Спосіб морфологічної оцінки впливу небілкових азотистих речовин на організм тварини

Изобретение относится к области определения влияния небелковых азотистых веществ на живой организм и может быть использовано в животноводстве, ветеринарии, медицине. Известен способ гистологического исследования печени (1), с помощью которого изучают влияние веществ, например, стимуляторов роста на морфофункциональное состояние печени. Однако в связи с длительностью обработки материала и сложностью оценки влияния этих веществ на морфологию печени гистологические методы редко используются. Наиболее близким к заявляемому объекту является способ оценки состояния ткани живого организма, по которому можно судить об изменениях, вызванных влиянием, например, небелковых азотистых веществ, вносимых в рацион животного (2). Способ заключается в фиксации образца ткани в формалине, обезвоживании в этиловом спирте и обработке в реактивах: в частности в смеси ацетона, скипидара живичного, живицы кедровой или сосновой. Полученные образцы инкубируют в шести порциях парафина, после чего производят резание блоков. Полученный препарат получается тоньше, ткань меньше деформируется, общая продолжительность приготовления образцов до микроскопирования составляет 18-28 часов. Микроскопирование ткани, полученной по описанному способу, не дает возможности получить достоверный ответ о влиянии небелковых азотистых веществ на организм животного. Кроме того, способ длителен и трудоемок. Задачей настоящего изобретения является усовершенствование способа морфологической оценки влияния небелковых азотистых веществ на организм· животного посредством сочетания предложенных операций, чем достигается высокая достоверность и сокращается время осуществления способа. Поставленная задача решается тем, что в способе морфологической оценки влияния небелковых азотистых веществ на организм животного, включающем фиксацию образца ткани животного в формалине, обезвоживание его спиртом, промывку, обработку реактивами и микроскопическое определение состояния образа ткани, согласно изобретению, в качестве образца ткани животного исследуют ткань печени, причем фиксацию производят в 5% формалине в течение 30 мин., а обработку осуществляют гематоксином— эозином, после чего полученный образец осветляют, заключают в оптическую среду и под микроскопом определяют содержание больших и пикнотических ядер, а при наличии менее 50% больших ядер и более 35% пикнотических ядер судят о гепатотропном влиянии азотистых веществ на организм животного. Авторы определили, что использование морфометрического анализа генома печени при изучении влияния стимуляторов роста (небелковых азотистых веществ) в животноводстве является наиболее информативным. В совокупности заявляемых признаков "выбор формалина 5% концентрации определяется тем, что при более низкой концентрации минимально повреждается ткань, а при концентрации выше 5% подключается деструктирующее влияние на клетки печени. Время фиксации в 5% формалине β течение 30 минут является оптимальным и зависящим от выбранной концентрации формалина. Все остальные операции вплоть до мик-роскопирования определены тем, что они в совокупности с рассмотренными признаками позволяют получить мазок клеток печени, несущий наиболее достоверную информацию об изменениях, происшедших в клетках исследуемой ткани. Авторами опытным путем было найдено и подтверждено, что по состоянию исследуемой ткани (ткани печени), а именно: по наличию определенного соотношения больших и пикнотических ядер, можно судить об изменениях, происшедших в клетках под воздействием поступающих в организм азотистых небелковых веществ. Таким соотношением является наличие менее 50% больших ядер и более 35% пикнотических ядер. Существенным отличием предлагаемого способа является: 1. Изготовление мазка из клеток печени. 2. Исключение процесса заливки в плотные среды (парафин, целлоидин). 3. Использование метода кариометрии. 4. Прием дифференцировки и раскладки ядер гепатоцитов на три группы. Конкретно способ осуществляется следующим образом: у животного производят забор маленького кусочка печени, из которого срезают клетки печени и в виде тонкого мазка растягивают на предметном стекле, фиксируют в 5% нейтральном формалине в течение 30 минут, промывают проточной водой, окрашивают гематоксином-эозином, промывают проточной водой, обезвоживают в спиртах 40-60-80-96°, просветляют ксилолом, заключают в полистирол, микроско-пируют при увеличении микроскопа об. 90, ок.10, с помощью микрометра определяют диаметры всех ядер и с помощью номограммы для определения объема ядер и клеток вычисляли их объем, определяли процент гепатоцитов с крупными, средними и пикно-тическими ядрами. Всего предложенным способом изучен гепатотропный эффект влияния небелковых азотистых веществ на 40 бычках. Все животные по характеру исследуемого вещества были разделены на 4 группы (табл.1). Результаты исследования представлены в табл.2. Как видно из табл. 2 использование углеаммонийных солей (II, III, IV группы) приводит к достоверному увеличению количества пикнотических ядер в печени, что свидетельствует о их гепатотропном эффекте. Примеры конкретного выполнения. Пример 1.В корм животного добавляли мочевину. Бычок № 347 (гр.1). При забое бычка взяли печень, срезали с правой доли печени на глубине 10 см кусок органа толщиной 2 см, длиной 4 см. Затем полученный кусок печени положили на фильтровальную бумагу и через 1-2 минуты после того как стекла кровь острым ножом легко сняли первый слой клеток, вытерли нож и еще раз с этой не поверхности сняли слой клеток, после чего его разместили на предметном стекле в виде тонкого мазка. Мазок сразу же поместили в 5-ти % раствор формалина на 30 минут. После чего его промыли в 3-4 порциях проточной воды на протяжении 5 минут, выдержали в гемотоксилине 2 минуты, промыли в проточной воде 3 минуты и выдержали в этиловом спирте, подкисленном HCI. После этого выдержали образец для окрашивания в 1%-ному растворе эозина в течении 1 минуты, промыли в спирте 1 минуту, просветлили в ксилоле 3 минуты. Полученный образец исследовали под микроскопом, измерили диаметр ядер при сплошной выборке. При этом было определено: - больших ядер с четкими ядрышками и небольшим количеством хроматина (диаметр 6 мкм) 54,1%; - ядер средних с четкими ядрышками и небольшим количеством хроматина (диаметр меньше 6 мкм) 15,0%; - ядер пикнотических (мелкие, темные) с большим скоплением гетерохроматина незначительным количеством эухроматина, 30,5%. Если количество больших ядер составляет больше 50%, а пикнотических ядер -меньше 35% - это свидетельствует об отсутствии гепатотропного влияния мочевины. Пример 2. Бычок № 215. В корм животного добавляли углеаммонийные соли. Все операции проводили, как в примере 1. При исследовании полученных препаратов обнаружили, что имеется 25,3% больших ядер, 16,4%-средних и 41,7% -пикнотических. Таким образом, полученные данные свидетельствуют о том, что добавка углеаммонийных солей в корм животного достаточно резко влияет на печень бычка. Преимущества предложенного способа по сравнению с прототипом состоят в следующем (табл.3): 1. В сокращении времени исследования, поскольку только получение гистологического препарата сокращается до 3 часов. 2. Повышение доступности морфологического метода в оценке влияния веществ на печень животных. 3. Удешевлении исследования. 4. Уменьшении затрат труда и рабочего времени. Ожидаемый положительный эффект состоит в более оперативном и точном отборе веществе целью дальнейшего исследования в качестве стимуляторов роста животных. Потребность данного изобретения определяется острой необходимостью использования стимуляторов роста животных в сельскохозяйственной практике.