Спосіб оцінки функціональної резистентності організму людини

Спосіб оцінки функціональної резистентності організму людини шляхом визначення реактивних змін у нейтрофільних лейкоцитах крові, який відрізняється тим, що досліджується функціональний стан лізосомального апарату циркулюючих нейтрофільних лейкоцитів із застосуванням моди 31257 гою модифікованої цитофлуоресцентної індикації неферментних катіонних белків (дефенсинів) у первинних лізосомах за умов використання забуференого розчину примуліну, який містить диметилсульфоксид, та подальшим кількісним цитофлуоресцентним аналізом препаратів. Це досягається шляхом застосування в оригінальній технологічній модифікації цитологічного люмінесцентного барвника - примуліну (ДY-59), який використовується для також топографічного вивчення певних нейроних систем за методом ретроградного аксоного транспорту [4, 5] та ідентифікації цитоплазматичних катіонних білків у лейкоцитах [6]. Внаслідок застосування пропонуємого методу з'являється можливість одержати більш дискретну локалізацію низькомолекулярних неферментних катіонних белків (дифенсинів) у первинних лізосомах нейтрофільних лейкоцитів та значно більш інтенсивну флуоресценцію дефенсинів на фоні нефлуорохромованої цитоплазми. Спосіб здійснюється таким чином. У пацієнта з пальця беруть кров у кількості, яка необхідна для виготовлення 3-4 мазків загальноприйнятим методом на стандартних предметних склах. Висушені на повітрі за кімнатної температури мазки фіксують зануренням у 5% розчин сульфосаліцилової кислоти впродовж 60 сек. Фіксовані мазки крові ретельно промивають у трьох змінах дистильованої води на протязі 2 хв у кожній зміні. Зафіксовані, промиті та висушені мазки флуорохромують у темряві за температурою 22-24 С. Це відбувається зануренням їх у 0,05% розчин примуліну оранжевого (Primuline О,Reichert) в 0,05 М трис-НСІ буфері (рН 8,2), що містить 2% диметилсульфоксиду. Флуорохромовані препарати промивають у трьох змінах 0,05 М трис-НСІ буфері (рН 8,2) і висушують на повітрі за кімнатної температури. Підготовлені (флуорохромовані) препарати клітин крові (лейкоцитів) вивчають з використанням імерсійної системи люмінесцентного мікроскопу при довжині хвилі збуджуючого світла 340-460 нм (збуджуючі світлофільтри ФС-1-2,4 або СС-15-2 та запираючі світлофільтри ЖС-3 та БС-8), продовж 15-20 хв, що необхідно для візуалізації, фотодокументації або кількісного цитофлуоресцентного аналізу. Кількосна наявність дифенсинів обраховується у відносних одиницях інтенсивності збудженої флуоресценції - phosphor partid unit (PPU). Внаслідок флуорохромування препаратів крові за наведеним методом первинні лізосоми, що містять дифенсини, виявляються у цитоплазмі нейтрофільних лейкоцитів у вигляді характерних дискретних округлих утворень з інтенсивною золотисто-жовтою, з трішки зеленоватим відтінком, флуоресценцією. Даний метод флуорохромування дозволяє підвищити відношення рівня специфічної флуоресценції низькомолекулярних неферментних катіонних белків (дифенсинів) до флуоресценції фона та одержати значно більшу інтенсивність флуоресценції дифенсинів у первинних лізосомах нейтрофільних лейкоцитів у порівнянні з пропонуємим раніше методом [6]. Результати флуорохромування лізосомальних низькомолекулярних неферментних катіонних бел ків (дифенсинів) у нейтрофільних лейкоцитах крові здорових людей та деяких лабораторних тварин пропонуємим методом та відомим раніше наведені у табл. 2, 3. Дані табл. 2 показують, результати проведених пралельних серійних досліджень у здорових людей, які знаходяться у звичайних фізіологічно однакових умовах, по ідентифікації у циркулюючих нейтрофільних лейкоцитах лізосомальних низькомолекулярних неферментних катіонних белків (дифенсинів) відомим методом - методом порівняння [6] та пропонуємим методом - із застосуванням такого ж самого цитофлуоресцентного барвника примуліну. У пропонуємому варіанті має місце значно більш інтенсивна вторинна збуджена люмінесценція дифенсинів, яка об'єктивізується результатами кількісної цитофлуорометрії та виражена у відносних одиницях інтенсивності флуоресценції - PPU [7]. Аналогічні результати були одержані при дослідженні, вказаними вище двома методами дефенсинів у нейтрофільних лейкоцитах крові тварин (табл. 3). Отже дані табл. 2 і 3 підтверджують більш високий рівень чутливості пропонуємого методу флуоресцентної ідентифікації лізосомальних низькомолекулярних неферментних катіонних белків (дифенсинів) у нейтрофільних лейкоцитів крові людини та деяких лабораторних тварин. Результати, що були отримані із застосуванням пропонуємого методу у динамічних фізіологічних дослідженнях та прикладних медичних спостереженнях, наведені у табл. 4 та 5 відповідно. Ці дані свідчать про репрезентативні можливості пропонуємого методу для об'єктивізації змін адаптаційних реакцій як організму людини за виробничих умов, так і організму лабораторних тварин при експериментальних дослідженнях, що дозволяє використовувати пропонуємий метод для об'єктивної оцінки функціональної резистентості цілісного організму. Джерела інформації 1. Маянский А.Н., Маянский Д.Н. Очерки о нейтрофиле и макрофаге. - Новосибирск: Наука, 1983. – 256 с. 2. Whelan CJ. Is granulocyte or endothelial cell activator responsibl for the initiation of granulocyte recruitment during acute inflamation [Rewiew] // Agents & Action, 1992, v. 37, № 3-4, p. 319-324. 3. Новиков В.С., Бортковский В.Н. А.с. SU 1377735 A1. 4. Майский В.А., Кузовкова С.Д., Дорошенко Н.3. А.с. SU 1318839 A1. 5. Майский В.А., Пигарев И.Н., Дорошенко Н.3. Сочетание методов флюоресценции катехоламинов и ретроградного мечения нейронов при быстрой заливке ткани мозга в парафин // Физиол. журн. - 1988. - Т. 34. - № 2. - С. 103-106. 6. Венглинская Е.А., Рукавцов Б.И., Шубич М.Г. Флюоресцентно-цитохимическое выявление свободного цитоплазматического катионного белка в лейкоцитах крови // Лаб. дело. – 1976. № 5. - С. 270-273. 7. West S.S., Golden J.F. Phosphor particlts as microscope fluorescence standards // J. Histochem. and Cytochem., 1976, v. 24, № 4, p. 609-610. 2 31257 Таблиця 1 Порівняння відмінних ознак пропонуємого способу та прототипу Прототип 1. Проводять дослідження лейкоцитів крові людини 2. Інкубують у термостаті досліджувану кров разом з стандартною суспензією мікробних тіл 3. Через певний час готують мазки з інкубаційної суміші, які фіксують і фарбують азуроеозиновою сумішшю Пропонуємий спосіб 1. Проводять дослідження лейкоцитів крові людини 4. Готують препарати шляхом фіксації тонких мазків крові у розчині сульфосаліцилової кислоти 5. Проводять індентіфікацію неферментних катіонних белків (дифенсинів) у лізосомах нейтрофілів шляхом флуорохромування препаратів крові забуференим розчином примуліну та диметилсульфоксиду 6. За допомогою світлового мікроскопу визначають фагоцитарну активність лейкоцитів 9. Проводять оцінку стану адаптації організму 7. На препаратах крові, які були флуорохромовані, промиті і висушені, методом цитофлуорометрії у нейтрофілах вивчають лізосомальні дифенсини 8. За кількісною характеристикою вмісту в лізосомах нейтрофільтних лейкоцитів дифенсинів прогнозується можливість імовірних порушень неспецифічної резистентності організму 9.Проводять оцінку формування груп підвищеного ризику за субклінічними критеріями змін резистентності організму Таблиця 2 Порівняльна кількісна характеристика чутливості цито флуоресцентних методів Група обстеження Здорові люди (n-25) Кількість дифенсинів у первинних лізосомах нейтрофільних лейкоцитів крові (М±m) Метод порівняння (в од. РРU) Пропонуємий метод (в од. РРU) 26,1±0,87 44,3±0,91* Таблиця 3 Порівняльна кількісна характеристика чутливості цито флуоресцентних методів Група обстеження Кролі (інтактні) n-25 Кількість дифенсинів у первинних лізосомах нейтрофільних лейкоцитів крові кролів (М±m) Метод порівняння (в од. РРU) Пропонуємий метод (в од. РРU) 11,9±0,71 21,4±0,83* Примітка: * - вірогідні зміни показників у порівнянні з даними "методу порівняння" Таблиця 4 Зміни вмісту лізосомальних низькомолекулярних неферментних катіонних белків (дифенсинів) у циркулюючи х нейтрофільних лейкоцитах крові кролів, які впродовж однієї години перебували в умовах зниженого арометричного тиску (експериментальна вентильована барокамера) (304 мм рт.ст. - 404 гПа) Група обстеження Кролі (n-25) Кількість дифенсинів у первинних лізосомах нейтрофільних лейкоцитів, що були ідентифіковані пропонуємим методом (М±m) На 2-3 добу після впливу зниженого До впливу (контроль) (в од. РРU) барометричного тиску (в од. PPU) 21,4±0,83 11,3±0,75* 3 31257 Таблиця 5 Зміни вмісту лізосомальних низькомолекулярних неферментних катіонних белків (дифенсинів) у циркулюючи х нейтрофільних лейкоцитах льотного складу після повернення з польотів Група обстеження Льотний склад (n-25) Кількість дифенсинів у первинних лізосомах нейтрофільних лейкоцитів, що були ідентифіковані пропонуємим методом (М±m) Після повернення з польотів До польотів (контроль) (в од. РРU) (в од. РРU) 44,3±0,91 30,1±0,87* Примітка: * - вірогідні зміни показників у порівнянні з контролем. __________________________________________________________ ДП "Український інститут промислової власності" (Укрпатент) Україна, 01133, Київ-133, бульв. Лесі Українки, 26 (044) 295-81-42, 295-61-97 __________________________________________________________ Підписано до друку ________ 2002 р. Формат 60х84 1/8. Обсяг ______ обл.-вид. арк. Тираж 50 прим. Зам._______ ____________________________________________________________ УкрІНТЕІ, 03680, Київ-39 МСП, вул. Горького, 180. (044) 268-25-22 ___________________________________________________________ 4