Спосіб профілактики метастазів

Спосіб профілактики метастазів, що включає використання пухлиноспецифічного фактора переносу, який відрізняється тим, що ксеногенний пухлиноспецифічний фактор переносу отримують із лімфоцитів, сенсибілізованих in vivo до антигенів пухлини, на піку імунної відповіді щурів після внутрішньоочеревинної імунізації живими клітинами мишачої карциноми легені Льюїс і вводять реципієнту внутрішньоочеревинно. (19) (21) u200903729 (22) 16.04.2009 (24) 25.08.2009 (46) 25.08.2009, Бюл.№ 16, 2009 р. (72) ФІЛЬЧАКОВ ФЕОДОСІЙ ВІКТОРОВИЧ, ШУМІЛІНА КАТЕРИНА СТАНІСЛАВІВНА, ЛЬОН ГАННА ДАРІЇВНА, ГРІНЕВИЧ ЮРІЙ ЯКИМОВИЧ (73) ДЕРЖАВНА УСТАНОВА "НАЦІОНАЛЬНИЙ ІНСТИТУТ РАКУ" 3 Недоліком прототипу є спосіб отримання специфічного ФП в системі in vitro, що обмежує фізіологічні умови сенсибілізації лімфоцитів до антигенів пухлини для забезпечення генерації пухлиноспецифічних трансферфакторних пептидів імунокомпетентними клітинами. Задачею корисної моделі є створення способу профілактики метастазів шляхом введення ксеногенного пухлиноспецифічного (до антигенів конкретної пухлини) ФП, отриманого з лімфоцитів селезінки щурів на піку імунізації живими ксеногенними пухлинними клітинами мишачої карциноми легені Льюїс (КЛ), що дасть можливість запобігти виникненню метастазів у мишей при попередньому введенні (до імплантації КЛ) або загальмувати їх ріст (при введенні на початковій стадії росту КЛ) при його застосуванні. Поставлена задача вирішується таким чином: Інтактним мишам C57BL/6 внутрішньоочеревинно одноразово в дозі 200пг/тварину вводять препарат ксеногенного пухлиноспецифічного ФП, отриманого з лімфоцитів селезінки щурів на піку імунної відповіді (на 14-у добу) після внутрішньоочеревинної імунізації живими клітинами КЛ згідно методики [II]. Через 5 діб після ін'єкції ФП для відтворення моделі пасивного метастазування КЛ тваринам внутрішньовенне вводять живі клітини КЛ (життєздатність 95%) в об'ємі 0,1мл забуференого фізіологічного розчину (ЗФР) в дозі 0,6×106кл/мишу. На 16-у добу тварин умертвляють під ефірним наркозом шляхом дислокації шийних хребців і оцінюють антиметастатичний ефект ФП. Підтвердженням того, що внутрішньоочеревинне введення ФП запобігає метастазуванню, є формування протективної імунної відповіді за допомогою попереднього введення ФП реципієнтам пухлини, що проявляється в попередженні виникнення метастазів КЛ в легенях у 60% тварин та гальмуванні їх росту. Прикладами реалізації заявленого способу можуть вважатися результати експериментальних досліджень - гальмування процесу метастазування у тварин після введення їм ксеногенного пухлиноспецифічного ФП. І. Інтактним мишам C57BL/6 внутрішньоочеревинно одноразово в дозі 200пг/тварину вводили препарати ксеногенного пухлиноспецифічного ФП, отриманих з лімфоцитів селезінки щурів на 7-, 14-, 60-у добу (відповідно ФП7-І, ФП14-І, ФП60-І) після внутрішньоочеревинної імунізації живими клітинами КЛ. Дію цих препаратів порівнювали з дією неспецифічного ФП (ФПН), отриманого з лімфоцитів селезінки інтактних тварин. Через 5 діб після ін'єкції ФП тваринам внутрішньовенне були введені живі клітини КЛ (життєздатність 95%) в об'ємі 0,1мл ЗФР в дозі 0,6×106кл/мишу. На 16-у добу тварин умертвляли під ефірним наркозом шляхом дислокації шийних хребців і оцінювали антиметастатичний ефект ФП. Показано, що на тлі попереднього введення ФП14-І в 60% випадків метастазів КЛ в легенях не виявлено. На відміну від цього попереднє введення ФП7-І запобігло появі метастазів лише у 14% тварин, а після введення ФП60І або ФПН-О %, як і в контрольній групі. Кількість метастазів, значно менша за показник в контроль 43727 4 ній групі (47,00±2,68), виявлена на тлі попереднього введення ФП14-І (5,50±0,67) та ФП60-І (4,00±1,48). Про ефективне формування протективного імунітету свідчить і значне зменшення об'єму метастазів у тварин досліджуваних груп: найменший об'єм зафіксовано в групі з попереднім введенням ФП14-І ((5,40±4,23)мм3), найбільший - в групі з ФП7-І ((111,82±48,16)мм3) та ФПН ((111,28±31,63)мм3) проти об'єму метастазів в контрольній групі ((345,72±1,60)мм3). Таким чином, попереднє одноразове внутрішньоочеревинне введення ксеногенного пухлиноспецифічного ФП14-І в дозі 200пг/тварину запобігає розвитку метастазів КЛ в легенях у 60% тварин та гальмує їх ріст у випадку виникнення. II. Інтактним мишам C57BL/6 підшкірне прищепили КЛ. На 2-у добу і потім через кожні 7 діб (всього 4 ін'єкції) тваринам дослідних груп внутрішньоочеревинно вводили зразки ФП14-І та ФПН в дозі 200пг в 0,1мл ЗФР та 0,1мл ЗФР - тваринам контрольної групи. На 35-у добу тварин умертвляли під ефірним наркозом і проводили дослідження кількості та об'єму метастазів. Кількість метастазів після введення ФП14-І зменшилась у 1,3 рази, а після введення ФПН практично не відрізнялась від показника в контрольній групі. Введення ФП14-І та ФПН істотно вплинуло на інтенсивність росту метастазів: це проявилось збільшенням кількості метастазів в аваскулярній фазі на 20% в порівнянні з контрольною групою. Крім того, встановлено, що ФП14-І сприяв зменшенню об'єму метастазів в легенях в 2,2 рази, а ФПН такої дії не справляв. Отже, порівняльний аналіз впливу зразків ФП14-І та ФПН на процес спонтанного метастазування КЛ в легені мишей C57BL/6 виявив, що ФП14-І ефективно гальмує розвиток метастазів у мишей, що підтверджує виразну антиметастатичну дію цього препарату. Таким чином, в описаному способі профілактики метастазів шляхом внутрішньоочеревинного введення мишам ксеногенного пухлиноспецифічного ФП, отриманого з лімфоцитів селезінки щурів на піку імунної відповіді (на 14-у добу) після внутрішньоочеревинної імунізації живими клітинами КЛ, досягнуто утворення протективного імунного захисту організму стосовно КЛ. Це проявляється запобіганням виникнення метастазів КЛ в легенях мишей та пригніченням їх росту при профілактичному одноразовому внутрішньоочеревинному введенні тваринам наднизьких концентрацій пухлиноспецифічного ФП ксеногенного походження та терапії в повторюваному режимі наднизькими дозами препарату. Подальше дослідження властивостей пухлиноспецифічного ФП ксеногенного походження дозволить отримувати препарати для імунотерапії в післяопераційному періоді з метою профілактики рецидивів та метастазів у хворих онкологічного профілю. Джерела інформації: 1. Т cell Memory, anergy and immunotherapy in Breast cancer / V. Schirrmacher, M. Feuerer, P. Beckhove et al. // J. Mammary Gland Biol. Neoplasia. - 2002. -Vol.7, №2.-P.201-207. 2. Zitvogel L., Tesniere A., Kroemer G. Cancer despite immunosurveillance: immunoselection and 5 43727 immunosubversion // Nature Rewies. - 2006. - Vol.6. P.715-727. 3. Immunotherapy with transfer factor in hormone-resistant metastasized carcinoma of the prostate / F. Corrado, G. Pizza, C. de Vinci et al. // Arch. Esp. Urol. - 1989. - №42. - P.191-196. 4. Kirkpatrick C.H. Structural nature and functions of transfer factors // Ann. N. Y. Acad - 1993. - Vol. 685. - P. 362-368. 5. Биологические и клинические аспекты фактора переноса - В кн.: Иммунологическая инженерия / М.П. Арала-Чейвз, M. Хорсманхейлео, Дж.М. Гоуст и др.; Под ред. Д.У.Джирша: Пер. с англ. M.: Медицина, 1982.-С.53-104. 6. Fujisawa Т., Yamaguchi Y. Postoperative immunostimulation after complete resection improves survival of patients with stage 1 nonsmall cell lung carcinoma // Cancer. - 1996. - №78. - P.1892-1898. 7. Transfer factor as an adjuvant to non-small cell lung cancer (NSCLC) therapy / V. Pilotti, M. Mastrorilli, G. Pizza et al. // Biotherapy. - 1996. Vol.9, №1-3. -P.117-121. Комп’ютерна верстка Н. Лиcенко 6 8. Adjuvant treatment using transfer factor for bronchogenic carcinoma: long-term follow-up / R.J.Whyte, M.A.Schork, A.Hoan et al. // Ann. Thorac. -1992. - Vol.53, №3. - P.391-396. 9. Transfer factor with anti-EBV activity as an adjuvant therapy for nasopharyngeal carcinoma: A pilot study / U. Prasad, M.A. bin Jalaludin, P. Rajadurai et al. // Biotherapy. - 1996. - Vol.9, №1-3. P.109-115. 10. A preliminary report on the use of transfer factor for treating stage D3 hormone-unresponsive metastatic prostate cancer / G. Pizza, C. de Vinci, D. Cuzzocrea et al. // Biotherapy. - 1996. - Vol.9, №1-3. P.123-132 (прототип). 11. Деклараційний патент на корисну модель №16938, UA. МПК А61К35/28. Спосіб отримання пухлиноспецифічного фактора переносу / Ін-т онкології АМН України. Ф.В.Фільчаков, Л.І.Бобро, К.С.Шуміліна, Ю.Я.Гріневич (UA). - Заявка №200504315. Заявл. 06.05.2005. Опубл. 15.09.2006. -Бюл. №9, 2006. Підписне Тираж 28 прим. Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601