Спосіб отримання колагенового модуля строми рогівки

Спосіб отримання колагенового модуля строми рогівки, який полягає в обробці ділянки рогівкової оболонки, отриманої з видалених очей тварин, яку розміщують в середовищі для культивування 3 44128 компоненту рогівки і склери, а також колагену V, VI, III і VII типів. Строма складає 90 % товщини рогівкової оболонки (450 мкм в центральних ділянках) і складається з трьох компонентів: колагенових пластин, клітин і основної речовини. Кожна стромальна пластина складається з пучка колагенових волокон, орієнтованих паралельно один одному. Фібрили володіють типовою зчерченістю, рівною 64 нм і характерною для колагенових волокон інших типів сполучної тканини. Колагенові волокна полягають, в основному, з колагену 1 типу. Стромальні пластини занурені в основну речовину, представлену різними типами протеогліканів. Гідрофільна частина основної речовини глікозаміногліканів, в яку занурені колагенові волокна, набуває форми протеогліканів шляхом ковалентного з'єднання глікозаміногліканів з білками. Протеоглікани мають досить різноманітну хімічну будову. У стромі рогівкової оболонки з глікозаміногліканів виявлені кератан сульфат, хондроїтін-4-сульфат, ходроїтін-6-сульфат, дерматан сульфат. Молекули глікозаміногліканів огортають волокна і орієнтуються перпендикулярно колагеновому волокну. Саме зв'язок між волокнами і протеогліканами забезпечує прозорість тканини рогівки. Основним клітинним елементом строми рогівкової оболонки є кератоцит. Кератоцити складають 2,4 - 5,0 % об'єму строми. Десцеметова оболонка Pas-позитивна і складається з коротких і тонких фібрил (10 нм). Фібрили, у свою чергу, утворені колагеном 4 типу і занурені в глікопротеїнову основну речовину. Відомий спосіб отримання модуля рогівки полягає в ліофілізації рогівки. Недоліком цього способу є: 1. Відсутність людської донорської рогівки. 2. При використанні ксенотрансплантанта виникає імунна відповідь. Найбільш перспективними представляються спроби створення колагенових модулів шляхом полімеризації різних видів колагену. Найбільш вивченим є спосіб отримання колагенового модуля шляхом полімеризації ателоколлагена [А Simple, 4 Cross-linked Collagen Tissue Substitute for Corneal Implantation Yuwen Liu, Lisha Gan, David J. Carlsson, Per Fagerholm, Neil Lagali, Mitchell A. Watsky, Rejean Munger, William G. Hodge, David Priest, and May Grifeth Invest Ophthalmol Vis Sci. 2006;47:1869-1875]. Проте, висока вартість ателоколагена і труднощі пов'язані з його полімеризацією, призводять до обмеження його використання. Завданням цього дослідження є створення колагенового модуля з ксенотрансплантанта рогівкової оболонки. Результат, який може бути отриманий при виконанні пропонованого методу, лежить в отриманні колагенового модуля, який можливо використовувати для пошарових пересадок рогівки. Поставлене завдання вирішується шляхом видалення за допомогою вимивання клітинних і неклітинних елементів рогівки, відщеплення кінцевих пепетідних ділянок колагенових молекул, що обумовлюють їх антигенні властивості. Спосіб виконується таким чином. Ділянку рогівкової оболонки, отриману з видалених очей тварин, розміщують в середовище для культивування тканини (фіз. р-чин) і обробляється таким чином: 1. 10 % розчин трипсину у присутності 1 % фтористого натрію при рН 7,6 протягом 3 годин при температурі 25°С. 2. 3-х кратне промивання протягом 30 хв. фіз. розчином. 3. Інкубація в 2 % розчині тритона Х-100 при 0°С протягом 24 годин. 4. 3-х кратна заміна розчину, промивка 5 кратним фіз. розчином. 5. Обробка 1 % гіалуронідазою протягом 5 годин. 6. Промити фіз. розчином. 7. Обробити фосфоліназою 1 ЕД в 1 мл протягом 12 годин. 8. Одноразова промивка фіз. розчином. 9. 3-х кратна промивка диметилсульфоксидом. 10. 2-х кратна промивка фіз. розчином. 11. Перенесення в середовище Ігла і зберігання при температурі 0°С. Причинно-наслідкові зв'язки Причина Обробка 10 % розчином трипсину Обробка 10 % розчином тритону X-100 Обробка 10 % розчином гіалуронідазою Обробка 10 % розчином фосфоліпази Обробка 10 % розчином пепсину Обробка 10 % розчином диметилсульфоксидом Використання середовища Ігла Перевагами розробленого способу є можливість використання ксенотрансплаптантів, простота отримання колагенового модуля. Наслідок Деструкція епітеліального шару клітин, відщеплення кінцевих фрагментів колагену Розщеплення мембранних структур клітин Розщеплення мукополісахаридів Розщеплення ліпідних компонентів Відщеплення кінцевих фрагментів колагена Видалення деструктивного матеріалу Відмивання й зберігання модуля Таким чином, як видно із проведеного аналізу, кінцева мета корисної моделі забезпечується сукупністю істотних відмітних ознак. 5 Комп’ютерна верстка Л.Литвиненко 44128 6 Підписне Тираж 28 прим. Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601