Спосіб структурно-функціональної оцінки формування умовної реакції активного уникнення тварини

УКРАЇНА (із) U A ( іі»44400 (із, А (51)6 A61B5/0484.G01 N33/50 МІНІСТЕРСТВО ОСВІТИ І НАУКИ УКРАЇНИ ДЕРЖАВНИЙ ДЕПАРТАМЕНТ ІНТЕЛЕКТУАЛЬНОЇ ВЛАСНОСТІ ОПИС ДО ДЕКЛАРАЦІЙНОГО ПАТЕНТУ НА ВИНАХІД видається під відповідальність власника патенту (54, СПОСІБ СТРУКТУРНО-ФУНКЦІОНАЛЬНОЇ ОЦІНКИ ФОРМУВАННЯ УМОВНОЇ РЕАКЦІЇ АКТИВНОГО УНИКНЕННЯ ТВАРИНИ (21,2000031752 (22, 28 03 2000 (24,15 02 2002 (46,15 02 2002, Бюл № 2, 2002 р (72, Дроздов Олексій Леонідович, Дзяк Людмила Антонівна, Дука Тетяна Іванівна, Чорна Валентина Іванівна (73, ДНІПРОПЕТРОВСЬКА ДЕРЖАВНА МЕДИЧНА АКАДЕМІЯ Винахід відноситься до медицини, а саме до визначення, виміру або реєстрації з діагностичною ціллю, здебільшого з викликом відповідної реакції, і може бути використаним в теоретичній або КЛІНІЧНІЙ психологи, невропатології та інших галузях медицини Відомо, ЩО умовна реакція активного уникнення тварини є одним з показників, що використовується при експериментальному дослідженні структури та механізму функціонування процесів навчання та пам'яті, розкриття яких має істотне значення для розвитку сучасної медицини [1,2,3,4,5] Формування енграм пам'яті у процесі навчання тварин, вірогідно, призводить до утворення нових синаптичних зв'язків між структурами головного мозку, що беруть участь в реалізації поведшкового акту Значну роль в процесах консолідації, збереження та відтворення енграм пам'яті виконують клітини астроцитарної глм [6,7] До складу протеїнового цитоскелету, що обумовлює форму, обсяг клітин і стан їхньої поверхневої мембрани, входить глікопротеш, наприклад гліальний кислий фібрилярний білок (ГФКБ) проміжних філаментів астроцитів [8,9,10,11,12] Встановлена істотна роль (ГФКБ) в нейрон - гліальних взаємодіях [13], який необхідний для засвоєння рухових навичок [14] і змінює свої показники в крові при хворобі Альцгеймера [15] Разом із тим, рівень техніки, що встановлений заявником, інформує про те, що ГФКБ, як контролюємий КІЛЬКІСНИЙ параметр, у способах структур (57, Спосіб структурно-функціональної оцінки формування умовної реакції активного уникнення тварини, що містить утворення умовної реакції тварини та наступну реєстрацію оціночних критеріїв, який відрізняється тим, що у фронтальній зоні кори головного мозку та його підкіркових структурах реєструють КІЛЬКІСТЬ виділення гліального фібрилярного кислого білка, як оціночного критерію, шляхом твердофазного імуноферментного визначення но-функціональної оцінки формування умовної реакції активного уникнення тварини не використовувався Найбільш приближении по КІЛЬКОСТІ ІСТОТНИХ ознак до об'єкта, що заявляється є спосіб структурно-функціональної оцінки формування умовної реакції активного уникнення тварини, що містить утворення умовної реакції тварини та наступну реєстрацію оціночних критеріїв, наприклад, окремих елементів поведінки шляхом їх хронометражу та візуалізацм [16] Але, візуалізація складових поведінки позбавляє спосіб КІЛЬКІСНИХ характеристик, а хронометраж має суб'єктивний характер, що знижує вірогідність оцінки реакції активного уникнення До основи вдосконалення відомого способу структурно-функціональної оцінки формування умовної реакції активного уникнення тварини поставлена задача підвищити вірогідність оціночного критерію шляхом визначення КІЛЬКОСТІ глікопротеїну у структурах головного мозку при використанні Означений технічний результат досягається тим, що у відомому способі структурнофункціональної оцінки формування умовної реакції активного уникнення тварини, що містить утворення умовної реакції тварини та наступну реєстрацію оціночних критеріїв, особливість полягає в тому, що у фронтальній зоні кори головного мозку та його підкоркових структурах реєструють КІЛЬКІСТЬ виділення гліального фібрилярного кислого білку, як оціночного критерію, шляхом твердофазного імуноферментного визначення о о Заявником встановлено, що причиною підвищення технічного результату є наявність взаємозв'язку між формуванням умовної реакції тварини та участю ГФКБ в утворенні структурних елементів цитоскелету астроглм головного мозку після початку навчання, або зміною КІЛЬКОСТІ генеруємого глікопротешу до ВІДПОВІДНИХ умовних реакцій тварини Кількісне визначення вмісту ГФКБ після вироблення умовної нолу, 0,2 мМ PMSF, 0,02% NaNO3, 2%ТрилонуХ-100 Після КОЖНОГО З 3-Х досліджуваних інтервалів виявляють КІЛЬКІСНИЙ вміст глікопротешу в тканинах структур головного мозку, здійснюючи виміри з точністю до 1,000 ± 0,001 мкг/мг При ОЦІНЦІ даних дослідження порівнюють КІЛЬКІСТЬ означеного глікопротешу, виявлену у контрольних та навчених тварин Для перевірки рішення задачі та підтвердження досягнення технічного результату, що заявляються, нами було проведено експеримент (див Табл 1) На 3-х групах експериментальних тварин за відомою методикою [16] вироблялася умовна реакція активного уникнення тварини Через 2, 24 і 72 години після початку навчання у тварин визначали динаміку змін концентрації глікопротешу у фронтальній корі головного мозку та підкоркових структурах Експресію ГФКБ на різних етапах формування умовної реакції активного уникнення (УРАУ) тварин, порівнювали з величиною досліджуваного показника у контрольній групі Наведені результати показали, що вже через 2 години після початку навчання тварин, КІЛЬКІСТЬ глікопротешу у корі головного мозку та деяких підкоркових структурах (медіальному таламусі та Варолійовому мості) збільшилася у 1,5 рази Через добу КІЛЬКІСТЬ глікопротешу у означених структурах мозку досягла максимального значення При подальшому навчанні тварин вміст ГФКБ у фронтальній корі головного мозку, таламусі та Варолійовому мості знизився до рівня контролю, в той час як в дорзальному пппокампі його експресія почала збільшуватись Така ПОСЛІДОВНІСТЬ ЗМІНИ вмісту ГФКБ свідчить, що початкову стадію процесу формування УРАУ підтримує, переважно підвищення активності кори головного мозку, медіального таламусу та Варолійового моста, а у подальшому - структур пппокампу 44400 (в контрольній та навченій групах) Крім того, для здійснення діагностики потрібні спектрофотометр для мікропланшетівта центрифуга VAC 25 Спосіб структурно-функціональної оцінки умовної реакції активного уникнення тварини здійснюється наступним чином За відомою методикою [16] виробляють умовну реакцію активного уникнення тварини, а через 2, 24 і 72 години, після початку навчання, враховують характер поведінки та визначають динаміку змін вмісту гліко-протешу у фронтальній зоні кори головного мозку та в підкоркових структурах (смугастому ТІЛІ, ядрах медіального таламусу, Варолійовому мості та пппокампі) Кількісне визначення вмісту ГФКБ у згаданих структурах головного мозку знаходять шляхом твердофазного імуноферментного аналізу з використанням спектрофотометра для мікропланшет у мембранних фракціях виділених структур головного мозку, які одержуються за допомогою ультрацентрифуги VAC 25 Мембранна фракція виготовляється на буферному розчині, який містить 0,25мМ Трис-НСІ, ІмМ ЕДТА, 2мМ р-меркаптоетаструктурах головного мозку тварини свідчить про динаміку структурного забезпечення процесів формування енграм умовнорефлекторної реакції активного уникнення та дає змогу оцінити значення умов, які сприяють утворенню нових нервових зв'язків на початкових етапах мнестичних процесів Отже, виявлена закономірність змін концентрації ГФКБ в різних реакції тварини, дає можливість оцінити ступінь та тривалість участі окремих утворень головного мозку в процесі формування умовно-рефлекторної реакції Таким чином, реєструючи чисельні зміни експреси глікопротешу, заявник забезпечує підвищення вірогідності оціночного критерію умовної реакції активного уникнення тварини ВІДОМОСТІ, ЯКІ підтверджують можливість здійснення об'єкту, що заявляється, полягають у наступному В Y-подібному лабіринті з електрифікованою підлогою під час формування енграм умовнорефлекторної реакції уникнення, для КІЛЬКІСНОГО визначення вмісту ГФКБ використовує білих щурівсамців лінії Вістар, як експериментальних тварин Джерела інформації 1 Herrenstem, R J Method and theory in the study of avoidance Psychol Rev , 1969, p 49 -69 2 Brush, F R , Aversive Conditioning and Learning Academic Press, New York, 1971 3 Dickinson, A Contemporary Animal Learning Theory Cambridge University Press, Cambridge, 1980 4 D'Amato, M R Experimental Psychology Methodology, Psychophysics and Learning McGrawHill, New York, 1970 5 Rachlm, H Behavior and Learning Freeman, San Francisco CA, 1976 6 Ройтбак А И Нейроглия и образование новых нервных связей в коре мозга - В кн Механизмы формирования и торможения условных рефлексов М Наука, 1973, с 82-94 7 Ройтбак А И Физиология нейроглии - В кн Руководство по физиологии Общая физиология нервной системы Л Наука, 1979, с 607-702 S Mitchison Т J Evolution of a dynamic cytoskeleton Phil Trans of the Royal Soc of LondonSeries В Biological Sci - 1995- V 349 - p 299 304 9 Fuchs E, Weber К Intermediate filament structure, dynamics, function and disease // Ann Rev Biochem -1994 -V 63 - p 345 - 382 10 Lendahl U 5 Zimmerman L В , McKay R D G CNS stem cells express a new class of mterme-diate filament protein // Cell -1990 - V 60 - p 585 - 595 11 Osborn M , Weber К Intermediate filament proteins a multiple family distinguishing mayor celllineages // Trends Biochem Sci 1986 - V 11 p 469 - 471 12 Eng L F GFAP the mayor protein of ghal intermediate filaments in differentiated astrocytes 44400 //J Neuroimmunol -1985 -V 8 - p 203-214 ІЗМсСаІІ M A , Gregg R G , Behnnger RR et al Targeted deletion in astrocyte intermediate fi-laments (GFAP) alters neuronal physiology // Proc Natl Acad Sci USA -1996 -V 93p 6361-6366 14 Shibuki K, Gomi H, Chen L, Bao S , Kirn J , Wakatsuki H , Fujisaki H , Fujimoto К etal Deficient cerebellar longterm depression, impaired eyeblmk conditioning, and normal motor coordination in GFAP mutant mice //Neuron - 1966 V 16,-p 578-599 15 Styren S D , Kamboh ML , DeKosky S T Expression of differential immune factors in temporal cortex and cerebellum the role of alphalantichymotrypsm, apohpoprotem E, and reactive gha in the progression of Alzheimer"s disease//J Сотр Neurol -1998 - V 1 3 -p 511 -520 16 Бурені Я , Бурешова О и Хьюстон П Дж Методики и основные эксперименты по изучению мозга и поведения «Высшая школа», Москва, 1991, стр 175-209 Таблиця 1 Експериментальні дані про мікроструктурну оцінку формування енграм умовнорефлекторної пам'яті за вмістом ГФКБ в структурах головного мозку щурів ( в м г/г тканини) Фронтальна коСмугасте тіло Медіальний таВаролмв міст ра ламус Контроль 7,167±0,341 28,600±0,972 29,504± 1,660 90,249±4,920 через 2г 9,100±0,604* 32,518±4,405 6,798±1,897* 3111,045±4,338* через 24г 33,964±5,299 38,314±3,054* 165,364± 10,273* 16,853±1,551* через 72г 7,Ю7±0,301 29,459±1,414 28,595±1,245 94,322± 5,307 - показник вірогідно відрізняється від контролю ДП «Український інститут промислової власності» (Укрпатент) вул Сім'ї Хохлових, 15, м Київ, 04119, Україна (044) 456 - 20 - 90 Гіппокамп 22,796± 1,624 21,460±2,553 30,418±3,851 30,905*0,803 *