічного матеріалу (крові, слини, зішкрябів чи мазків) виділяють ДНК та визначають наявність точкових мутацій генів рецептору естрогену ER1 та вітаміну Д VDR за допомогою застосування методу полімеразної ланцюгової реакції та наступною обробкою продуктів ампліфікації специфічною ендонуклеазою ХbаІ та BsmI (відповідно), і при наявності генотипу bbХХ роблять висновок про належність досліджуваного пацієнта до групи ризику виникнення переломів. Внаслідок застосування способу забезпечується можливість віднесення пацієнта до групи ризику на ранньому етапі, спосіб гарантує визначення групи ризику саме для української популяції. 5 41814 Здійснення запропонованого способу не пов'язано з травмуванням пацієнта, проведення дослідження можливе після транспортування зразків крові до діагностичних центрів на далекі відстані, і не потребує транспортування або присутності пацієнта під час проведення генотипування. Спосіб, що заявляється, ілюструється прикладом. Приклад 1. Жінка 45 років. Діагноз остеопенія. При проведенні дослідження виявлено генотип bbХХ. Ризик виникнення переломів у цій групі жінок складає 50% (Р